超低温冰箱转液氮阶梯降温法与传统程序降温法保存造血干细胞的比较

背景:在造血干细胞整个冷冻保存过程中,受到降温速率、储存温度深浅、冷冻保护剂组合等因素影响,各国学者在提倡选择何种保存方法上面存在不同的主张。目的:比较-80℃低温冰箱转液氮阶梯降温法与传统程序降温法保存外周造血干细胞的效果。方法:将采集的造血干细胞分两组,第一组细胞浓度为1×1011L-1,加入10%二甲基亚砜,放入程序冷冻仪内程序设置为室温至-4℃按1℃/min的速率降温,按35℃/min快速降至-45℃,再以15℃/min升至-21℃,然后以5℃/min降至-90℃,取出冷冻管置-196℃液氮罐内。第二组细胞浓度为1×1011L-1,加入5%二甲基亚砜、3%羟乙基淀粉、4%人血白蛋白,将冷冻管置-80℃冰箱过夜后取出,置-196℃液氮罐内的气相,再过夜后置液氮罐液相内。结果与结论:两组冷冻方法保存细胞的锥虫蓝拒染率、回收率、凋亡率和死亡率差异无显著性意义(P>0.05)。结果显示用5%二甲基亚砜、4%白蛋白、3%羟乙基淀粉组成的冷冻保护剂,通过-80℃低温冰箱转液氮阶梯降温法冷冻保存造血干细胞与传统10%二甲基亚砜作为冷冻保护剂用程序降温的方法取得一样效果,操作简便易于临床应用。     

超低温冰箱转液氮阶梯降温法与传统程序降温法保存造血干细胞的比较

背景：在造血干细胞整个冷冻保存过程中,受到降温速率、储存温度深浅、冷冻保护剂组合等因素影响,各国学者在提倡选择何种保存方法上面存在不同的主张。目的：比较-80℃低温冰箱转液氮阶梯降温法与传统程序降温法保存外周造血干细胞的效果。方法：将采集的造血干细胞分两组,第一组细胞浓度为1×1011L-1,加入10%二甲基亚砜,放入程序冷冻仪内程序设置为室温至-4℃按1℃/min的速率降温,按35℃/min快速降至-45℃,再以15℃/min升至-21℃,然后以5℃/min降至-90℃,取出冷冻管置-196℃液氮罐内。第二组细胞浓度为1×1011L-1,加入5%二甲基亚砜、3%羟乙基淀粉、4%人血白蛋白,将冷冻管置-80℃冰箱过夜后取出,置-196℃液氮罐内的气相,再过夜后置液氮罐液相内。结果与结论：两组冷冻方法保存细胞的锥虫蓝拒染率、回收率、凋亡率和死亡率差异无显著性意义（P〉0.05）。结果显示用5%二甲基亚砜、4%白蛋白、3%羟乙基淀粉组成的冷冻保护剂,通过-80℃低温冰箱转液氮阶梯降温法冷冻保存造血干细胞与传统10%二甲基亚砜作为冷冻保护剂用程序降温的方法取得一样效果,操作简便易于临床应用。     

不同冷冻保护剂对低温冰箱转液氮阶梯降温冷冻保存造血干细胞效果的影响

背景:非程序降温-80 ℃低温冰箱保存方便快捷,程序降温-196 ℃液氮保存可靠长久,将两者合二为一简化流程已成功用于临床.目的:观察不同冷冻保护剂对-80 ℃低温冰箱转液氮阶梯降温冷冻保存造血干细胞效果的影响.方法:分设10%二甲亚砜组、5%二甲亚砜联合3%羟乙基淀粉组、5%二甲亚砜联合0.25 mol/L海藻糖组、5%二甲亚砜联合3%羟乙基淀粉及0.25 mol/L海藻糖组.采用 -80 ℃低温冰箱转液氮阶梯降温法对单采外周造血干细胞进行冷冻保存,通过透射电镜观察细胞超微结构变化,流式细胞仪观察Annexin-V、PI、Caspase-3水平.结果与结论:4组冷冻保存细胞的存活率、凋亡率和死亡率差异均无显著性意义(P > 0.05).透射电镜下各组细胞超微结构变化差异不明显.单个核细胞群落冷冻保存后存活率在90%以上,含成熟细胞较多的CD45+细胞群落凋亡发生率可达50%左右.造血干祖细胞群落中,早期细胞较晚期细胞更能耐受冷冻损伤.提示在基础冷冻保护剂二甲亚砜的基础上,加入羟乙基淀粉和海藻糖并未显示出对冷冻保存效果的增强作用.     

不同冷冻保护剂对低温冰箱转液氮阶梯降温冷冻保存造血干细胞效果的影响

背景：非程序降温-80℃低温冰箱保存方便快捷,程序降温-196℃液氮保存可靠长久,将两者合二为一简化流程已成功用于临床。目的：观察不同冷冻保护剂对-80℃低温冰箱转液氮阶梯降温冷冻保存造血干细胞效果的影响。方法：分设10%二甲亚砜组、5%二甲亚砜联合3%羟乙基淀粉组、5%二甲亚砜联合0.25mol/L海藻糖组、5%二甲亚砜联合3%羟乙基淀粉及0.25mol/L海藻糖组。采用-80℃低温冰箱转液氮阶梯降温法对单采外周造血干细胞进行冷冻保存,通过透射电镜观察细胞超微结构变化,流式细胞仪观察Annexin-V、PI、Caspase-3水平。结果与结论：4组冷冻保存细胞的存活率、凋亡率和死亡率差异均无显著性意义（P〉0.05）。透射电镜下各组细胞超微结构变化差异不明显。单个核细胞群落冷冻保存后存活率在90%以上,含成熟细胞较多的CD45＋细胞群落凋亡发生率可达50%左右。造血干祖细胞群落中,早期细胞较晚期细胞更能耐受冷冻损伤。提示在基础冷冻保护剂二甲亚砜的基础上,加入羟乙基淀粉和海藻糖并未显示出对冷冻保存效果的增强作用。     

冻存时间对复苏后胚胎大鼠神经干细胞体外诱导向多巴胺能神经元分化的影响

目的:观察应用10%牛血清白蛋白 20%二甲基亚砜联合低温保护剂冷冻保存不同时间的胚胎大鼠中脑神经干细胞复苏后,其体外诱导分化成多巴胺能神经元的能力。方法:实验于2004-02/2005-10在中山大学附属第一医院完成。①应用克隆细胞法在含细胞因子表皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养液中单细胞克隆培养胚胎大鼠中脑神经干细胞。②经传代扩增后,培养于含10%牛血清白蛋白和20%二甲基亚砜的神经干细胞冻存液中,在液氮中分别冷冻保存6,12,及18个月后,重新复苏培养于神经干细胞培养液中,并在含白细胞介素1α、白细胞介素11、白血病抑制因子、胶质细胞源性神经营养因子的诱导分化液中诱导向多巴胺能神经元分化。③分化细胞分别进行免疫细胞化学鉴定和流式细胞仪检测。结果:①胚胎大鼠中脑神经干细胞单细胞克隆系经冷冻复苏后,除少数细胞贴壁死亡外,多数细胞生长良好并克隆形成新的神经干细胞球。②神经干细胞球经诱导分化后,免疫细胞化学染色显示分化细胞中含有胶质纤维酸性蛋白、微管相关蛋白2及酪氨酸羟化酶染色阳性细胞。③流式细胞仪检测冻存6,12,18个月及未冻存组神经干细胞诱导分化的酪氨酸羟化酶染色阳性细胞的分化率分别为(15.3±3.4)%,(16.2±1.8)%,(15.6±2.2)%,(16.7±2.8)%,方差分析显示各组间差异无显著性(F=1.799,P>0.05)。结论:冷冻保存18个月的胚胎大鼠中脑神经干细胞不影响其体外诱导分化成多巴胺能神经元的能力。     

利用冷冻胚胎建立人类胚胎干细胞系

背景：目前人胚胎干细胞建系的技术路线主要有囊胚法、核移植法和胚胎单卵裂球法，但由于破坏胚胎，涉及诸多伦理问题。目的：探讨利用冷冻胚胎建立人类胚胎干细胞系的可行性。设计、时间及地点：细胞学体内外实验，于200501／200608在沈阳市妇婴医院生殖中心完成。材料：妊娠13．5d的ICR鼠20只用于制各小鼠胚胎成纤维细胞饲养层，10周龄SICD鼠2只用于人胚胎干细胞体内分化实验。行IVF／ICSI助孕患者自愿捐献的冷冻胚胎，由沈阳市妇婴医院生殖中心提供。方法：复苏冷冻的胚胎，采用序贯培养法进行囊胚培养，用免疫外科方法去除滋养细胞，将得到的胚胎内细胞团接种于丝裂霉素C灭活的小鼠胚胎成纤维细胞上培养并传代。主要观察指标：取不同代次的培养细胞，分别进行生长特性、碱性磷酸酶染色、转录因子OCT-4、阶段特异性胚胎抗原SSEA-4、SSEA-1、肿瘤排斥抗原TRA-1-60、TAR-1-81、核型及体内分化全能性鉴定。结果：20个解冻卵裂期胚胎，获得9个囊胚，分离完整的内细胞团共7个，从7个内细胞团培养出2个人胚胎干细咆系，其中一个细胞系连续培养76代（20个月）。所培养的细胞具有人胚胎干细胞的共同生物学特性，即细胞呈扁平或圆形，可见1—3个核仁：碱性磷酸酶以及SSEA．3，SSEA．4，TRA-1．81，TRA-1-60，OCT-4均呈阳性表达，而SSEA-1呈阴性：核型正常，为46，XX核型；将细胞注射入SCID鼠皮下形成肿瘤，病理切片显示为成熟畸胎瘤：短串联重复分型结果显示所形成的畸胎瘤与人胚胎干细胞为相同的遗传背景。结论：实施体外受精-胚胎移植的夫妇怀孕后，多余的冷冻保存胚胎所分离培养的细胞具备人胚胎干细胞的所有特性，是建立人胚胎干细胞系很好的材料来源。     

冻存时间对复苏后胚胎大鼠神经干细胞体外诱导向多巴胺能神经元分化的影响

目的：观察应用10％牛血清白蛋白＋20％二甲基亚砜联合低温保护剂冷冻保存不同时间的胚胎大鼠中脑神经干细胞复苏后，其体外诱导分化成多巴胺能神经元的能力。 方法：实验于2004-02／2005-10在中山大学附属第一医院完成。①应用克隆细胞法在含细胞因子表皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养液中单细胞克隆培养胚胎大鼠中脑神经干细胞。②经传代扩增后，培养于含10％牛血清白蛋白和20％二甲基亚砜的神经干细胞冻存液中，在液氮中分别冷冻保存6，12，及18个月后，重新复苏培养于神经干细胞培养液中，并在含白细胞介素1α、白细胞介素11、白血病抑制因子、胶质细胞源性神经营养因子的诱导分化液中诱导向多巴胺能神经元分化。③分化细胞分别进行免疫细胞化学鉴定和流式细胞仪检测。 结果：①胚胎大鼠中脑神经干细胞单细胞克隆系经冷冻复苏后，除少数细胞贴壁死亡外，多数细胞生长良好并克隆形成新的神经干细胞球。②神经干细胞球经诱导分化后，免疫细胞化学染色显示分化细胞中含有胶质纤维酸性蛋白、微管相关蛋白2及酪氨酸羟化酶染色阳性细胞。③流式细胞仪检测冻存6，12，18个月及未冻存组神经干细胞诱导分化的酪氨酸羟化酶染色阳性细胞的分化率分别为（15．3&;#177;3．4）％，（16．2&;#177;1．8）％，（15．6&;#177;2．2）％，（16．7&;#177;2．8）％，方差分析显示各组间差异无显著性（F=1．799，P〉0．05）。 结论：冷冻保存18个月的胚胎大鼠中脑神经干细胞不影响其体外诱导分化成多巴胺能神经元的能力。     

阶段降温冷冻保存淋巴瘤患者自体造血干细胞临床应用观察

目的探讨阶段降温对外周血干细胞活性和临床应用的影响。方法应用自体血浆40%,CPD20%、DMSO终浓度为10%作为冷冻保护剂冷冻自体造血干细胞,-86℃过夜,转到-196℃液氮中保存至使用前,冷冻前后计数活细胞数、CD34+细胞比例和细胞计数,并计算回收率;同时评价回输后干细胞植活时间。结果共对18名患者的31份自体干细胞进行了深低温冷冻保存,解冻后活细胞数为(75.47±15.57)%(58%-95%)、CD34细胞回收率80.28%±24.37%(62%-92%)。回输后的干细胞全部植活,其中白细胞植活的时间为(13.8±3.85)d(9-22d),血小板植活的时间为(22.4±4.79)d(11-25d)。结论应用的阶段降温法可能造成的细胞丢失,但是28份回输患者植活证明,对于不具备程序降温设备的情况采用阶段降温法保存造血干细胞是可行的。     

分离培养方法及冻存技术对犬骨髓间充质干细胞生长和增殖的影响

背景：骨髓间充质干细胞在体外长期培养易发生自发分化，而失去多分化潜能，因此必须对培养的细胞及时冻存，需要时再进行复苏。目的：建立犬骨髓间充质干细胞体外分离、培养、增殖、冻存的方法。设计、时间及地点：对照观察细胞学实验，于2005-06／2008—06在浙江中医药大学附属第一医院骨伤研究所完成。材料：健康成年雄性Beagle犬用于骨髓间充质干细胞的提取。方法：采用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化骨髓间充质干细胞，并进行传代扩增培养。将第2代骨髓间充质干细胞与12．5％DMSO混匀置于冻存管中，采用慢冻快融法进行冻存和复苏：将冻存管置于-4℃冰箱2h，然后移入-30℃冰箱2h，再置于厚壁塑料泡沫盒中，扎紧密封，置-80℃冰箱过夜后，取出冻存管直接放入液氮中保存，或放入-80℃冰箱保存。复苏时将冻存管从液氮或80℃冰箱中取出，立即置37℃水浴并轻轻摇动，1-2min内迅速解冻。主要观察指标：复苏前后细胞成生长活性及形态变化。结果：分离的骨髓间充质干细胞为以均一的梭形的成纤维细胞样贴壁生长，贴壁及增殖能力强，传代细胞贴壁较快。经过液氮长期冻存后，将复苏后的骨髓间充质干细胞再培养，细胞形态及生长状态与冻存前无差异，均呈长梭形均匀分布生长，细胞生长增殖旺盛。结论：采用密度梯度离心法结合贴壁培养法町获得犬骨髓间充质干细胞，应用慢冻快融技术进行冻存和复苏，较好的保持了冻存细胞的活力和功能。     

-80℃直接冻存人造血干细胞的实验研究和临床应用

以5％二甲基亚砜(DMSO)和6％羟乙基淀粉(HES)作为冷冻保护剂,非程控降温、-80℃冷冻保存人造血干细胞的简化方法用于骨髓移植(BMT)及外周干细胞移植(PBSCT)自80年代起已获成功。该方法冻存的造血干细胞活性与传统的10％DMSO作为冷冻保护剂、程控降温、液氮冷冻保存的相当。其主要优点为操作简便,费用低,便于普及。实验研究表明简化法冻存外周血干细胞5年后,BFU-E、CFU-GM的回收率无明显下降,细胞活性约为贮存前的80％。目前临床上推荐该方法用于短期(<1年)冻存造血干细胞。本文就其发展过程、作用机理、技术实施及应用现状作一介绍。