复合干扰素在毕赤酵母中的分泌表达、纯化及活性分析

目的 在毕赤酵母中高效分泌表达复合干扰素。方法 根据毕赤酵母密码子偏性合成了复合干扰素基因，克隆至分泌型酵母表达载体pMKX9K，线性化后转化毕赤酵母GS115，筛选高表达菌株。诱导后的培养上清经过离子交换，疏水层析，凝胶过滤三步层析纯化，用细胞病变抑制法测定其活性，并结合Iowry法蛋白定量计算其比活性。结果 SDS-PAGE分析显示，重组蛋白以可溶性分子的形式存在于上清液中，经纯化后纯度达到96％，其N端氨基酸序列与理论值一致，比活与干复津相当。结论 复合干扰素在毕赤酵母中获得高效分泌表达，为获得大量基因工程产品奠定了基础。     

猪卵透明带—3β融合蛋白在E.coli中的表达和鉴定

对全长猪卵透明带３β－（ｐＺＰ３β）ＤＮＡ的５′端重新测序分析，发现文献报道的该克隆基因５′端非编码序列中漏读了两个碱基，继而选择符合ｐＺＰ３βｃＤＮＡ阅读框的ｐＷＲ４５０－２载体质粒，通过双酶切构建了β－半乳糖苷酶／ｐＺＰ３β融合蛋白基因的细菌表达质粒。转化宿主菌后用ＩＰＴＧ诱导，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明ｐＺＰ３β融合蛋白在Ｅ．ｃｏｌｉ中获得表达，并在蛋白印迹鉴定中能同兔抗猪ＺＰ ＩｇＧ呈特异性     

人新型干扰素κ的基因克隆、表达、纯化及其抗病毒活性的初步研究

目的制备人干扰素κ(hIFNκ)并初步研究其生物学活性。方法克隆hIFNκ的cDNA并根据大肠埃希菌的密码子偏好性人工合成了hIFNκ基因,在大肠埃希菌DH5α中高效表达、纯化后测定了rhIFNκ的多种生物学活性,包括抗病毒活性、抗细胞增殖活性、种属特异性以及NK细胞调节活性。结果成功地获得了高纯度的rhIFNκ,纯度在90%以上。利用WISHVSV系统检测rhIFNκ的抗病毒活力为2.0×106IU/mg。与rhIFNα2b的比较发现,rhIFNκ无论在抗病毒活性、细胞生长抑制,还是在促NK细胞活性方面均弱于前者。结论rhIFNκ在不同种属来源细胞上的抗病毒活性因种属来源而异,不同的病毒对rhIFNκ的敏感性是不同的。     

胰高血糖素衍生物在大肠杆菌的克隆表达和纯化

 目的 通过基因工程途径获得胰高血糖素衍生物。 方法 根据胰高血糖素基因及凝血酶酶切位点序列，分段合成引物行 PCR 扩增，以 PCR 扩增得到的胰高血糖素-甘氨酸基因序列和 pET-30a 质粒转化 E.coli DH5α，获得重组质粒 pET-G。将重组质粒 pET-G 转化至 E.coli BL21(DE3)，重组菌株命名为 E.coli BL21[pET-G]。以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，对表达产物进行SDS-Tricine- PAGE[十二烷基硫酸钠-三（羟甲基）甲基甘氨酸-聚丙烯酰胺凝胶电泳]分析和蛋白质印迹分析。对表达产物行Ni2+-NTA亲和层析纯化、凝血酶酶切和高效液相色谱（HPLC）纯化后，行 SDS-Tricine-PAGE分析和飞行质谱分析，并以 ELISA 方法检测其免疫活性。 结果 PCR 扩增获得的条带与预期的DNA表达片段大小一致，重组质粒 pET-G 测序结果与预期完全一致。SDS- Tricine-PAGE 和蛋白质印迹分析显示 E.coli BL21（DE3）的表达产物相对分子质量与预期相符。经亲和层析纯化、凝血酶酶切和 HPLC 纯化后得到了完整的重组胰高血糖素-甘氨酸衍生物，SDS-Tricine-PAGE 分析显示其相对分子质量约为 3500，飞行质谱分析相对分子质量为 3531，二者基本一致。ELISA 检测表明重组胰高血糖素-甘氨酸衍生物具有胰高血糖素免疫活性。 结论 采用基因工程技术在大肠杆菌中成功表达了胰高血糖素-甘氨酸衍生物，为通过体外酰胺化途径研制酰胺化胰高血糖素奠定了基础。     

人IP-10融合蛋白表达载体的构建和表达及活性鉴定

目的：构建人His标记的IP-10 (interferon-γ-inducible protein 10)融合蛋白表达载体并在原核细胞中表达、纯化，获得有活性的IP-10蛋白，为进一步研究其在炎症过程中的作用机制及寻找新的抗炎途径提供基础。 方法： 从人肺cDNA文库中PCR扩增无信号肽的IP-10基因编码序列，构建重组载体pET-14b/IP-10；重组质粒经酶切、测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株；经异丙基β-D-硫代半乳糖（IPTG）诱导后，用镍离子亲和层析柱纯化融合蛋白，以THP-1细胞进行微室跨膜迁移（transwell）实验鉴定融合蛋白活性。 结果： 酶切、测序鉴定重组载体pET-14b/IP-10构建正确，并纯化得到高纯度的IP-10融合蛋白。而且该蛋白具有诱导单核细胞THP-1跨膜迁移活性。 结论： 成功构建了人IP-10融合蛋白表达载体，并纯化得到具有活性的IP-10融合蛋白，为进一步研究IP-10的功能提供了重要的实验材料。     

人La多肽融合蛋白在E.coli中的表达

目的　构建在E .coli中表达人La多肽的质粒。方法以人脾cDNA为模板 ,通过PCR获得La多肽 (全长 )的DNA片段。将此片段利用双酶切定向克隆到MBP(麦芽糖结合蛋白 )融合系统的载体pMALTM c中 ,表达可溶性融合蛋白 ,并通过亲和层析予以纯化。结果免疫印迹实验 (IBT)证明 ,表达的融合蛋白具有La抗原多肽的特异性 ,而敏感性超过生化制备的ENA制品。结论重组融合蛋白与天然ENA制品存在免疫学同一性     

两种具长效性重组人血清白蛋白／干扰素α融合蛋白表达工程菌的构建及融合蛋白的理化特性研究

目的对两种长效干扰素α融合蛋白原料药的理化特性多项指标开展分析和进行比较。方法利用基因工程技术分别构建了可高效表达重组人血清白蛋白／干扰素α2a融合蛋白（rHSA／IFNα2a）或重组人血清白蛋白,干扰素α2b融合蛋白（rHSA／IFNα2b）的毕赤酵母工程菌。融合蛋白直接分泌到组分简单的无机盐培养基中,并经特别建立的高效分离纯化工艺进行纯化,随后对两个融合蛋白进行详尽的理化特性分析。结果获得的融合蛋白纯度在98％以上;N端前15个氨基酸序列与理论序列相同;质谱分子量分别为85640．8D和85781．5D;圆二色光谱分析比对蛋白空间构象未变;等电点DI约在5．1左右;为非糖基化蛋白;紫外光谱呈典型蛋白质光谱;自由巯基含量测定值为1．4;肽图批次问一致;肽质量指纹图谱可匹配分别达83％和82％;对制备的2个融合蛋白原料药中的细菌内毒素、宿主蛋白质、外源性DNA、甲醇和甘油的残留量检测符合标准要求;融合蛋白的免疫学鉴别为阳性;体外细胞生物比活性约为2．5×10^5IU／mg,并且2个融合蛋白生物比活性测定值无不同,由此,获得了符合临床用药标准的原料药。结论研究所获得的结果可以作为指导《注射用重组人血清白蛋白／干扰素α2a融合蛋白》和《注射用重组人血清白蛋白／干扰素α2b融合蛋白》2个新药的原料药生产质量标准的建立和检定方法的确定。     

人血管抑素A K(1-3)基因的克隆表达、纯化及活性鉴定

目的 克隆人Angiostatin K(1-3)基因,获得有活性的重组人血管抑素蛋白,为进一步开发应用奠定基础.方法 以人新鲜肝脏组织为材料,通过RT-PCR得到人Angiustatin基因的AK(1-3)片段.构建重组质粒pET30a-Angiostatin,转化表达菌Rosetta(DE3),对转化子进行诱导表达,利用Ni-NTA亲和层析纯化目的 产物,并验证其活性.结果 获得了人Angiostatin基因AK(1-3)片段的正确序列,表达和纯化了人血管抑素蛋白,表达量占菌体总蛋白的30%,纯化后证明表达产物具有较高纯度(达到90%).结论 Anginstatin K(1-3)可在原核融合蛋白表达载体中表达,且得到有活性的目的 蛋白.     

人血管抑素A K(1-3)基因的克隆表达、纯化及活性鉴定

目的 克隆人Angiostatin K(1-3)基因,获得有活性的重组人血管抑素蛋白,为进一步开发应用奠定基础.方法 以人新鲜肝脏组织为材料,通过RT-PCR得到人Angiustatin基因的AK(1-3)片段.构建重组质粒pET30a-Angiostatin,转化表达菌Rosetta(DE3),对转化子进行诱导表达,利用Ni-NTA亲和层析纯化目的 产物,并验证其活性.结果 获得了人Angiostatin基因AK(1-3)片段的正确序列,表达和纯化了人血管抑素蛋白,表达量占菌体总蛋白的30%,纯化后证明表达产物具有较高纯度(达到90%).结论 Anginstatin K(1-3)可在原核融合蛋白表达载体中表达,且得到有活性的目的 蛋白.     

人血管抑素A K(1-3)基因的克隆表达、纯化及活性鉴定

目的 克隆人Angiostatin K(1-3)基因,获得有活性的重组人血管抑素蛋白,为进一步开发应用奠定基础.方法 以人新鲜肝脏组织为材料,通过RT-PCR得到人Angiustatin基因的AK(1-3)片段.构建重组质粒pET30a-Angiostatin,转化表达菌Rosetta(DE3),对转化子进行诱导表达,利用Ni-NTA亲和层析纯化目的 产物,并验证其活性.结果 获得了人Angiostatin基因AK(1-3)片段的正确序列,表达和纯化了人血管抑素蛋白,表达量占菌体总蛋白的30%,纯化后证明表达产物具有较高纯度(达到90%).结论 Anginstatin K(1-3)可在原核融合蛋白表达载体中表达,且得到有活性的目的 蛋白.     

人血管抑素A K(1-3)基因的克隆表达、纯化及活性鉴定

目的 克隆人Angiostatin K(1-3)基因,获得有活性的重组人血管抑素蛋白,为进一步开发应用奠定基础.方法 以人新鲜肝脏组织为材料,通过RT-PCR得到人Angiustatin基因的AK(1-3)片段.构建重组质粒pET30a-Angiostatin,转化表达菌Rosetta(DE3),对转化子进行诱导表达,利用Ni-NTA亲和层析纯化目的 产物,并验证其活性.结果 获得了人Angiostatin基因AK(1-3)片段的正确序列,表达和纯化了人血管抑素蛋白,表达量占菌体总蛋白的30%,纯化后证明表达产物具有较高纯度(达到90%).结论 Anginstatin K(1-3)可在原核融合蛋白表达载体中表达,且得到有活性的目的 蛋白.     

人血管抑素A K(1-3)基因的克隆表达、纯化及活性鉴定

目的 克隆人Angiostatin K(1-3)基因,获得有活性的重组人血管抑素蛋白,为进一步开发应用奠定基础.方法 以人新鲜肝脏组织为材料,通过RT-PCR得到人Angiustatin基因的AK(1-3)片段.构建重组质粒pET30a-Angiostatin,转化表达菌Rosetta(DE3),对转化子进行诱导表达,利用Ni-NTA亲和层析纯化目的 产物,并验证其活性.结果 获得了人Angiostatin基因AK(1-3)片段的正确序列,表达和纯化了人血管抑素蛋白,表达量占菌体总蛋白的30%,纯化后证明表达产物具有较高纯度(达到90%).结论 Anginstatin K(1-3)可在原核融合蛋白表达载体中表达,且得到有活性的目的 蛋白.     

人血管抑素A K(1-3)基因的克隆表达、纯化及活性鉴定

目的 克隆人Angiostatin K(1-3)基因,获得有活性的重组人血管抑素蛋白,为进一步开发应用奠定基础.方法 以人新鲜肝脏组织为材料,通过RT-PCR得到人Angiustatin基因的AK(1-3)片段.构建重组质粒pET30a-Angiostatin,转化表达菌Rosetta(DE3),对转化子进行诱导表达,利用Ni-NTA亲和层析纯化目的 产物,并验证其活性.结果 获得了人Angiostatin基因AK(1-3)片段的正确序列,表达和纯化了人血管抑素蛋白,表达量占菌体总蛋白的30%,纯化后证明表达产物具有较高纯度(达到90%).结论 Anginstatin K(1-3)可在原核融合蛋白表达载体中表达,且得到有活性的目的 蛋白.     

人血管抑素A K(1-3)基因的克隆表达、纯化及活性鉴定

目的 克隆人Angiostatin K(1-3)基因,获得有活性的重组人血管抑素蛋白,为进一步开发应用奠定基础.方法 以人新鲜肝脏组织为材料,通过RT-PCR得到人Angiustatin基因的AK(1-3)片段.构建重组质粒pET30a-Angiostatin,转化表达菌Rosetta(DE3),对转化子进行诱导表达,利用Ni-NTA亲和层析纯化目的 产物,并验证其活性.结果 获得了人Angiostatin基因AK(1-3)片段的正确序列,表达和纯化了人血管抑素蛋白,表达量占菌体总蛋白的30%,纯化后证明表达产物具有较高纯度(达到90%).结论 Anginstatin K(1-3)可在原核融合蛋白表达载体中表达,且得到有活性的目的 蛋白.     

人血管抑素A K(1-3)基因的克隆表达、纯化及活性鉴定

目的 克隆人Angiostatin K(1-3)基因,获得有活性的重组人血管抑素蛋白,为进一步开发应用奠定基础.方法 以人新鲜肝脏组织为材料,通过RT-PCR得到人Angiustatin基因的AK(1-3)片段.构建重组质粒pET30a-Angiostatin,转化表达菌Rosetta(DE3),对转化子进行诱导表达,利用Ni-NTA亲和层析纯化目的 产物,并验证其活性.结果 获得了人Angiostatin基因AK(1-3)片段的正确序列,表达和纯化了人血管抑素蛋白,表达量占菌体总蛋白的30%,纯化后证明表达产物具有较高纯度(达到90%).结论 Anginstatin K(1-3)可在原核融合蛋白表达载体中表达,且得到有活性的目的 蛋白.     

人血管抑素A K(1-3)基因的克隆表达、纯化及活性鉴定

目的 克隆人Angiostatin K(1-3)基因,获得有活性的重组人血管抑素蛋白,为进一步开发应用奠定基础.方法 以人新鲜肝脏组织为材料,通过RT-PCR得到人Angiustatin基因的AK(1-3)片段.构建重组质粒pET30a-Angiostatin,转化表达菌Rosetta(DE3),对转化子进行诱导表达,利用Ni-NTA亲和层析纯化目的 产物,并验证其活性.结果 获得了人Angiostatin基因AK(1-3)片段的正确序列,表达和纯化了人血管抑素蛋白,表达量占菌体总蛋白的30%,纯化后证明表达产物具有较高纯度(达到90%).结论 Anginstatin K(1-3)可在原核融合蛋白表达载体中表达,且得到有活性的目的 蛋白.     

人血管抑素A K(1-3)基因的克隆表达、纯化及活性鉴定

目的 克隆人Angiostatin K(1-3)基因,获得有活性的重组人血管抑素蛋白,为进一步开发应用奠定基础.方法 以人新鲜肝脏组织为材料,通过RT-PCR得到人Angiustatin基因的AK(1-3)片段.构建重组质粒pET30a-Angiostatin,转化表达菌Rosetta(DE3),对转化子进行诱导表达,利用Ni-NTA亲和层析纯化目的 产物,并验证其活性.结果 获得了人Angiostatin基因AK(1-3)片段的正确序列,表达和纯化了人血管抑素蛋白,表达量占菌体总蛋白的30%,纯化后证明表达产物具有较高纯度(达到90%).结论 Anginstatin K(1-3)可在原核融合蛋白表达载体中表达,且得到有活性的目的 蛋白.     

人血管抑素A K(1-3)基因的克隆表达、纯化及活性鉴定

目的 克隆人Angiostatin K(1-3)基因,获得有活性的重组人血管抑素蛋白,为进一步开发应用奠定基础.方法 以人新鲜肝脏组织为材料,通过RT-PCR得到人Angiustatin基因的AK(1-3)片段.构建重组质粒pET30a-Angiostatin,转化表达菌Rosetta(DE3),对转化子进行诱导表达,利用Ni-NTA亲和层析纯化目的 产物,并验证其活性.结果 获得了人Angiostatin基因AK(1-3)片段的正确序列,表达和纯化了人血管抑素蛋白,表达量占菌体总蛋白的30%,纯化后证明表达产物具有较高纯度(达到90%).结论 Anginstatin K(1-3)可在原核融合蛋白表达载体中表达,且得到有活性的目的 蛋白.     

人免疫缺陷病毒1(HIV-1)膜蛋白基因片段在酵母中的克隆表达

目的为获得足够量的膜糖蛋白,以便于对不同ＨＩＶ分离株膜糖蛋白的结构与功能进行进一步的研究。方法从人免疫缺陷病毒１（ＨＩＶ－１）ＨＸＢ２分离株原病毒基因组的重组质粒ｐＨＸＢ２中克隆了两段膜糖蛋白基因（ＥＮＶ）片段。以酵母穿梭诱导表达质粒ｐＹＥＳ２为载体,构建了两个相应的重组表达质粒ｐＹＥＮＶ１和ｐＹＥＮＶ２;进一步利用大肠杆菌β－半乳糖苷酶基因（β－ｌａｃＺ）构建了ＨＩＶ－１膜外糖蛋白ＤＮＡ片段与β－ｌａｃＺ基因的融合表达质粒。将此３种质粒分别转化单细胞真核生物酿酒酵母ＢＪ１９９１,得到的转化子经半乳糖诱导表达后进行菌体全蛋白的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。结果克隆的基因片段在酿酒酵母中产生了分子质量为５０×１０３的特异性诱导蛋白;对含此融合表达质粒的酵母转化子半乳糖诱导后表达产物的免疫检测表明,与对照菌株相比,融合表达产物具有和ＨＩＶ－１阳性血清抗体反应的抗原性。结论可通过β－半乳糖苷酶活性的测定直接指示抗原片段的表达;为表达的膜糖蛋白片段的进一步分离纯化打下了一定基础