扶正化瘀方对大鼠肝星状细胞旁分泌活化途径的抑制作用

肝星状细胞 (ＨＳＣ)活化是一复杂过程 ,涉及到细胞 细胞、间质 细胞间相互作用 ,其中旁分泌活化途径是ＨＳＣ活化启动的关键因素 ,库普弗细胞 (ＫＣ)是活化这一途径的主要细胞之一。我们观察中药扶正化瘀方 (319方 )对ＫＣ激活ＨＳＣ这一旁分泌活化途径的干预。材料与方法一、材料雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠 ,ＳＰＦ级。体重 2 0 0～ 30 0ｇ ,分离ＫＣ用 ;体重 30 0～ 40 0 ｇ ,制备药物血清用 ;体重 40 0～ 45 0ｇ ,分离ＨＳＣ用 ,均由上海中医药大学动物中心提供。链霉蛋白酶Ｅ、Ⅳ型胶原酶、Ｎｙｃｏｄｅｎｚ及鼠尾Ⅰ型胶原标准品 ,均为Ｓｉ…     

扶正化瘀方对大鼠肝星状细胞,肝细胞,成纤维细胞胶原合成？…

以１０％的扶正化瘀方药物血清作用大鼠传代与纤维肝星状细胞，正常与纤维肝肝细胞、皮肤成纤维细胞，通过「＾３Ｈ－」－Ｐｒｏｐｌｉｎｅ掺入，观察药物血清对各组细胞胶原合成的影响，探讨扶正化瘀方抗肝纤维化的作用机制。结果发现，药物血清组纤维肝星状细胞与肝细胞细胞内胶原合成与细胞外胶原分泌均明显少于对照组；正常传代星状细胞与肝细胞细胞外胶原分泌也明显减少；成纤维细胞胶原的合成与分泌，以及正常传代星状细胞细胞     

扶正化瘀胶囊对肝星状细胞激活的干预

目的：观察扶正化瘀胶囊(319方)对肝星状细胞(HSC)激活的抑制作用。方法：①制备319方含药血清，温育原代HSC，并以正常血清为对照，观察HSC的增殖与I型胶原分泌。②用含药血清分别添加于损伤肝枯否细胞与传代HSC中培养，制备含药血清作用过的损伤肝枯否细胞条件培养液与传代HSC条件培养液，并以添加正常血清的条件培养液作为对照，温育HSC，观察HSC的增殖与I型胶原分泌。③测定枯否细胞条件培养液中转化生长因子-β(TGF-β)、血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮生长因子(VEGF)及传代HSC条件培养液中VEGF。结果：①含药血清能明显抑制原代HSC的增殖与I型胶原分泌。②损伤肝枯否细胞与传代HSC可明显促进原代HSC的增殖与I型胶原分泌。含药血清可抑制这一促进作用。③损伤肝枯否细胞FGF-β、PDGF、VEGF与传代HSC中VEGF分泌明显增加，含药血清可抑制损伤枯否氏细胞TGF-β、PDGF及传代HSC中VEGF的分泌。结论：319方不仅可直接抑制HSC的增殖与I型胶原的分泌，并可抑制TGF-β1、PDGF、VEGF等细胞因子，抑制HSC激活的旁分泌与自分泌途径，这一作用可能是该药抗肝纤维化的机制之一。     

扶正化瘀方对肝纤维化模型大鼠肝组织纤维化及肝星状细胞的影响

目的 评价扶正化瘀方对肝纤维化模型大鼠肝组织纤维化及活化肝星状细胞(HSC)的影响. 方法 64只雄性SD大鼠随机分为正常对照组、四氯化碳(CCl4)肝纤维化模型组、药物干预低剂量组和药物干预高剂量组.除正常组外,所有大鼠用CCl4复合法制备大鼠肝纤维化模型；在造模同时,药物干预组给予扶正化瘀方灌胃,1次/d,6次/周,共6周(低剂量组按0.75g/kg,高剂量组1.5 g/kg);分别在实验的第2、4、6周处死正常组、模型组及药物干预低、高剂量组大鼠各4只,收集大鼠血清及肝组织标本,测定大鼠血清ALT、AST、总胆红素(TBil);组织标本常规石蜡包埋、切片、HE染色及Masson三重染色,采用计算机图像分析测定大鼠肝组织纤维化面积比例；测定α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的积分吸光度值.组间数据比较用完全随机设计的单因素方差分析.结果 2周末正常对照组、模型对照组、药物干预低、高剂量组ALT分别为(24.68±1.50) U/L、(85.33±5.68)U/L、(56.49±4.85) U/L、(36.94±5.23)U/L,4组比较,F值为98.11,差异有统计学意义；4组的AST值分别为(37.69±3.35)U/L、(112.34±7.02) U/L、(82.89±5.32) U/L、(61.39±6.06)U/L,4组比较,F值为96.31,差异有统计学意义；4组的TBil值分别为(6.70±1.10) U/L、(14.12±0.68) U/L、(10.85±0.64) U/L、(7.78±0.69) U/L,4组比较,F值为51.67,差异有统计学意义.4周末4组ALT、AST、TBil比较,F值分别为111.24、72.11、101.20,P值均＜0.05,差异均有统计学意义；6周末4组ALT、AST、TBil比较,F值分别为154.16、190.80、158.91,P值均＜0.05,差异均有统计学意义.与正常组比较,2、4、6周末模型组、扶正化瘀高、低剂量各组ALT、AST、TBil的水平均有不同程度的升高；与模型组比较,药物干预各组ALT、AST、TBil数值均有不同程度下降,其中以扶正化瘀方高剂量组改善最为显著.与正常组比较,模型组、药物干预低、高剂量组肝组织纤维化面积比例明显升高,2周末正常组、模型组、药物干预低、高剂量组肝组织纤维化面积比例分别为5.23％±0.10％、11.93％±1.78％、9.33％±1.09％、8.26％±0.77％,4组比较,F=18.68,P＜0.01；4周末、6周末正常组、模型组、药物干预低、高剂量组肝组织纤维化面积比较,F值分别为49.95、82.44,P值均＜0.01,差异均有统计学意义.随着造模时间的延长,α-SMA表达亦较正常对照组均有升高,药物干预低、高剂量组大鼠肝组织α-SMA的表达与正常组和模型组比较,均明显下调,且药物干预高剂量组α-SMA表达下调显著.结论 扶正化瘀方具有抗肝纤维化的作用,且可减少α-SMA的表达,其抗肝纤维化机制可能是通过促进活化HSC的凋亡,减少活化HSC的数量.     

扶正化瘀方对大鼠肝星状细胞、肝细胞、成纤维细胞胶原合成的影响

以10％的扶正化瘀方药物血清作用于大鼠正常传代与纤维肝星状细胞、正常与纤维肝肝细胞、皮肤成纤维细胞，通过[3H-]－Propline掺入，观察药物血清对各组细胞胶原合成的影响，探讨扶正化瘀方抗肝纤维化的作用机制。结果发现，药物血清组纤维肝星状细胞与肝细胞细胞内胶原合成与细胞外胶原分泌均明显少于对照组；正常传代星状细胞与肝细胞细胞外胶原分泌也明显减少；成纤维细胞胶原的合成与分泌、以及正常传代星状细胞细胞内胶原合成也有抑制趋势。提示扶正化瘀方抗肝纤维化作用机制，可能主要是抑制了肝脏内胶原的合成。     

拆方扶正化瘀方对肝细胞及肝星状细胞功能的影响

目的　探讨扶正化瘀方防治慢性肝病的作用机制及药效学配伍意义．方法　将扶正化瘀方分为扶正组、化瘀组、虫草组、丹参组及丹参加虫草组，灌胃给药分离药物血清，温育传一代大鼠肝星状细胞和原代肝细胞． 半定量ＲＴＰＣＲ 法检测Ⅰ型胶原ｍ ＲＮＡ表达，ＥＬＩＳＡ 法检测Ⅰ型胶原和清蛋白分泌，３ ＨＴｄＲ 和３ Ｈ脯氨酸掺入分别观察细胞增殖和活力．结果　各组药物均可抑制星状细胞的增殖，其中化瘀药效果最明显；各组药物均可抑制星状细胞Ⅰ型胶原ｍ ＲＮＡ 和蛋白的生成，以扶正组效果最佳；全方明显促进肝细胞和肝星状细胞蛋白质生成，而各拆方组均无此作用．结论　扶正与化瘀两法配伍组成扶正化瘀方在防治慢性肝病方面具有整体优势．     

扶正化瘀方对肝星状细胞分泌血管内皮生长因子的干预

目的 探讨扶正化瘀方对肝星状细胞（HSC）分泌血管内皮生长因子（VEGF）的干预以及对自分泌激活途径的影响。方法 大鼠灌以扶正化瘀方,制备含药血清;用含药血清添加法观察扶正化瘀方对活化HSC分泌VEGF的影响;以含药血清活化HSC条件培养液温育原代HSC,观察药物对HSC增殖与I型胶原分泌的作用。结果 扶正化瘀方对活化的HSC分泌VEGF的增加有抑制作用;活化的HSC可明显促进静止HSC的增殖与I型胶原的分泌;扶正化瘀方可明显抑制这一促进作用。结论 扶正化瘀方对HSC的自分泌激活途径有抑制作用,抑制活化的HSC分泌VEGF可能是其作用机制之一。     

扶正化瘀方对大鼠肝贮脂细胞增殖的影响

采用灌胃给药、分离血清体外作用培养细胞的血清药物学方法，探讨扶正化瘀方对大鼠贮脂功能的影响。结果表明：该血清无明显细胞毒性，能抑制细胞增殖，其作用与体内给药剂量、药物血清浓度等有一定关系；该实验方法较为稳定可靠；扶正化瘀药物血清对贮脂细胞的增殖有抑制作用，可能是该方肝纤维化的作用机制之一。     

扶正化瘀方对大鼠CCl4损伤肝Kupffer细胞功能的影响

目的：探讨扶正化瘀方对大鼠急性ＣＣｌ４损伤肝Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞功能的影响。方法：体外分离培养大鼠急性ＣＣｌ４损伤肝Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞,制备扶正化瘀方药物血清对其进行干预,观察药物对其ＰＤＧＦ和ＴＧＦβ活性以及对Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞线粒体呼吸功能的影响。结果：药物组ＰＤＧＦ和ＴＧＦβ活性均显著降低（Ｐ〈０．０５）;药物组闰体呼吸功能明显降低（Ｐ〈０．０５）。结论：扶正化瘀方对大鼠急性ＣＣｌ４损伤肝Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞活化有抑制作用,可能抑制肝星状细胞旁分泌激活,是该方抗肝纤维化的作用机理之一。     

影响肝星状细胞活化的因素

肝纤维化是指各种致病因素所致的肝脏内纤维结缔组织增生，其特点是大量细胞外基质(extracellular matrix，ECM)在窦周间隙沉积。而肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSC)是肝纤维化细胞外基质的丰要来源细胞，在肝纤维化的形成中起关键作用，HSC活化已成为肝纤维化基础研究的热点。     

抗纤方对肝星状细胞活化增殖、凋亡和基质金属蛋白酶-1及其抑制剂表达的影响

目的:观察抗纤方抗肝纤维化的药效学作用。方法:分离培养大鼠HSC,制备抗纤方大鼠药物血清,温育HSC。MTT比色法测定细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡。原位杂交法观察MMP-1、TIMP-1的表达。结果:抗纤方可抑制体外培养的HSC增殖,经抗纤方作用后,HSC的凋亡明显增多,并促进MMP-1表达。抑制TIMP-1的表达。结论:抗纤方抗肝纤维化可能机理为抑制HSC增殖,促进其凋亡,促进HSC表达MMP-1,抑制TIMP-1的表达。     

肌细胞增强因子2A与肝星状细胞活化关系的体内实验研究

背景：转录调控在肝星状细胞（HSC）活化过程中起重要作用,研究显示转录因子肌细胞增强因子2（MEF2）参与了HSC的活化过程。目的：探讨肝纤维化形成过程中MEF2家族成员MEF2A与HSC活化的关系。方法：实验开始时处死6只大鼠作为0周对照组,64只大鼠随机分为正常对照组和肝纤维化模型组。模型组大鼠皮下注射60％CCL（0．3ml／100g,每周2次）复制肝纤维化模型;正常对照组大鼠与模型组于相同条件下饲养,不予任何处理。造模开始后3、6、9、12周分批处死大鼠,取肝组织,实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测MEF2AmRNA表达．蛋白质印迹法检测MEF2A蛋白和HSC活化标记物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达,VanGieson染色定量分析肝内胶原含量。结果：正常肝组织中仅有少量MEF2AmRNA和蛋白表达;随着肝纤维化的形成,肝组织MEF2AmRNA和蛋白表达量逐渐增加（P〈0．05）,MEF2A与Q—SMA蛋白表达呈正相关（r=0．88,P〈0．05）。肝内胶原含量随肝纤维化的形成呈递增趋势（P〈0．01）。结论：MEF2A参与了CCl4。诱导的大鼠肝纤维化形成过程中HSC的活化和增殖。     

miR-214通过抑制TOM1表达促进肝星状细胞活化和迁移

背景:肝星状细胞(HSCs)持续激活所致的细胞外基质过度沉积是肝纤维化发生、发展的关键环节。MicroRNAs(miRNAs)是一类重要的生物调节分子,为HSC的分化、增殖、凋亡、脂肪蓄积以及胶原生成所必须。既往对HSCmiRNAs表达谱的分析显示,miR-214在HSC活化过程中表达显著增高。目的:探讨miR-214在HSC中的生物学功能及其可能机制。方法:以real time PCR检测静息和完全活化状态大鼠HSC的miR-214 mRNA表达;应用miR-214封闭慢病毒载体感染HSC以敲除miR-214表达,以Transwell细胞迁移实验、蛋白质印迹法检测感染前后HSC迁移、活化能力的变化;应用荧光质粒报告系统对TargetScan(http://www.targetscan.org/)预测的miR-214靶基因进行验证。结果:miR-214 mRNA在HSC活化过程中表达显著增高(P<0.01)。miR-214敲除组HSC Transwell小室迁移细胞数较阴性对照组显著减少(P<0.001),HSC活化标记物α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白表达显著下调(P<0.01)。预测显示TOM1为miR-214的靶基因,并得到荧光质粒报告系统证实;miR-214敲除组HSC TOM1蛋白表达显著上调(P<0.05)。结论:miR-214参与促进HSC的活化和迁移,进而促进肝纤维化进程;miR-214在HSC中的生物学功能至少部分是通过抑制TOM1表达实现的。     

S-腺苷蛋氨酸对活化人肝星状细胞增殖和凋亡的影响

背景:肝星状细胞(HSCs)的活化是肝纤维化发生的中心环节。S-腺苷蛋氨酸(SAM)是机体最重要的甲基供体,既往研究表明SAM具有一定的抗纤维化作用,能抑制HSCs的活化。目的:观察SAM对活化人肝星状细胞株LX-2增殖、凋亡的作用及其相关机制。方法:用不同浓度SAM培养LX-2细胞24 h,采用CCK-8法检测SAM对LX-2细胞增殖的影响,流式细胞术检测细胞周期和凋亡率,实时定量PCR法检测cyclin D1 mRNA表达,蛋白质印迹法检测α-SMA蛋白表达。结果:与对照组相比,3.0~8.0 mmol/L SAM能抑制LX-2细胞增殖,并呈剂量依赖性(P0.05);2.0、4.0 mmol/L组G1/G0期细胞比例显著降低(P0.05),S期细胞比例显著升高(P0.05);4.0、8.0 mmol/L组早期凋亡率和总体凋亡率显著升高(P0.05);2.0、4.0 mmol/L组cyclin D1 mRNA表达显著升高(P0.05);1.0、2.0、4.0 mmol/L组α-SMA蛋白表达显著降低(P0.05)。结论:SAM能抑制LX-2细胞增殖,其机制可能通过上调cyclin D1的表达而使细胞周期阻滞于S期;同时,SAM能诱导LX-2细胞的凋亡,并下调α-SMA的表达。     

内毒素刺激Kupffer细胞对肝星状细胞前胶原基因表达的影响

背景：肠源性内毒素血症对肝纤维化具有启动作用,肝星状细胞（HSC）活化是肝纤维化发生、发展的中心环节。目的：探讨内毒素刺激Kupffer细胞对HSC前胶原基因表达的影响及其可能机制。方法：改良链酶蛋白酶、胶原酶原位灌流和密度梯度离心分离大鼠肝脏Kupffer细胞和HSC。以RNA斑点杂交检测脂多糖（LPS）、Kupffer细胞、LPS与Kupffer细胞共培养和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）对HSC前胶原mRNA表达的影响,放射免疫法检测LPS对Kupffer细胞和HSC产生TNF-α的影响,RNA印迹法检测LPS和TNF-α对Kupffer细胞和HSC转化生长因子-β（TGF-β）mRNA表达的影响结果：经低浓度（0.5、1、5μg/ml）LPS处理的Kupffer细胞培养上清可增加HSCⅠ、Ⅲ、Ⅳ型前胶原mRNA表达,经高浓度（10、15、20μg/ml）LPS处理的Kupffer细胞培养上清、单独LPS、未经处理的Kupffer细胞培养上清、单独TN-α均无此作用。Kupffer细胞培养上清中的TNF-α含量随LPS浓度梯度的增加而递增,HSC培养上清中的TNF-α含量则无明显变化。TNF-α不能增加HSC TGF-βmRNA表达,但能增加Kupffer细胞TGF-βmRNA表达;经LPS或TNF-α处理的Kupffer细胞培养上清能增加HSC TGF-βmRNA表达。结论：低浓度内毒素能上调HSC前胶原基因表达,该作用有赖于内毒素激活Kupffer细胞所产生的活性介质的参与。     

莪术油对HSC-T6细胞基因表达的影响

目的:研究莪术油对HSC-T6细胞基因表达的影响.方法:从基因库中查询50种肝纤维化相关基因的mRNA序列,用寡核苷酸探针设计软件设计探针,在PE8909DNA合成仪上合成寡核苷酸,用OGR-04点样仪及醛基化玻片制备成基因芯片.以莪术油不同浓度含药培养液培养HSC-T6细胞.根据细胞毒性实验,确定细胞存活率在50%以上的药物浓度作为实验所用浓度,每组设空白对照,分别按1小时、6小时、12小时、24小时4个时间段收集细胞,按操作步骤提取细胞总RNA,经反转录荧光标记,杂交和洗涤,用Genepix 4000B扫描仪扫描芯片,ImaGene 4.2软件进行数据分析和归一化处理,使用看家基因和阳性对照对Cy3和Cy5扫描结果进行校正.结果:莪术油78.125μg/ml作用HSC-T6细胞24小时,可使基因TIMP-2、IL-6表达分别下调2.3、2.2倍.结论:从分子水平揭示了莪术有效成分莪术油的抗肝纤维化机制.     

丹参酸乙对大鼠肝星状细胞细胞内氧化水平及增殖细胞核抗原的影响

目的：研究丹参酸乙(SA-B)对大鼠肝星状细胞细胞内氧化水平及增殖细胞核抗原(PCNA)的影响。方法：原位灌注法分离正常大鼠肝星状细胞，丹参酸乙直接添加于原代培养的肝星状细胞；2′7′-二氯二氢荧光素(DCFH)掺入反映细胞内氧化程度，Western blot蛋白印迹法检测PCNA含量。结果：1μm和10μm丹参酸乙可减低活化的以及经丙二醛(MDA)刺激后的肝星状细胞的细胞内氧化程度。1μm和10μm丹参酸乙都可抑制活化的以及经MDA刺激后的肝星状细胞的PCNA表达量。结论：丹参酸乙可降低细胞内氧化程度，抑制MDA刺激后肝星状细胞PCNA的表达，丹参酸乙的抗氧化和抗增殖这两方面的作用可能有一定的联系。     

肝星状细胞凋亡机制研究进展

肝纤维化是肝脏对慢性损伤的一种修复反应,其特征性变化为细胞外基质过度沉积。肝星状细胞（HSC）活化是肝纤维化形成的中心环节,诱导活化的HSC凋亡有望逆转肝纤维化。本文从死亡受体途径、线粒体途径、内质网途径、神经生长因子途径、过氧化物酶体增生物激活受体-γ途径、核因子-κB途径对HSC的凋亡机制作一综述。