食品中肠出血性大肠埃希菌O157:H7的PCR检测

目的建立快速准确检测食品中肠出血性大肠埃希菌O157：H7的方法。方法采用多重聚合酶链式反应技术（MPCR）特异性扩增肠出血性大肠埃希菌O157：H7的STX、rfbE、fliC基因。结果分别在228，378，709bp处扩增出3个目的基因片段，且只有肠出血性大肠埃希菌O157：H7获得扩增，其他菌种扩增均呈阴性。结论PCR方法比传统细菌检测方法更特异、快速、灵敏和简便，为食品中肠出血性大肠埃希菌O157：H7的快速检测提供了新的手段。     

2005～2007年中国食品中疑似O157大肠埃希菌的鉴定及毒素基因的检测

目的对中国2005～2007年食源性疾病监测网分离疑似O157大肠埃希菌进行鉴定,了解各种不同类型监测食品中大肠埃希菌O157的分布及毒力基因的携带情况。方法运用API20E生化试剂条进行初步鉴定,使用血清分型和PCR方法确定菌株,并检测毒力基因。结果(1)通过API20E生化初步鉴定共获得154株疑似O157大肠埃希菌。(2)通过血清学方法和特异基因的检测,共确定89株大肠埃希菌O157,其中42株是O157:H7(47%),其余的菌株为O157:NM和O157:hund(未确定型)。(3)毒力基因的检测:42株O157:H7和6株O157:NM携带eaeA+hlyA基因;共29株菌携带stx基因,主要分布在不发酵山梨醇O157:H7菌株中。(4)监测的生羊肉、生牛肉、生猪肉、生鸡肉、蔬菜沙拉等食品中均检出了携带stx基因的O157:H7。结论鉴定结果显示中国部分监测食品中均分离到有一定程度致病力的大肠埃希菌O157。     

PCR方法检测EHEC O157：H7的rfbO157、fliCH7、hlyA、eaeA、stx2及其变种基因

目的：应用当前国际上常用的rfbO157、fliCH7、hlyA、eaeA、stx2及其变种5对引物，对45株疑似肠出血性大肠埃希菌O157：H7（EHEC O157：H7）检测鉴定，全面了解此类菌的致病力情况。方法：分纯并富集被鉴定菌株，首先以单克隆诊断血清学凝集，阳性者再经100℃水煮制成粗模板，应用PCR检测各菌株是否具有rfbO157、fliCH7、hlyA、eaeA、stx2及stx2及其变种5种基因，扩增结果经EB染色后在凝胶成像仪下观察特异性条带并拍照。结果：45株被检测菌经PCR扩增检测，5种基因全部阳性的有10株，4种基因出现阳性的只有1株，3种基因阳性的有6株，2种基因阳性的有17株，1种基因阳性的有10株，1株菌的5种基因检测均为阴性。45株菌中和。，阳性的有44株fliCH7基因阳性的菌株有30株，hlyA阳性的菌株只有10株，eaeA阳性基因的菌株有21株，stx2及其变种阳性的也只有11株。结论：这次45株菌中有5株具有全部的5种基因，44株为EHEC O157，其中30株为EHEC O157：H7，这次选择的5种基因不仅能给被检测菌株定性，而且能较全面地反应其毒力强度，适合于有条件的基层实验室开展。     

PCR方法检测EHEC O157∶ H7的rfbO157、fliCH7、hlyA、eaeA、stx2及其变种基因

目的:应用当前国际上常用的rfbO157、fliCH7、hlyA、eaeA、stx2及其变种5对引物,对45株疑似肠出血性大肠埃希菌O157∶ H7(EHEC O157∶ H7)检测鉴定,全面了解此类菌的致病力情况.方法:分纯并富集被鉴定菌株,首先以单克隆诊断血清学凝集,阳性者再经 100℃水煮制成粗模板,应用PCR检测各菌株是否具有rfbO157、fliCH7、hlyA、eaeA及stx2及其变种5种基因,扩增结果经EB染色后在凝胶成像仪下观察特异性条带并拍照.结果:45株被检测菌经PCR扩增检测,5种基因全部阳性的有10株,4种基因出现阳性的只有1株,3种基因阳性的有6株,2种基因阳性的有17株,1种基因阳性的有10株,1株菌的5种基因检测均为阴性.45株菌中rfbO157阳性的有44株,fliCH7基因阳性的菌株有30株,hlyA阳性的菌株只有10株,eaeA阳性基因的菌株有21株,stx2及其变种阳性的也只有11株.结论:这次45株菌中有5株具有全部的5种基因,44株为EHEC O157,其中30株为EHEC O157∶ H7,这次选择的5种基因不仅能给被检测菌株定性,而且能较全面地反应其毒力强度,适合于有条件的基层实验室开展.     

肠出血性大肠杆菌O157:H7多重PCR快速检测研究

[目的]建立能快速、特异检测肠出血性大肠杆菌O157︰H7的多重PCR技术。[方法]选用针对大肠杆菌O157志贺样毒素1、2(slt1/slt2)基因、溶血素(hlyA)基因、和O157特异性基因(rfbE)的4对引物,在同一扩增体系中进行PCR,优化反应体系,测定特异性和灵敏度,并进行了猪肉模拟样品检测。[结果]该方法扩增目的基因片段分别为348,584,250bp和497bp,特异性和灵敏度均高。细菌纯培养物的检测灵敏度为103cfu/ml,猪肉模拟样品37℃预增菌4h后检测灵敏度能达到100cfu/ml。[结论]初步建立了快速、灵敏、特异地测定肠出血性大肠杆菌EHECO157︰H7的多重PCR检测技术。     

浙江省首株产志贺毒素大肠埃希菌0157：H7的分子生物学特性研究

目的：了解自浙江省杭州市腹泻婴儿中分离的1株大肠埃希菌O157：H7（HZI-11株）的分子生物学特性。方法：应用ATB1525细菌半动化生化鉴定系统鉴定菌种。应用0157特异性抗血清玻片凝集试验、H7特异性抗血清试管凝集试验、以及PCR检测O抗原特异性rfbE基因和H7特异性fliC基因，进行菌株血清型的鉴定。应用多重Real-time PCR和常规PCR检测stx1、stx2、hly和eae毒力基因。对菌株进行脉冲场凝胶电泳（PFGE）分型，并与国内代表菌株进行比较。ATB1525药敏检测仪和纸片法检测菌株的抗药性。结果：细菌生化鉴定为大肠埃希菌，山梨醇阴性。血清型为O157：H7。毒力基因stx2、hly和eae均阳性，stx1阴性。PFGE谱带同江苏分离O157：H7菌株几乎完全相同，带型的相似度为97％。结论：该菌株为浙江省首株产志贺毒素大肠埃希菌（STEC）O157：H7。与国内近年在江苏等地流行的STEC O157：H7菌株密切相关。STEC O157：H7已开始对浙江地区的人民健康构成了威胁。     

浙江省首株产志贺毒素大肠埃希菌O157:H7的分子生物学特性研究

目的:了解自浙江省杭州市腹泻婴儿中分离的1株大肠埃希菌O157:H7(HZ1-11株)的分子生物学特性.方法:应用ATB1525细菌半动化生化鉴定系统鉴定菌种.应用O157特异性抗血清玻片凝集试验、H7特异性抗血清试管凝集试验、以及PCR检测O抗原特异性rfbE基因和H7特异性fliC基因,进行菌株血清型的鉴定.应用多重Real-timePCR和常规PCR检测stx1、stx2、hly和eae毒力基因.对菌株进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型,并与国内代表菌株进行比较.ATB1525药敏检测仪和纸片法检测菌株的抗药性.结果:细菌生化鉴定为大肠埃希菌,山梨醇阴性.血清型为O157:H7.毒力基因stx2、hly和eae均阳性,stx1阴性.PFGE谱带同江苏分离O157:H7菌株几乎完全相同,带型的相似度为97%.结论:该菌株为浙江省首株产志贺毒素大肠埃希菌(STEC)O157:H7,与国内近年在江苏等地流行的STECO157:H7菌株密切相关.STEC O157:H7已开始对浙江地区的人民健康构成了威胁.     

大肠埃希菌O157血清型分离株的脉冲场凝胶电泳分型

目的了解杭州地区分离的产志贺毒素和不产志贺毒素大肠埃希菌O157菌株的分子流行病学特征。方法对杭州地区于1997～2005年间自散发腹泻患者和动物中分离的10株大肠埃希菌O157血清型菌株,PCR检测毒力基因stx1、stx2、eae和ehxA,eae阳性者进行eae基因分型;按标准化的脉冲场凝胶电泳法(pulsefieldgelelectrophoresis,PFGE)进行分子分型,并与国内其他省份分离的产志贺毒素大肠埃希菌(Shigatoxin_producingEscherichiacoli,STEC)O157∶H7菌株进行比较。结果杭州分离菌株HZ1_11携带毒力基因stx2、γ型eae和ehxA,为浙江省检获的首株STECO157∶H7;3株杭州O157∶NM分离菌株(2_1、26_1和SR05株)仅携带β型eae基因;其他6株杭州O157∶H?分离菌株中,均未检出毒力基因。PFGE揭示,在杭州人源O157菌株中,STECO157∶H7HZ1_11株与近年江苏和安徽分离STECO157∶H7菌株密切近缘,且其图谱与江苏菌株几乎完全相同;3株eae阳性的O157∶NM分离菌株聚类成与STECO157∶H7菌株较远的一簇,杭州1株stx阴性的O157∶H?(1_68株)则处于另一独立的一簇。5株杭州O157∶H?动物分离菌株与其他人源菌株图谱差异极大。结论浙江省首株STECO157∶H7可能是源自近年在江苏流行的STECO157∶H7菌株。β型eae阳性的大肠埃希菌O157∶NM菌株可能具有引起散发腹泻的能力。     

大肠埃希菌O157:H7嵌合荧光RAM检测分析

目的建立大肠埃希菌O157：H7的嵌合荧光法（SYBR Green I）实时网状分枝扩增（RAM）检测技术.方法将产志贺样毒素大肠埃希菌O157：H7靶基因递比稀释确定SYBR Green I实时RAM的灵敏度,并进一步检测临床分离的菌株.结果SYBR Green I实时网状分枝扩增技术最低能检测10个产志贺样毒素大肠埃希菌O157：H7,检测信号出现的时间与靶基因的浓度成正比,临床分离3株产志贺样毒素大肠埃希菌O157为阳性,而非致病性大肠埃希菌为阴性.结论SYBR Green I实时RAM是一种快速、灵敏、准确、实时、环保的检测大肠埃希菌O157：H7的新核酸扩增技术.     

MPCR-DHPLC检测大肠杆菌O157研究

目的:建立多重PCR(Multiplex PCR,MPCR)结合变性高效液相色谱(Denaturing High-PerformanceLiquid Chromatography,DHPLC)检测大肠杆菌O157的方法,并了解食品中分离的O157毒力基因携带情况。方法:针对大肠杆菌O157的rfbE、flicH7、eaeA、stx1、stx2基因设计引物,其单一PCR扩增产物在DHPLC上出现的色谱峰为标准色谱峰,建立MPCR-DHPLC检测方法。结果:MPCR扩增产物在DHPLC上的色谱峰,在位置和峰型上与标准色谱峰有较好的对应性。DHPLC能分离大小4个碱基差异的DNA片段。4株分离株检测结果,O157-1出现rfbE、flicH7、eaeA基因色谱峰,O157-2、O157-3、O157-4只出现rfbE基因色谱峰。结论:建立的MPCR-DHPLC方法可用于大肠杆菌O157及其毒力基因的检测。     

大肠杆菌O157特异基因的PCR检测方法

目的：建立一种灵敏、特异的检测肠出血性大肠杆菌O157的PCR方法。方法：针对大肠杆菌O157特异性基因rfbO157设计引物，扩增-497bp的O157标识序列。结果：应用该PCR反应体系，对4株O157菌株和14株非O157菌株扩增结果表明，O157菌株均扩增出预期的497bp片段，14株非O157菌株则为阴性。纯菌液检测灵敏度为60cfu／PCR反应，模拟混合菌液检测灵敏度为400cfu／PCR反应。结论：该方法用于肠出血性大肠杆菌O157的检测鉴定简便、快捷，具有很高的特异性和灵敏度，为O157的临床辅助诊断提供了有力手段。     

福建省O157大肠杆菌初查

１９９７年４－７月在莆田、福州、霞莆等地区抽抽查部分人群及家养畜禽粪便等，首次在猪、鸭、羊、鸡、鸽等５种动物中检出３种不同类型的Ｏ１５７大肠杆菌，其中Ｏ１５７：Ｈ７与Ｏ１５７：ＮＭ各８株，Ｏ１５７：Ｈ？５株，同时在１位腹泻患儿中分离到此菌。本文不这些Ｏ１５７分离菌株的生物学特性包括形态、生化，致病性以及药物敏感性等进行了实验，发现不同来源、不同类型的Ｏ１５７大肠杆菌都可致使小鼠发病死亡。在防治工作     

大肠埃希菌O157:H7蜚蠊实验带菌消长的研究

目的采用EHEC O157H7-EDL933株,体外染菌感染德国小蠊(Blattela germanica),观察其体内外感染和带菌消长情况.方法点滴法体外定量染菌,剂量为1 μl(菌悬液浓度为 8.0×105～ 1.9×107(CFU/ml),并采用昆虫单虫单管方法饲养观察.结果蜚蠊经体外染菌,获得体内外带菌,体外带菌时间中位数为( 144.0± 22.17)h(95%CI 100.55～ 187.45 h);体内中位数为( 144± 25.77)h(95%CI 93.48～ 194.52 h);体内外带菌消长差异,无统计学意义( χ2＝ 1.46,P＝ 0.226 3).德国小蠊最长带菌时间至少216 h(9 d).结论蜚蠊不仅是EHEC-O157H7的贮存宿主和疾病传播的媒介,更重要的是潜在的人类感染的传染源.     

从海产品中检出大肠埃希菌O157:H7

目的：调查南京市饮食行业海鲜类食品受大肠埃希菌O157：H7污染的状况。方法：随机采取南京市各大宾馆的海水产品，进行大肠埃希菌O157：H7的检测，进行常规生化和血清学、毒力基因的PCR检测。结果：从一份文蛤样品中成功分离到了1株大肠埃希菌O157：H7。结论：提示我们该菌的宿主范围比较广，须引起高度重视，加强防范，遏止其流行势头。     

Evaluation of hha and hha sepB mutant strains of Escherichia coli O157:H7 as bacterins for reducing E. coli O157:H7 shedding in cattle

Escherichia coli O157:H7 colonizes cattle intestines by using the locus of enterocyte effacement (LEE)-encoded proteins. The induction of systemic immune response against LEE-encoded proteins, therefore, will prove effective in reducing E. coli O157:H7 colonization in cattle. The previous studies have demonstrated that a hha (encodes for a hemolysin expression modulating protein) deletion enhances expression of LEE-encoded proteins and a sepB (encodes an ATPase required for the secretion of LEE-encoded proteins) deletion results in intracellular accumulation of LEE proteins. In this study, we demonstrate the efficacy of the hha and hha sepB deletion mutants as bacterins for reducing fecal shedding of E. coli O157:H7 in experimentally inoculated weaned calves. The weaned calves were injected intramuscularly with the bacterins containing 10⁹ heat-killed cells of the hha⁺ wild-type or hha or hha sepB isogenic mutants, and boosted with the same doses 2- and 4-weeks later. The evaluation of the immune response two weeks after the last booster immunization revealed that the calves vaccinated with the hha mutant bacterin had higher antibody titers against LEE proteins compared to the titers for these antibodies in the calves vaccinated with the hha sepB mutant or hha⁺ wild-type bacterins. Following oral inoculations with 10¹⁰ CFU of the wild-type E. coli O157:H7, the greater numbers of calves in the group vaccinated with the hha or hha sepB mutant bacterins stopped shedding the inoculum strain within a few days after the inoculations compared to the group of calves vaccinated with the hha⁺ wild-type bacterin or PBS sham vaccine. Thus, the use of bacterins prepared from the hha and hha sepB mutants for reducing colonization of E. coli O157:H7 in cattle could represent a potentially important pre-harvest strategy to enhance post-harvest safety of bovine food products, water and produce.     

应用免疫磁珠法分离大肠杆菌O157H7

目的：进一步探讨免疫磁珠法（IMS）分离大肠杆菌O157H7（E.O157H7) 的敏感性。方法：应用IMS检测该菌的主要贮存宿主动物（家禽,家畜）E.O157H7感染情况,同时用传统分离法作对照。结果：家禽（畜）粪便中E.O157H7分离率分别为鸡2．38％（2／84）,牛9．52％（4／42）,猪2．41％（2／83）,鸭,鹅、狗、驴和羊的粪便中分离到E.O157H7,传统法均未从上述家畜（畜）粪便中分离到E．O157H7,结论：据本次检测结果,表明IMS分离O157能提高检测的灵敏度（检测水平为2cfu/g,传统法为200cfu/g）,并缩短检测时间1天,是开展E．O157H7病原学分离（包括人间和宿主动物的流行病学监测）值得推荐的方法。     

肠出血性大肠杆菌O157:H7几种检测方法的比较研究

目的筛选建立一种快速准确检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的方法,初步了解在本地区家禽、家畜养殖场和肉类食品中的带菌状况.方法以自动酶标免疫测试系统(VIDAS)、自动免疫磁珠收集系统(AIMS)与传统常规分离方法进行比较.结果应用自动免疫磁珠收集系统对79份实样的检测,检出率为6.33%,在4天内能做完全鉴定结果.该法能检出＜10 cfu/ml模拟样品中的O157:H7,同时选择使用CHROMagar O157琼脂平板的效果要明显优于山梨醇麦康凯(SMAC)琼脂平板.自动酶标免疫测试系统和传统分离方法未检出.结论以自动免疫磁珠收集系统结合CHROMagar琼脂平板建立的O157:H7分离方法具有特异性好、敏感性高、快速简便的特点,可以用于O157:H7外环境的监测和食品污染源调查.     

肠出血性大肠杆菌O157:H7和霍乱弧菌的多重PCR检测

目的 建立同时检测肠出血性大肠杆菌(O157：H7)和霍乱弧菌的多重PCR方法,为霍乱和肠出血性大肠杆菌感染的快速诊断提供实验依据。方法 首先选择O157：H7的O抗原(rfbE)、H鞭毛抗原(fliC)基因以及霍乱孤菌外膜蛋白(ompW)和肠毒素A亚单位(ctxA)基因特异的4对引物,分别或共同对O157：H7和霍乱孤菌进行PCR扩增,并以琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。结果 所有O157：H7菌株均在497bp和625bp处出现O157 rfbE基因和H7 fliC基因扩增产物;霍乱菌株均出现560bp、302bp的ompW和ctxA基因扩增产物,O157：H7和霍乱弧菌共同扩增可出现4条单一条带。结论 选择4对特异引物的多重PCR方法可简便、特异、快速、灵敏地对O157：H7和霍乱弧菌进行同时检测。     

东台市肠出血性大肠埃希菌O157感染监测

目的为掌握肠出血性大肠埃希菌O157在东台市家禽、家畜中的带菌,腹泻病人中的感染和自来水厂水源水中的污染情况.方法2000-2002年,分别在流行季节采集家禽、家畜和腹泻病人粪便及自来水厂水源水,应用免疫磁珠浓集、山梨醇麦康凯平板分离、生化和血清学反应进行鉴定.结果3年间东台市采集的6种动物粪便有4种中检出肠出血性大肠埃希菌O157,其阳性率牛为11.32%、羊为10.58%、猪为9.35%、鸡为7.73%.腹泻病人的阳性率为1.57%.采集的178份自来水厂水源水、60只苍蝇标本中均未分离出肠出血性大肠埃希菌O157.3株自动物粪便分离株具有至少2种混合型毒力基因.75株肠出血性大肠埃希菌O157菌株对15种抗生素存在不同的耐药率.结论东台市家禽、家畜和腹泻病人中存在肠出血性大肠埃希菌O157感染,且存在流行的潜在危险.     

污水等环境中O157大肠杆菌的研究

「目的」了解生活及养殖污水等环境中是否存在Ｏ１５７大肠杆菌。「方法」选市区、郊区饲养场、屠宰场、农贸市场、医院和居民生活污水等作为调查对象,按季节定时定点采集污水、禽畜粪便和市场丰板等标本进行Ｏ１５７大肠杆菌分离培养、鉴定。「结果」从养猪场、屠宰场、市场污水和生活污水以及猪粪、鸡粪、猪肉砧板中检出２类Ｏ１５７大肠杆菌（Ｏ１５７：Ｈ７和Ｏ１５７：ＮＭ）。并发现夏秋季污水等环境中Ｏ１５７大肠苗菌检出率