小鼠LIGHT胞外段基因原核表达质粒的构建及表达

目的 构建含有LIGHT胞外段的原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达.方法 从由小鼠骨髓来源的未成熟树突状细胞中提取总RNA,经RT-PCR扩增LIGHT胞外段,克隆至原核表达载体pEF-24a( )中,构建重组表达质粒pET24-LIGHYECD.重组质粒经酶切鉴定及序列测定后,转化E. coli BL21,IPTG诱导表达,并用SDS-PAGE和Western blot进行检测.结果 RT-PCR扩增出了525 bp LIGHT胞外段的cDNA,经测序证实其序列正确.SDS-PAGE和Western blot分析证实重组质粒可表达出相对分子质量为20 000的LIGHT胞外段蛋白.结论 成功地克隆了小鼠LIGHT胞外段基因并在大肠杆菌中进行了表达,为进一步研究LIGHT的功能打下了基础.     

人LIGHT胞外段基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的:构建人LIGHT胞外段基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达.方法:从人外周血单核细胞来源的未成熟树突状细胞中提取总RNA,通过RT-PCR得到LIGHT胞外段基因,并将其克隆至pET32a(+)原核表达载体中,经双酶切鉴定及序列测定后的重组质粒转化入E.coli BL21,IPTG诱导表达目的蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot进行检测.结果:RT-PCR扩增出了大小为543 bp 的LIGHT胞外段基因,经测序证明序列正确.SDS-PAGE和Western blot分析证实重组质粒可表达出Mr约为41 000的蛋白.结论:成功地克隆了人LIGHT胞外段基因并在大肠杆菌中进行了表达为进一步研究LIGHT的功能打下了基础.     

人TLR1胞外段原核表达载体的构建、蛋白表达及纯化

目的:克隆、原核表达人Toll-like receptor1 (TLR1)胞外段基因,获得人TLR1胞外段蛋白.方法:RT-PCR扩增人TLR1胞外段基因,构建pET30(a)+/TLR1表达质粒,转染大肠杆菌BL21,在BL21细胞中表达TLR1胞外段蛋白,并进行纯化和Western blot 鉴定.结果:PCR扩增及重组质粒测序结果表明成功地构建了pET30(a)+/TLR1胞外段原核表达质粒,PCR扩增的目的基因大小为1 700 bp左右.表达的包涵体蛋白经溶解及变性后上镍亲和柱纯化,SDS-PAGE分析纯化产物在Mr为68 kD处有明显蛋白条带;Western blot ELISA结果显示,其表达纯化的蛋白为TLR1蛋白.结论:TLR1胞外段在大肠杆菌BL21中正确表达,为TLR1识别机制及信号转导机制研究奠定了基础.     

人Cyclin E原核表达载体的构建及表达

目的：构建人Cyclin E基因原核表达载体,并在E.coli BL21中表达并纯化。方法：PCR扩增人Cyclin E基因片段,并将其克隆到原核表达载体pET32a（＋）中,构建重组质粒pET32a（＋）-Cyclin E。经限制性内切酶EcoRⅠ与XhoⅠ双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coli BL21,经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白。结果：获得全长约为1200bp的人的Cyclin E基因片段。以构建的重组质粒pET32a（＋）-Cyclin E转化E.coli BL21后,经IPTG诱导,表达出相对分子质量（Mr）约60000的融合蛋白。经SDS-PAGE、Western blot分析显示,诱导表达的蛋白为Cyclin E。结论：成功地构建了表达载体pET32a（＋）-Cyclin E,并表达出重组蛋白His-Cyclin E,为进一步筛选在体内外能与Cyclin E和CDK2结合的新蛋白奠定了基础。     

HBV/HEV融合二价抗原原核表达载体的构建及蛋白的初步表达

目的:构建一个能够表达出乙/戊型肝炎二价抗原的重组原核表达载体,并在E. coli BL21(DE3)中表达.方法:采用PCR方法扩增出HBV的S基因和HEV的ORF2编码区的羧基末端中的414～606 aa的基因片段,将两片段连接后克隆入T载体,得到融合基因,将融合基因克隆入含有Ω增强子的pTΩ-TE高效的原核表达载体中,构建重组质粒pTΩ-TTSE.将pTΩ-T7SE转化E. coli BL21(DE3),经IPTG诱导后用Western blot鉴定融合蛋白.结果:获得全长为1 284 bp的融合的HBV/HEV的基因片段.已构建的重组质粒pTΩ-T7SE转化E.coli BL21(DE3)后,经IPTG诱导,表达出相对分子质量(Mr)约为50 000重组蛋白.SDS-PAGE分析显示,表达的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在于胞质中,表达量约占全菌蛋白的30.52%.Western blot结果表明在Mr为50 000处可见特异性着色带.结论:成功构建了原核表达载体pTΩ-T7SE,并表达出目的蛋白,为研制预防乙型和戊型肝炎双价疫苗提供了实验技术基础.     

牛IgG2Fc受体(boFcγ2R)胞外区基因原核表达载体的构建及其表达

目的:构建牛Fcγ2R胞外区基因的原核表达载体,并在E.coli BL21(DE3)中表达.方法:提取健康成年牛的白细胞总RNA,经RT-PCR扩增牛Fcγ2R胞外区基因片段,并将其克隆到载体pGEM-T Easy,经限制性内切酶EcoR I和 Not I双酶切鉴定及序列测定后,再将其亚克隆入原核表达载体pET28a中,构建重组质粒pET-2R,转化E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白.结果:获得682 bp的编码牛Fcγ2R胞外区基因片段.以构建的重组质粒pET-2R转化E.coli BL21(DE3)后,经IPTG诱导,表达出相对分子质量(Mr)约为30 000的重组蛋白.SDS-PAGE分析显示,表达的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在于E.coli BL21(DE3)的胞质中,Western blot检测表明该蛋白能和牛IgG2结合.结论:成功地构建了原核表达载体pET-2R,并表达出重组蛋白.为研究牛IgG和受体的相互作用机制及其介导的免疫反应打下了基础.     

人DC-SIGN全长编码区基因的克隆及其胞外段的原核表达

目的:克隆人DC-SIGN全长编码区基因, 获得其胞外段的原核表达产物.方法:采用RT-PCR方法, 从健康产妇胎盘中克隆DC-SIGN全长cDNA, 扩增其胞外段基因并构建pET41a-sDC-SIGN重组表达质粒, 在大肠杆菌BL21(DE3)中表达, 以SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物.结果:从健康产妇胎盘总RNA中, 扩增获得约1 300 bp的DNA片段, 克隆至pGM-T载体获得重组质粒pGM-DC-SIGN.从pGM-DC-SIGN扩增DC-SIGN的胞外段基因, 构建重组表达质粒pET- 41a-sDC-SIGN;纯化表达产物sDC-SIGN-GST, 鉴定其相对分子质量( M r)为66 000, Western blot证明其可与抗DC-SIGN抗体特异性结合.结论:成功克隆DC-SIGN全长编码区基因, 并在大肠杆菌中成功表达其胞外段融合蛋白sDC-SIGN-GST, 为进一步研究DC-SIGN的功能奠定了基础.     

我国地方品种姜曲海猪TLR5基因的克隆、表达及鉴定

目的:克隆我国地方品种姜曲海猪TLR5基因,构建该基因的原核表达质粒,获得融合表达蛋白并鉴定其免疫特性,为进一步研制TLR5单克隆抗体(mAb)提供免疫原。方法:从全血中提取姜曲海猪的基因组,设计特异性引物,利用PCR方法扩增得到TLR5基因片段,PCR产物克隆到原核表达载体pET30a(+)中,构建重组表达质粒pET-TLR5,将重组表达质粒转化E.coli BL21,0.5 mmol/L IPTG诱导表达目的蛋白,应用SDS-PAGE和Western blot分析鉴定蛋白活性。结果:成功扩增出猪TLR5基因片段,大小为2 571 bp。酶切鉴定结果表明,猪的TLR5基因成功克隆入原核表达载体pET30a(+)中,重组质粒pET-TLR5在大肠杆菌中获得表达,SDS-PAGE结果显示出相对分子质量(Mr)大小约95 200;Western blot结果表明,表达产物与兔抗小鼠TLR5 mAb具有良好的反应性。结论:成功克隆并表达具有较好免疫原性的猪TLR5分子,为其mAb的制备提供生物材料。     

牛IgG2Fc受体（boFcγ2R）胞外区基因原核表达载体的构建及其表达

目的：构建牛Fcγ2R胞外区基因的原核表达载体，并在E.coli BL21（DE3）中表达。方法：提取健康成年牛的白细胞总RNA，经RT-PCR扩增牛Fcγ2R胞外区基因片段，并将其克隆到载体pGEM-TEasy，经限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切鉴定及序列测定后，再将其亚克隆入原核表达载体pET28a中，构建重组质粒pET-2R，转化E.coli BL21（DE3）经LPTG诱导表达组氨酸融合蛋白。结果：获得682bp的编码牛Fcγ2R胞外区基因片段。以构建的重组质粒pET-2R转化E.coli BL21（DE3）后，经IPTG诱导，表达出相对分子质量（Mr）约为30000的重组蛋白。SDS-PAGE分析显示，表达的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在于E.coli BL21（DE3）的胞质中，Western blot检测表明该蛋白能和牛IgG2结合。结论：成功地构建了原核表达载体pET-2R，并表达出重组蛋白。为研究牛IgG和受体的相互作用机制及其介导的免疫反应打下了基础。     

小鼠PD-1胞外段的克隆、原核表达及活性分析

目的小鼠PD-1胞外段(ePD-1)原核表达载体的构建、表达、纯化及其生物学效应初步研究。方法应用小鼠脾细胞总RNA,采用RT-PCR克隆PD-1胞外段基因,将其重组到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建原核表达载体pGEX-4T-1-ePD-1,转化至E.coli DH5α,筛选阳性菌落,进行酶切及测序鉴定。将测序正确的重组表达质粒pGEX-4T-1-ePD-1转化至E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot检测,同时通过蛋白质纯化仪纯化GST-ePD-1融合蛋白。利用流式细胞术和Alamar Blue法,检测纯化的PD-1胞外段融合蛋白对淋巴细胞增殖的影响,评价其生物学活性。结果成功构建重组质粒pGEX-4T-1-ePD-1,并在E.coli BL21(DE3)中获得了成功表达,利用蛋白质纯化仪得到纯化的GST-ePD-1融合蛋白。流式细胞术和Alamar Blue法结果均显示,不同浓度的融合蛋白作用于混合淋巴细胞,与阴性对照相比,可明显促进淋巴细胞的增殖。结论成功地克隆、表达和纯化了小鼠ePD-1蛋白,纯化的重组蛋白可有效促进淋巴...     

人源His-talin1原核表达载体的构建及其蛋白表达

目的克隆人源talin1 cDNA,构建其高效原核表达载体,并纯化得到高纯度His-talin1融合蛋白。方法 PCR法扩增talin1基因并连接到原核表达载体pET32a(+),筛选和测序鉴定阳性克隆。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经过IPTG诱导表达和亲和层析分离纯化表达产物,对纯化的蛋白进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果成功扩增了2.4kb的talin1基因,构建了pET32a(+)-talin1重组质粒并在大肠杆菌中诱导表达出His-talin1融合蛋白。经SDS-PAGE和Western blot方法 ,验证了高纯度纯化的融合蛋白。结论建立了高效稳定的His-talin1表达体系,为进一步研究Talin1蛋白的结构及其与P-selectin之间的关系打下基础。     

尿激酶型纤溶酶原激活因子cDNA的克隆与原核表达

目的构建尿激酶型纤溶酶原激活因子（uPA）原核表达质粒,并在大肠埃希菌BL21中表达,为进一步研究uPA奠定基础。方法应用逆转录RT—PCR,从人肝细胞cDNA中扩增人尿激酶型纤溶酶原激活因子基因序列,与原核表达质粒pET32a重组,获得表达质粒uPA—pET32a。用氨苄青霉素平板筛选转化子。双酶切与DNA测序进行鉴定,用IPTG诱导表达,并用Westernblotting进行鉴定。结果从肝细胞cDNA中扩增的uPA基因片段长1296bp,酶切及DNA测序证实uPA-pET32a重组质粒构建正确,表达融合蛋白分子量约为68900Mr,经Western blotting证实为目的蛋白。结论成功构建了重组原核表达质粒uPA—pET32a。并能在大肠埃希菌内表达,所表达的融合蛋白分子量大小与预期的相一致．为进一步的研究奠定了基础。     

人MBL-CLR表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的：在大肠杆菌中表达人甘露聚糖结合凝集素（MBL）胶原样区（CLR）蛋白。方法：应用PCR技术,从含中国人野生型MBLcDNA的质粒pGEM-MBL中扩增CLR基因片段,将其克隆至pET32a原核表达载体后,转化E.coliBL21（DE3）感受态菌株诱导表达CLR蛋白。通过Ni^2＋-NTA琼脂糖柱层析纯化目的蛋白,以SDS-PAGE、Western blot和ELISA法进行鉴定。结果：从重组质粒pGEM-MBL中扩增到长约180bp的DNA片段。构建的重组表达载体经BamHⅠ和HindⅢ酶切后出现约5900bp和180bp的片段,测序结果同预期的结果完全一致。重组质料在大肠杆菌中诱导表达后,纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳出现Mr约为30000、60000和120000的3条带。Western blot分析表明,3条蛋白带均可与抗His抗体起反应,3条蛋白带对应于融合蛋白的单体和寡聚体。ELISA检测证实,纯化的蛋白能与鼠抗重组人MBL蛋白抗体结合。结论：获得可表达人MBL-CLR的大肠杆菌菌株和重组的人MBL-CLR-Trx融合蛋白,为MBL分子结构、功能关系的进一步研究提供了条件。     

尘螨变应原Der f 6 / pET32a( +) 重组质粒构建、表达、纯化及其产物血清 IgE 结合率

目的:获得尘螨变应原第6 组分Der f 6 原核表达产物并检测其与尘螨过敏性哮喘患儿血清抗体IgE 结合率。方法:酶切质粒pET28a(+)-Der f 6 获得目的基因Der f 6,将其与pET32a(+)载体连接成质粒pET32a (+)-Der f 6,转化BL21细菌后,用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,用Ni+离子亲和层析柱纯化表达产物,用十二烷基磺酸钠鄄聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、免疫印迹实验(Western blot)和蛋白质串联质谱(MALDI-TOF/ TOF)鉴定纯化产物。以纯化获得的产物为包被抗原建立间接ELISA 法检测尘螨过敏性哮喘患儿血清抗体反应情况。结果:成功构建了原核表达质粒pET32a (+)-Der f6,将该质粒转化E.coli BL21 诱导表达,亲和层析纯化后,SDS-PAGE 显示获得目的蛋白,Western blot 验证其能够与载体的组氨酸标签结合,质谱鉴定其Der f 6 结构一致。以此产物为包被抗原建立间接ELISA 检测尘螨过敏性哮喘患儿血清,阳性率为41.3% (19/46)。结论:成功构建了原核表达质粒pET32a (+)-Der f 6,亲和纯化获得的目的蛋白具有良好的反应原性。     

人可溶性DC-SIGN的原核表达及鉴定

目的构建可溶性DC-SIGN（sDC-SIGN）原核表达载体,获得不含标签蛋白的sDC-SIGN蛋白。方法采用PCR方法,从含人DC-SIGNcDNA的重组质粒pGM-DC-SIGN扩增DC-SIGN胞外区基因片段,插入原核表达载体pET17b,构建重组表达载体pET17b-sDC-SIGN,经酶切图谱和测序鉴定,转入E.coliBL21（DE3）诱导表达蛋白,用抗人DC-SIGN抗体-Sepharose4B亲和层系纯化表达产物,以SDS-PAGE和Westernblot鉴定。结果从重组质粒pGM-DC-SIGN扩增获得1300bp目的基因片段,构建重组表达质粒pET17b-sDC-SIGN,其酶切图谱和序列与预期相符。纯化表达产物sDC-SIGN,鉴定其分子质量为38000,Westernbolt证明其可与抗人DC-SIGN抗体特异性结合。结论获得了能高效表达重组人sDC-SIGN的大肠杆菌菌株和不带任何标签蛋白的sDC-SIGN蛋白,为深入研究sDC-SIGN的功能奠定了基础。     

五日热巴通体重组外膜蛋白HbpA的研制和抗原性分析

为克隆并表达五日热巴通体外膜蛋白HbpA的基因,并对其抗原性进行初步分析,采用PCR方法从五日热巴通体基因组DNA扩增hbpA基因,将目的基因片段插入原核表达质粒pET32a（＋）,构建重组质粒pET32a（＋）-hbpA;将构建的重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）并诱导目的基因表达,以SDS-PAGE电泳以及免疫印迹实验分析表达的目的蛋白。SDS-PAGE电泳分析发现pET32a（＋）-hbpA转化菌高效表达一48kDa重组蛋白;免疫印迹分析发现该蛋白与其免疫血清发生强烈反应;间接免疫荧光分析发现该重组蛋白免疫血清能特异识别五日热巴通体。实验结果表明五日热巴通体外膜蛋白HbpA的基因已在大肠杆菌中高效表达。     

FSHR胞外区基因片段的原核表达及多克隆抗体的制备

目的 构建人卵泡刺激素受体(follicle stimulating hormone receptor,FSHR)胞外区的原核表达载体,并用纯化的重组蛋白免疫小鼠,制备抗血清.方法 采用RT-PCR克隆人FSHR胞外区,将其克降到原核表达载体pET32a(+),并通过IPTG诱导目的 基因在大肠杆菌中表达,所获得的包涵体蛋白通过Ni-NAT离子交换柱层析纯化重组蛋白,并用SDS-PAGE和蛋白印迹法鉴定.结果 PCR扩增出1 047 bp目的 基因片段,测序证实克隆的基因序列与GenBank中的FSHR序列相符.工程菌pET32 a(+)/FSHR胞外区经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE显示有新生的蛋白表达条带,Mr约为58 000,与预期的一致.其表达形式为不溶性包涵体,此包涵体蛋白通过Ni-NAT离子交换柱层析纯化,纯化的蛋白质经SDS-PAGE分析可见单一条带.该蛋白免疫小鼠制备抗血清,抗体效价为1:12 800,Western blot检测证实该抗体能与目的 蛋白发生特异性结合.结论 获得了人FSHR胞外区融合蛋白及特异性多克隆抗体,为进一步研究FSHR蛋白的功能奠定了基础.     

人源N-末端脂多糖结合蛋白(NH-LBP)的原核表达及抗原性分析

目的 在大肠杆菌表达系统中大量表达、纯化N-末端脂多糖结合蛋白(NH-LBP)并检测其抗原性.方法 构建pET28a-NHLBP质粒,转入大肠杆菌BL21感受态细胞,IPTG诱导表达成功后扩大培养、提取包涵体、亲和层析分离纯化,并将纯化得到的NH-LBP融合蛋白经Western blot鉴定.结果 成功构建pET28a-NH-LBP表达质粒并转入BL21细菌进行诱导表达,目的 蛋白以包涵体形式表达为主;经扩大培养、分离纯化产物大小与NH-LBP融合蛋白理论计算值一致,经Western blot检测具有B细胞表位.结论原核表达人源N-末端脂多糖结合蛋白(NH-LBP)是制备抗原的一种可行方便的方法,为筛选针对NHLBP的人源性小分子抗体提供了材料.     

2型猪链球菌中国强毒株znuA基因的原核表达及免疫学活性分析

目的克隆2型猪链球菌高亲和力锌吸收蛋白(High-affinity zinc uptake system protein,ZnuA)编码基因并进行原核表达,研究ZnuA蛋白的免疫学活性。方法采用PCR法,从2型猪链球菌中国强毒株05ZYH33基因组扩增基因znuA,构建重组表达质粒pET32a::znuA,转化E.coli BL21(DE3),筛选阳性转化子进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定表达产物;His亲和层析柱纯化重组蛋白;Western blot检测ZnuA蛋白的免疫原性;重组蛋白免疫新西兰兔后收集多抗血清,间接ELISA检测多抗血清效价。结果构建的重组质粒在宿主菌中可高效表达,His亲和层析柱纯化获得较高纯度的重组蛋白;Western blot结果表明ZnuA蛋白具有良好的免疫原性;重组蛋白免疫新西兰兔后获得高效价的多抗血清。结论在原核系统中成功地表达了znuA基因编码的蛋白,且ZnuA重组蛋白具有良好的免疫原性,为进一步研究znuA基因在猪链球菌致病过程中的作用以及猪链球菌疫苗的开发奠定了基础。     

6个布鲁氏菌蛋白的克隆、表达及纯化

目的构建含6个布鲁氏菌蛋白的原核表达载体,并对其重组蛋白进行诱导表达及纯化。方法以羊种布鲁氏菌16M基因组DNA为模板扩增6个蛋白基因,与载体pET32a(+)连接,转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE及Westernblot鉴定,采用HisTrapTMHP纯化目的蛋白。结果成功克隆了6个布鲁氏菌蛋白,经对表达条件进行优化,目的蛋白获得大量表达,纯化后纯度达90%以上。结论获得了纯度较高的6个布鲁氏菌蛋白,为进一步研究其免疫原性及保护性奠定基础。