胰岛素受体磷酸化增加对MPP＋诱导的PC12细胞凋亡的影响

目的:研究胰岛素抗MPP 诱导PC12细胞凋亡中胰岛素受体(IR)的变化。方法:应用半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)测定胰岛素抗MPP 诱导PC12细胞凋亡过程中IRmRNA的基因表达,免疫沉淀Western印迹分析技术测定相同条件下IR的蛋白表达,应用IR自身磷酸化的特异阻断剂HNMPA-AM3,通过MTT法观察PC12细胞生存率的改变、瞬转IR质粒后再次观察细胞生存率的改变及进一步通过免疫沉淀Western印迹分析技术检测IR蛋白质磷酸化水平。结果:IR磷酸化程度的变化与细胞生存率的变化有关,HNMPA-AM3可阻断胰岛素对MPP 诱导的PC12细胞的抗凋亡作用,IR可增强胰岛素的抗凋亡作用。结论:IR磷酸化增加可抵抗MPP 诱导的PC12细胞的凋亡。     

硫丹对PC12细胞增殖的影响及诱导其凋亡的研究

目的观察硫丹(ES)对培养的PC12细胞增殖和形态学的影响及其诱导PC12细胞凋亡作用.方法不同浓度MPP+和ES分别干预PC12细胞24h,利用TUNEL染色、流式细胞仪、电镜检测观察其结果.结果①1 mmol·L-1MPP+组细胞数明显下降并有形态学改变;而0.03 mmol·L-1ES组细胞数就明显下降和有形态学改变,以0.01 mmol·L-1组最明显.②MPP+和ES均可诱导PC12细胞凋亡,电镜下0.06mmol·L-1ES组有较多凋亡细胞和少量坏死细胞.结论ES对PC12细胞有毒性作用,其机制可能与细胞凋亡有关.     

利福平对MPP+所致PC12细胞线粒体损伤的影响

目的 探讨利福平对1-甲基-苯基-吡啶离子(MPP+)诱导的大鼠嗜铬细胞瘤细胞株(PC12)细胞形态、线粒体结构的影响.方法 利用MPP+诱导分化PC12细胞建立帕金森病体外细胞模型;Hoechst33342荧光染色法检测细胞凋亡;透射电子显微镜观察各组细胞线粒体超微结构.结果 正常细胞组PC12细胞形态完整,线粒体结构完整清晰;MPP+作用后,凋亡细胞数量增多,核固缩、碎裂明显,线粒体空泡化明显,部分细胞见凋亡小体形成;利福平作用后,随着利福平浓度的增高,细胞凋亡程度及线粒体空泡化现象明显减轻,且存在浓度依赖性.结论 利福平可减轻MPP1+所致PC12细胞线粒体损伤的程度,推测可能是通过对线粒体的保护作用来减轻MPP+诱导的分化PC12细胞的凋亡,但其作用的具体途径还需进一步研究.     

促红细胞生成素对1-甲基-4-苯基吡啶损伤的PC12细胞的保护作用(英文)

目的探讨促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)对1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)诱导的PC12细胞变性损伤的保护作用及机制。方法用MPP+处理PC12细胞制作帕金森病细胞模型,采用四甲基偶氮唑蓝法检测暴露于不同浓度EPO后细胞的活性;流式细胞术与DNA断端原位标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTPnick end labeling, TUNEL)检测各组的细胞凋亡率;免疫印迹法检测不同处理组PC12细胞Bcl-2和Bax的表达,并采用荧光法观察不同处理组PC12细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)与线粒体膜电位水平以及caspase-3活性的变化。结果 MPP+可以使PC12细胞存活率下降,凋亡率增高;同时PC12细胞内ROS增多,线粒体膜电位下降。MPP+还可以明显地提高Bax/Bcl-2比值并激活caspase-3。而EPO可以抑制这些由MPP+引发的改变,并在1 U/mL时发挥最大保护作用。结论 EPO可抑制MPP+诱导的PC12细胞死亡,其作用机制可能与其自身抗氧化和抗凋亡的特性有关。     

IGF-1对MPP~+诱导PC12细胞凋亡的保护作用及其机制

目的探讨胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)诱导的PC12细胞凋亡的保护作用及机制。方法以250μmol/L的MPP+损伤PC12细胞作为帕金森病(PD)细胞模型,实验分组如下:空白对照组、MPP+组,IGF-1+MPP+组和抑制剂组。抑制剂组再分为:(1)空白对照组;(2)MPP+组;(3)IGF-1组;(4)IGF-1+MPP+组;(5)MPP++LiCL组;(6)IGF-1+MPP++LiCL组。孵育24h后采用AO-EB法检测细胞凋亡率;采用MTT法检测细胞存活率;孵育4h之后采用Western Blot免疫印迹法检测糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、phospho-GSK-3β蛋白表达。结果(1)100nmol的IGF-1对MPP+处理的PC12细胞有保护作用,减少了MPP+所致的细胞凋亡。(2)LiCL起到了与IGF-1相似的对PC12细胞的保护作用。(3)总GSK-3β含量各处理组没有太大改变,但磷酸化的GSK-3β含量IGF-1组高于与MPP+单独处理组。结论IGF-1可减少MPP+所致的细胞凋亡,其保护作用与上调磷酸化的GSK-3β的表达相关。     

美满霉素对帕金森病细胞凋亡模型保护作用的研究

目的探讨美满霉素(MC)对1甲基4苯基吡啶离子(MPP+)诱导的帕金森病细胞凋亡模型保护作用的机制。方法将不同浓度(10、50、250、500μmol/L)MPP+加入培养的PC12细胞中,选择最适当浓度的MPP+建立多巴胺神经元凋亡模型(MPP+组);通过四甲基偶氮唑盐法(MTT法)检测经不同浓度(0、10、50、100、200μmol/L)MC预处理后多巴胺神经元凋亡模型的活性,以此筛选出具有最佳保护作用MC浓度建立MC+MPP+组;用电泳法、流式细胞术和逆转录聚合酶链式反应分别检测MPP+组、MC+MPP+组细胞的凋亡率,以及此2组细胞caspase3mRNA的表达,并与空白对照组比较。结果(1)在MPP+为10μmol/L时可见细胞凋亡最典型的梯状DNA条带,以此浓度建立多巴胺神经元凋亡模型(MPP+组);用100μmol/LMC预处理的MPP+组细胞活性最高(P<0.05),以此作为此后实验用MC浓度。(2)MC+MPP+组细胞凋亡率及caspase3mRNA的灰度比值分别为(22.83±2.10)%及68.08±1.14,极显著低于MPP+组的(45.89±2.28)%及86.50±1.43(均P<0.01),但仍明显高于空白对照组的(11.05±1.02)%及53.75±1.23(均P<0.05)。结论MC可能通过下调caspase3mRNA表达保护MPP+诱导的PC12细胞凋亡。     

活化素A对MPP^＋所诱导的PC12细胞损伤的保护作用

目的观察重组人活化素A(rhAcT)对MPP+所诱导的PC12细胞损伤的保护作用.方法将MMP+或活化素A,L-deprenyl加入体外培养的PC12细胞,用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞活力的变化;用免疫细胞化学法和RT-PCR评价细胞的酪氨酸羟化酶和bcl-2蛋白及mRNA含量的变化,用脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡的变化,比较各组的差异.结果预先给予rhAcT和L-deprenyl的两组细胞活力明显高于MPP+损害组,酪氨酸羟化酶和bcl-2的蛋白及mRNA表达强于损害组,同时两组的凋亡细胞明显减少,rhAcT和L-deprenyl两组间无显著差异.结论rhAcT和L-deprenyl通过上调bcl-2的表达,抑制凋亡的发生,而对MMP+所诱导的PC12细胞的损伤具有保护作用.     

胰岛素对百草枯诱导损伤PC12细胞的保护机制的研究

目的 探讨胰岛素对百草枯(PQ)诱导损伤的多巴胺能神经元PC12细胞保护作用的可能机制.方法 在前期实验证明胰岛素对PQ诱导损伤的PC12细胞具有保护作用的基础上,应用免疫沉淀Western印迹分析技术检测空白对照PC12细胞组、PQ干预PC12细胞组(PQ组)、胰岛素干预PC12细胞组(胰岛素组)和PQ与胰岛素共同干预PC12细胞组(胰岛素+PQ组)INRTyr~(1162/1163)和AktSer~(473)磷酸化蛋白的表达情况.结果 免疫沉淀Western印迹分析技术显示:胰岛素组和胰岛素+PQ组通道上出现了表示INRTyr~(1162/1163)磷酸化蛋白表达的棕色带,没有胰岛素干预的通道均未出现棕色带;INR Tyr~(1162/1163)磷酸化蛋白表达量化统计分析显示胰岛素组INRTyr~(1162/1163)磷酸化程度高于胰岛素+PQ组,但差异无统计学意义(P>0.05);而AktSer~(473)磷酸化蛋白表达量化统计分析显示胰岛素组AktSer~(473)磷酸化程度明显高于胰岛素+PQ组,差异有统计学意义(P<0.05).结论 INR Tyr~(1162/1163)磷酸化增加和胰岛素受体后信号传导通路AktSer~(473)磷酸化增加可能是胰岛素保护PQ诱导损伤PC12细胞的机制之一.     

莱菔硫烷拮抗PC12细胞氧化应激损伤的机制

目的 探讨莱菔硫烷对体外1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)诱导的PC12细胞氧化损伤模型是否具有保护作用及其机制.方法 以MPP+损伤PC12细胞制备氧化损伤模型.不同浓度的莱菔硫烷加入培养基观察各组细胞生长情况.后续实验分成4组:正常对照组(A)、莱菔硫烷组(B)、MPP+损伤组(C)、莱菔硫烷预处理+MPP+损伤组(D).通过MTT比色法检测细胞活力,观察不同浓度莱菔硫烷预处理PC12细胞活力变化及不同分组PC12细胞活力变化;流式细胞术检测不同分组PC12细胞中细胞凋亡率的变化;免疫印迹法测定不同分组PC12细胞内转录因子相关因子2(Nrf2)、血红素加氧酶1(HO-1)及醌还原氧化酶1(NQ01)蛋白的表达变化.结果 A组细胞存活率(98.70％)与MPP+(500μmol/L)组(58.16％)相比差异有统计学意义(F =21.83,P＜0.05),D组细胞存活率明显提高.C组细胞凋亡率升高,D组细胞与C组相比差异有统计学意义,莱菔硫烷预处理后细胞凋亡率明显减低.C组Nrf2、HO-1、NQ01蛋白表达下降,D组Nrf2、HO-1、NQ01蛋白表达升高.结论 莱菔硫烷对MPP+诱导的PC12细胞损伤具有保护作用,莱菔硫烷对MPP+诱导的PC12细胞损伤的保护作用可能通过激活Nrf2-抗氧化反应元件通路途径实现.     

IGF-1通过PI3K/Akt通路抑制MPP~+诱导PC12细胞凋亡机制的研究

目的探讨胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)对1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP+)诱导的PC12细胞凋亡的抑制作用及其潜在的作用机制。方法以250μmol/L的MPP+损伤PC12细胞作为帕金森病(Parkinson disease,PD)细胞模型。实验分组如下:空白对照组、MPP+组、IGF-1组、IGF-1+MPP+组、IGF-1+MPP++LY294002组。孵育24 h后采用AO-EB法检测细胞凋亡率;采用MTT法检测细胞存活率;孵育4 h之后采用Western blot免疫印迹法检测Akt、磷酸化-Akt(phospho-Akt,p-Akt)蛋白表达。结果 (1)100 nmol的IGF-1能够显著抑制MPP+所致的细胞凋亡,对PC12细胞具有保护作用;(2)总Akt含量蛋白表达水平各处理组之间差别无统计学意义(P>0.05),但磷酸化的Akt在IGF-1+MPP+组表达高于MPP+单独处理组(P<0.05)。结论 IGF-1可减少MPP+所致的细胞凋亡,其保护作用与上调磷酸化的Akt的表达相关。     

H2O2预处理通过ERK1/2和p38 MAPK信号通路上调14-3-3蛋白在PC12

OBJECTIVE: To investigate the protective effects of hydrogen peroxide preconditioning (HPP) on the pheochromocytoma (PC12) cells treated with 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP(+)) and to explore the potential mechanisms. METHODS: The viability and apoptosis of PC12 cells were determined by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay and 4',6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining, respectively. The expressions of 14-3-3 protein and phosphorylated p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) were determined by Western blot. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to measure the activity of extracellular signal-regulated protein kinase 1/2 (ERK1/2). RESULTS: The cell viability decreased and the number of apoptotic cells increased dramatically in MPP(+) group compared with that in Control group. HPP induced a significant increase in cell viability and a marked decrease in population of apoptotic cells of the MPP(+)-treated PC12 cells, accompanied with up-regulation of 14-3-3 protein and increase of ERK1/2 and p38 MAPK activities. The 14-3-3 protein expression was positively correlated with the phosphorylation of ERK1/2. Furthermore, inhibition of the ERK1/2 with PD98059 abolished the 14-3-3 protein up-regulation in PC12 cells induced by HPP. CONCLUSION: HPP protects PC12 cells against MPP(+) toxicity by up-regulating 14-3-3 protein expression through the ERK1/2 and p38 MAPK signaling pathways.     

促红细胞生成素对1-甲基-4-苯基吡啶损伤的PC12细胞的保护作用

目的探讨促红细胞生成素（erythropoietin,EPO）对1-甲基-4-苯基吡啶离子（MPP^＋）诱导的PC12细胞,变性损伤的保护作用及机制。方法用MPP^＋处理PC12细胞制作帕金森病细胞模型,采用四甲基偶氮哗监泫检测暴露于不同浓度EPO后细胞的活性;流式细胞术与DNA断端原位标记法（terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling,TUNEL）检测各组的细胞凋亡率;免疫印迹法检测不同处理组PC12细胞Bcl-2和Bax的表达,并采用荧光法观察不同处理组PC12细胞活性氧（reactive oxygen species,ROS）与线粒体膜电位水平以及caspase-3活性的变化。结果MPP^＋可以使PC12细胞存活率下降,凋亡率增高;同时PC12细胞内ROS增多,线粒体膜电位下降。MPP^＋还可以明显地提高Bax／Bcl-2比值并激活caspase-3。而EPO可以抑制这些由MPP^＋引发的改变,并在1U／mL时发挥最大保护作用。结论EPO可抑制MPP^＋诱导的PC12绌胞死亡,其作用机制可能其自身抗氧化和抗凋亡的特性有关。     

14-3-3蛋白过表达减轻1-甲基-4-苯基吡啶离子对PC12细胞的毒性

目的 研究14—3—3蛋白过表达对1-甲基-4苯基吡啶离子（MPP^＋诱导的PC12细胞死亡的影响作用及其可能的机制。方法 构建pcDNA3．1（＋）-14—3—3真核表达质粒,用脂质体2000转染PCI2细胞;Westernn blot技术检测PC12细胞中14—3—3蛋白、Bcl-2蛋白,和BAD蛋白的表达;然后分别用MTT法、酶标仪及流式细胞仪检测PC12细胞的活力、caspase的活性及PC12细胞的凋亡率。结果 （1）将pcDNA3．1（＋）-14—3—3质粒转染PCI2细胞3周后,14—3—3蛋白的表达显著增加;（2）MPP^＋诱导PC12细胞存活率的下降是剂量依赖性的,当MPP^＋的浓度达100μmol／L时,PC12细胞的存活率丧失约50％;（3）caspase的活性随着MPP^＋浓度的增加而增高,当MPP^＋浓度到达100μmol／L时caspase的活性也到达最大值,而当MPP^＋浓度超过100μmol／L时,caspase的活性急剧下降;（4）用100μmol／L的MPP^＋处理PC12细胞24h后,PC12细胞的凋亡率为26．5％,14—3—3蛋白的过表达使PC12细胞的凋亡率下降到8．6％;（5）用100μmol／LMPP^＋处理PC12细胞后,Bcl-2蛋白的表达趋于下调而BAD蛋白的表达上调,14—3-3蛋白的过表达能显著的增加Bcl-2蛋白的表达而使BAD蛋白的表达下调。结论 14—3—3蛋白过表达通过上调Bcl-2蛋白的表达并下调BAD蛋白的表达,减少了MPP^＋诱导的PC12细胞的凋亡,从而发挥对PC12细胞的保护作用。这些结果可能为PD的治疗提供新的药物靶点。     

Akt1/PKBalpha protects PC12 cells against the parkinsonism-inducing neurotoxin 1-methyl-4-phenylpyridinium and reduces the levels of oxygen-free radicals

The phosphatidylinositol (PI)-3 kinase-Akt/PKB survival pathway protects neurons from apoptosis caused by diverse stress stimuli. However, its protective effect against neurotoxins that produce oxidative stress and neurodegeneration has not been investigated. We analyzed the effect of this pathway on the action of the parkinsonism-inducing neurotoxin 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP+). Overexpression of a membrane-targeted, N-myristylated fusion protein of enhanced green fluorescence protein (EGFP) and mouse Akt1 attenuated the apoptotic effect of the neurotoxin in PC12 cells. This effect was not due to protection of mitochondrial complex I activity or restoration of energy charge. Following MPP+-treatment, myr-EGFP-Akt1-transfected cells exhibited an unaltered mitochondrial membrane potential and lower ROS levels than control cells. These results provide a new site of action of Akt/PKB at the level of the oxidative detoxifying cell machinery and suggest that this effect may be responsible in part for the resistance of myr-EGFP-Akt1-expressing cells to oxidative stress and MPP+-induced apoptosis.     

Dieldrin对PC12细胞的增殖及酪氨酸羧化酶mRNA表达的影响

目的 :观察有机氯杀虫剂dieldrin对培养的PC12细胞增殖及对其酪氨酸羟化酶mRNA(THmRNA)表达的影响 ,探讨该毒物致帕金森病 (PD)的可能机制。方法 :以MPP+ 为阳性对照 ,用不同浓度 (10 -4 ～ 1mmol·L-1)的MPP+ 和dieldrin分别于预PC12细胞 2 4h后计细胞数 ,并采用半定量逆转录聚合酶链式反应 (RT PCR)方法测定THmRNA表达的改变。结果 :(1)MPP+ 和dieldrin对PC12细胞均有毒性 ,1mmol·L-1的MPP+ 可使细胞数减少至对照组的 45 % (P <0 0 1) ,低于此浓度的MPP+ 对细胞增殖无影响 ;但 0 1mmol·L-1的dieldrin就可使细胞数减少至对照组的 3 0 % (P <0 0 1) ,1mmol·L-1的dieldrin使PC12细胞全部死亡。 (2 )MPP+ 和dieldrin均可降低THmRNA的表达。 0 1mmol·L-1MPP+ 和dieldrin使细胞THmRNA的表达分别下降至对照组的 69 3 % (P >0 0 5 )和 61 7% (P <0 0 1)。结论 :Dieldrin不仅具有与MPP+ 相同的抑制培养的PC12细胞的增殖及THmRNA表达的作用 ,而且其对细胞的毒性强于MPP+ ,提示dieldrin是一种潜在的致PD物质 ,其与PD的关系值得进一步研究     

Pycnogenol protects neurons from amyloid-beta peptide-induced apoptosis

Neuronal apoptosis is one of the pathological features of Alzheimer's disease (AD). Morphological pathology reveals that neuronal apoptosis is associated with senile plaques containing amyloid-beta peptide (Abeta) in AD brains. Reactive oxygen species (ROS) has been proposed to be involved in the apoptotic mechanism of Abeta-mediated neurotoxicity. In the present study, using a rat pheochromocytoma (PC12) cell line, we investigated the effect of Pycnogenol (PYC), a potent antioxidant and ROS scavenger, on Abeta(25-35)-induced apoptosis and ROS generation. We used vitamin E, a known antioxidant agent, to verify the effect of PYC. Abeta(25-35)-induced apoptosis in PC12 cells was demonstrated by: (1) a dose-dependent loss of cell viability; (2) a time- and dose-dependent increase in the apoptotic cells; (3) an induction of DNA fragmentation; and (4) an increase in caspase-3 activity and cleavage of poly (ADP-ribose) polymerase (PARP). Our data showed that a significant increase in ROS formation preceded apoptotic events after PC12 cells were exposed to Abeta(25-35). We further found that PYC not only suppressed the generation of ROS but also attenuated caspase-3 activation, DNA fragmentation, PARP cleavage, and eventually protected against Abeta-induced apoptosis. Vitamin E also suppressed cell death and caspase-3 activation induced by Abeta(25-35). Taken together, these results suggest that ROS may be involved in Abeta-induced apoptosis in PC12 cells. They further suggest that PYC can reduce apoptosis, possibly by decreasing free radical generation in PC12 cells.     

突变型α-核突触蛋白的自噬性降解途径及可能机制

目的 观察突变型α-核突触蛋白对PC12细胞增殖的影响和可能的降解途径,探讨其在帕金森病发病机制中的作用.方法 对转染了α-核突触蛋白(A30P)的PC12细胞进行药物干预,检测细胞的增殖活性,并采用透射电镜观察细胞超微结构改变以及自噬的特征性改变,同时检测α-核突触蛋白的表达和超氧化物歧化酶(SOD)的水平.结果 (1)Western Blot法检测α-核突触蛋白的表达:A30P+渥曼青霉素组(A30P+W组)、A30P+1-甲基4-苯基吡啶组(A30P+MPP+组)较A30P组明显增高,以A30P+W组最为明显;而A30P+雷帕霉素组(A30P+R组)条带较A30P组减低(P＜0.01);(2)不同时间点细胞培养液中SOD水平(U/ml)的测定:用MPP+处理转染了突变型α-核突触蛋白的PC12细胞后,培养液中SOD水平(A30P+MPP+组:3 h:97.49±13.8;12 h:102.7±12.7:24 h:101.5±11.8;48 h:104.3±12.4)较A30P组在各时间点显著下调(t=3.7721,P=0.0017);A30P+R组在给药12 h以后,培养液中SOD水平逐渐升高,其中在24 h(121.2±13.0)、48 h(124.3±14.1)和72 h(127.7±13.7)时与A30P+W组比较差异有统计学意义(t=2.9746,P=0.0083);突变型α-核突触蛋白激活了自噬途径,并介导了MPP+的毒性作用,自噬抑制剂渥曼青霉素可通过抑制自噬而加剧α-核突触蛋白积聚,导致细胞死亡;而自噬诱导剂雷帕霉素则可以通过诱导自噬的发生而促进α-核突触蛋白的降解和细胞生长.结论 α-核突触蛋白的异常积聚导致PC12细胞的自噬性细胞死亡,促进自噬有助于突变型α-核突触蛋白降解,对细胞具有保护作用.