诱导转化人关节软骨细胞Ⅱ型胶原表型的有效方式

背景诱导去分化软骨细胞重新表达Ⅱ型胶原主要基于软琼脂悬浮培养法.目的用离心管聚集体培养(aggregate culture)诱导去分化转化人关节细胞的Ⅱ型胶原.设计非随机非对照实验研究.地点和对象实验在第三军医大学西南医院骨科完成,对象为转化人关节软骨细胞,美国Hyclone公司产品.干预将体外长期培养的第30,40,50代去分化转化软骨细胞消化后进行离心管培养,比较细胞在单层培养、离心管聚集体培养,以及在普通培养基,BAI诱导培养基下[2型骨形态发生蛋白(BMP-2)+抗坏血酸盐+胰岛素],Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ型胶原的表达和胞外基质产生情况.主要观察指标Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ型胶原的免疫组化染色,Ⅱ型胶原的m RNA表达.结果在单层培养条件下,去分化转化软骨细胞只表达Ⅰ型胶原,而在BAI诱导培养基及离心管聚集体培养下该转化软骨细胞表达丰富的Ⅱ型胶原和大量胞外基质.结论离心管聚集体培养和BAI诱导培养基是诱导去分化转化软骨细胞Ⅱ型胶原的有效方式.     

转化生长因子β2诱导鼠脂肪间充质干细胞向软骨细胞的分化

背景:转化生长因子β1对骨髓间充质干细胞成骨和成软骨的促分化作用已被广泛证实.目的:假设转化生长因子β2可在体外诱导鼠脂肪间充质干细胞向成软骨细胞分化,实验拟验证其可行性.设计、时间及地点:体外细胞学实验,于2007-03/11在北京大学第三医院中心实验室完成.材料:清洁级3周龄雄性Lewis大鼠24只,用于分离培养脂肪间允质干细胞.方法:取第2代脂肪间充质于细胞,通过10μg/L外源性转化生长因子β2以离心管内微团培养、单层培养两种方式向软骨细胞进行诱导分化,培养3周.对照组单纯加入基础培养液.主要观察指标:两种湾导方式下细胞(团)形态结构的变化、Ⅱ型胶原免疫组织化学检测结果、软骨细胞特异性基因Ⅱ型胶原和aggrecan mRNA的表达.结果:微团培养诱导的脂肪间充质干细胞组织块经苏木精.伊红染色显示在组织内部形成类似软骨陷窝样结构,阿尔新蓝染色呈强阳性,Ⅱ型胶原免疫组化结果显示有棕褐色强阳性颗粒,RT-PCR检测到Ⅱ型胶原和Aggrecan mRNA的表达.单层培养诱导的脂肪间充质干细胞无细胞外软骨基质分泌,未发现Ⅱ型胶原蛋白和Aggrecan mRNA的表达.结论:在离心管内微团培养方式下,转化生长因子β2可以启动或促进脂肪间充质干细胞的软骨分化,且分泌软骨细胞特异性基质.简单的单层培养方式诱导失败.     

完全脱钙骨基质与骨髓间充质干细胞体外诱导构建组织工程纤维软骨

背景：含有骨形态发生蛋白的完全脱钙骨基质可使骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化并维持其软骨细胞的特性,在软骨发生过程中发挥重要作用。目的：将骨髓间充质干细胞与完全脱钙骨基质在体外诱导培养成纤维软骨组织以及观察培养体系与支架材料对细胞凋亡的影响。方法：采用全骨髓培养法分离培养猪骨髓间充质干细胞,取第1代骨髓间充质干细胞均匀接种到完全脱钙骨基质上,以含有转化生长因子β1、胰岛素样生长因子、地塞米松、抗坏血酸及体积分数10%FBS的高糖DMEM诱导培养液培养作为实验组,将单层诱导培养、单层基础培养的骨髓间充质干细胞、空白完全脱钙骨基质作为对照,于培养第1,2,3,4周进行大体形态观察以及Ⅰ、Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖的RT-PCR定性检测;培养4周进行细胞凋亡检测。结果与结论：实验组可检测到Ⅰ型胶原的持续表达,Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖表达逐渐增加。单层诱导培养组可检测到Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖的表达及Ⅰ型胶原的持续表达,但表达量远低于实验组;实验组细胞凋亡率高于单层诱导培养组、单层基础培养组。说明转化生长因子β1、胰岛素样生长因子1体外诱导培养的骨髓间充质干细胞-完全脱钙骨基质可以表达特异性软骨基质,三维环境培养细胞外基质的表达量明显高于单层诱导培养;静态培养系统对三维培养的细胞凋亡有影响。     

藻酸钠凝胶三维培养条件下胰岛素样生长因子Ⅰ对兔关节软骨细胞表型的影响

目的:观察胰岛素样生长因子Ⅰ对藻酸盐凝胶三维培养条件下兔关节软骨细胞表型的影响。方法:实验于2004-10/2006-10在上海长海医院血管外科实验室完成。实验材料:4周龄雄性新西兰兔6只。实验方法:利用机械与酶消化的方法获得均一的兔关节软骨细胞,在单层培养条件下将软骨细胞增殖至P2代;将P2代细胞高密度条件下转入藻酸盐凝胶培养介质,进行三维培养。细胞培养分组:①不含胰岛素样生长因子Ⅰ三维培养。②含50μg/L胰岛素样生长因子Ⅰ三维培养组。③单层培养。实验评估:①三维培养细胞于培养的2,4,6周行冰冻切片苏木精-伊红染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学检测。②单层培养细胞每传代1次行细胞爬片苏木精-伊红染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学检测。结果:①细胞学外观形态变化:两组藻酸盐凝胶三维培养体系中的软骨细胞在6周的培养过程中始终保持了圆形的细胞外观。单层培养软骨细胞在第5代以前,均保持了星形及多角形的正常软骨细胞外观。②免疫组织化学显示结果:培养6周后,含胰岛素样生长因子Ⅰ三维培养软骨细胞特异性Ⅱ型胶原细胞仍呈强阳性染色,表达水平较转入三维体系前未见降低,培养细胞保持了良好的分化表型。单层培养软骨细胞在第5代以前,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色为阳性。第6代以后,大部分细胞呈梭形,向成纤维细胞转化,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色为阴性。结论:胰岛素样生长因子Ⅰ对藻酸盐三维培养条件下的关节软骨细胞表型具有维持作用。     

鹿茸多肽诱导骨髓间充质干细胞体外向软骨表型的分化

背景：实验证实鹿茸多肽可以促进体外培养软骨细胞的增殖和细胞外基质糖胺多糖、Ⅱ型胶原、Aggrecan蛋白的表达。目的：通过对体外培养的兔骨髓间充质干细胞在特定培养液作用下向软骨细胞表型分化的研究,探讨鹿茸多肽对其软骨分化的影响。方法：将第3代兔骨髓间充质干细胞随机分为空白对照组、诱导组、鹿茸多肽组,分别采用普通培养液、诱导培养液、含10mg/L鹿茸多肽的诱导培养液于离心管内进行培养;并取兔的关节软骨细胞作为关节软骨组。分别于1,2,3周后取材,通过组织学、生物化学和RT-PCR技术,对离心管内构建的软骨组织进行形态学和细胞功能状态的观察。结果与结论：空白对照组培养2周后,细胞团块逐渐崩解,无法进行苏木精-伊红染色。诱导组、鹿茸多肽组细胞团块除有轻度收缩外,呈白色半透明状;苏木精-伊红染色发现部分细胞为圆形或卵圆形,表层细胞密度大;诱导组、鹿茸多肽组糖胺多糖含量及Ⅱ型胶原mRNA表达随培养时间延长而增多,各时间点诱导组、鹿茸多肽组含量均高于空白对照组（P〈0.05）;各时间点鹿茸多肽组糖胺多糖含量及Ⅱ型胶原mRNA表达均高于诱导组,但低于关节软骨组（P〈0.05）。提示骨髓间充质干细胞在特定培养条件下能向软骨细胞表型分化,且鹿茸多肽对其定向软骨分化有明显促进作用。虽然在体外可以构建出软骨组织,但其与关节软骨质量相比仍有很大差距。     

藻酸钙微载体培养胎儿关节软骨细胞

目的 观察胎儿关节软骨细胞在藻酸钙微载体培养中的特征，探计用藻酸钙微载体培养胎儿关节软骨细胞的优缺点。方法 用藻酸钙微载体和体外单层培养法培养胎儿关节软骨细胞，观察细胞形态学变化，测定细胞数量变化及其生长曲线，观察细胞增殖；借助免疫组织化学的方法了解细胞Ⅱ型胶原的合成情况。结果 体外单层培养的胎儿关节软骨细胞传至第5代已出现明显的反分化，多数细胞变为成纤维细胞状，合成Ⅱ型胶原的能力明显减弱；而用藻酸钙微载体培养的软骨细胞3个月后仍瓮中保持有旺盛的合成Ⅱ型胶原的能力。结论 用藻酸钙微载体培养胎儿关节软骨细胞可较长时间保持其表型及合成基质能力，防止反分化的发生。     

完全脱钙骨基质与骨髓间充质干细胞体外诱导构建组织工程纤维软骨

背景:含有骨形态发生蛋白的完全脱钙骨基质可使骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化并维持其软骨细胞的特性,在软骨发生过程中发挥重要作用.目的:将骨髓间充质干细胞与完全脱钙骨基质在体外诱导培养成纤维软骨组织以及观察培养体系与支架材料对细胞凋亡的影响.方法:采用全骨髓培养法分离培养猪骨髓间充质干细胞,取第1代骨髓间充质干细胞均匀接种到完全脱钙骨基质上,以含有转化生长因子β1、胰岛素样生长因子、地塞米松、抗坏血酸及体积分数10%FBS的高糖DMEM诱导培养液培养作为实验组,将单层诱导培养、单层基础培养的骨髓间充质干细胞、空白完全脱钙骨基质作为对照,于培养第1,2,3,4周进行大体形态观察以及Ⅰ、Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖的RT-PCR定性检测;培养4周进行细胞凋亡检测.结果与结论:实验组可检测到Ⅰ型胶原的持续表达,Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖表达逐渐增加.单层诱导培养组可检测到Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖的表达及Ⅰ型胶原的持续表达,但表达量远低于实验组;实验组细胞凋亡率高于单层诱导培养组、单层基础培养组.说明转化生长因子β1、胰岛素样生长因子1体外诱导培养的骨髓间充质干细胞-完全脱钙骨基质可以表达特异性软骨基质,三维环境培养细胞外基质的表达量明显高于单层诱导培养;静态培养系统对三维培养的细胞凋亡有影响.     

Ⅰ型胶原三维立体支架高密度培养软骨细胞的增殖及其分泌功能

目的：观察体外Ⅰ型胶原三维立体支架培养软骨细胞形态、增殖能力及Ⅱ型胶原表达的变化，并与单层培养结果相比较。方法：实验于2004—09／12在中山大学附属第三医院中心实验室完成。选择2周龄健康雄性一级新西兰大白兔1只，体质量0．5kg。体外分离兔双侧股骨髁关节软骨细胞后行单层贴壁培养，细胞铺满单层后，分别将细胞悬液按2&;#215;10^6／L，2&;#215;10^7／L，2&;#215;10^8／L密度传代培养。选择生长状态良好的第2，3代细胞置于Ⅰ型胶原三维立体支架培养。分别通过相差倒置显微镜、流式细胞仪、电镜检查以及组织学染色及免疫组织化学染色，分析软骨细胞的表型、增殖速度等生物学性状变化情况。结果：①单层培养随着时间的延长，增殖速度逐渐减慢，第6代细胞增殖能力较第2代明显下降，出现树突状的细胞突起，表现出细胞老化的趋势。分泌Ⅱ型胶原的能力也逐渐减低，第2代细胞Ⅱ型胶原免疫组化染色胞浆内呈阳性反应，至第6代呈阴性。在以低密度传代培养时上述过程出现较快，而以高密度传代培养时软骨细胞形态改变延迟。②在Ⅰ型胶原三维立体支架中培养时，软骨细胞大量增殖，能维持其细胞表型及分泌Ⅱ型胶原的功能。扫描电镜观察到软骨细胞成团吸附于支架孔隙网壁，说明支架吸附性良好，与软骨细胞相容性好。结论：软骨细胞在体外单层培养会失去细胞表型，不能分泌Ⅱ型胶原，高密度培养能减缓该过程。而在Ⅰ型胶原三维立体支架中培养，有利于维持软骨细胞的表型及分泌Ⅱ型胶原的功能。因此，建议采用在三维立体支架内高密度培养软骨细胞，构建有功能的组织工程软骨。     

兔脂肪干细胞在含有转化因子和转铁蛋白培养基中向软骨细胞的分化

背景：成软骨的种子细胞的选择是软骨组织工程研究中的关键因素。目的：观察脂肪干细胞在含有转化因子和转铁蛋白诱导条件下向软骨细胞分化的能力。方法：取新西兰大白兔颈背部脂肪组织,机械分离及酶消化法获得脂肪干细胞,显微镜下观察细胞黏附及生长情况;加入含有转化因子β1和转铁蛋白的诱导培养基培养2周后以免疫组化方法检测Ⅱ型胶原的表达。结果与结论：从兔脂肪组织中分离出的干细胞原代培养时24h贴壁,96h后达80%融合;于软骨诱导培养基内向软骨诱导7d后形成软骨结节,14d后Ⅱ型胶原免疫组化阳性。结果初步表明兔脂肪干细胞经诱导后可以向软骨细胞分化。     

原代培养小鼠关节软骨细胞的分化与诱导

背景:传统培养方法体外培养的软骨细胞经长时间传代培养后往往去分化为成纤维细胞,导致细胞数量及活性下降.如何避免培养过程中的去分化问题,是模拟体内软骨内成骨软骨发育过程的关键.目的:课题创新性提出以Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶结合消化法体外培养扩增C57BL/6小鼠关节软骨细胞并诱导其向更成熟肥大软骨细胞或终末分化软骨细胞分化.设计、时间及地点:细胞学体外观察实验,于2008-09/12在解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所全军战创伤中心,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室完成.材料:C57BL/6品系新生小鼠9只.方法:采用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶结合消化法分离培养C57BL/6新生小鼠关节软骨细胞,细胞计数法绘制细胞生长曲线,RT-PCR检测Ⅱ型胶原进行鉴定.当细胞90%融合时以含5.5mg/L人转铁蛋白,3×10<'-8> mol/L亚硒酸钠,10mg/L牛胰岛素的ITS诱导培养基进行分化诱导.主要观察指标:诱导0,7 d,阿利新蓝染色检测软骨细胞分泌基质中的葡萄糖胺聚糖,von Kossa染色检测软骨细胞钙化结节形成情况,实时定量PCR检测Ⅱ型胶原、X型胶原及基质金属蛋白酶13的表达进行鉴定.结果:原代培养细胞24 h贴壁,呈三角或多角形,培养4～6 d进入快速增殖期,RT-PCR检测到Ⅱ型胶原的表达,证实获得大量高纯度、高活性的软骨细胞.诱导0 d,细胞单层铺满培养皿底面,无聚集现象;诱导7 d明显可见由软骨细胞聚集形成的软骨小结.与诱导0 d时相比,诱导7 d阿利新蓝染色示软骨细胞分泌基质中的葡萄糖胺聚糖染色呈阳性,可见明显的软骨小结,Ⅱ型胶原及基质金属蛋白酶13表达明显增高,且钙化结节明显增多.结论:采用胰蛋白酶和胶原酶结合消化法获得大量高纯度、高活性的软骨细胞.ITS诱导体系有效地促进了软骨细胞成熟及终末分化,较成功模拟了软骨内成骨的软骨发育过程.     

鹿茸多肽诱导骨髓间充质干细胞体外向软骨表型的分化

背景:实验证实鹿茸多肽可以促进体外培养软骨细胞的增殖和细胞外基质糖胺多糖、Ⅱ型胶原、Aggrecan蛋白的表达.目的:通过对体外培养的兔骨髓间充质干细胞在特定培养液作用下向软骨细胞表型分化的研究,探讨鹿茸多肽对其软骨分化的影响.方法:将第3代兔骨髓间充质干细胞随机分为空白对照组、诱导组、鹿茸多肽组,分别采用普通培养液、诱导培养液、含10 mg/L鹿茸多肽的诱导培养液于离心管内进行培养;并取兔的关节软骨细胞作为关节软骨组.分别于1,2,3周后取材,通过组织学、生物化学和RT-PCR技术,对离心管内构建的软骨组织进行形态学和细胞功能状态的观察.结果与结论:空白对照组培养2周后,细胞团块逐渐崩解,无法进行苏木精-伊红染色.诱导组、鹿茸多肽组细胞团块除有轻度收缩外,呈白色半透明状;苏木精-伊红染色发现部分细胞为圆形或卵圆形,表层细胞密度大;诱导组、鹿茸多肽组糖胺多糖含量及Ⅱ型胶原mRNA表达随培养时间延长而增多,各时间点诱导组、鹿茸多肽组含量均高于空白对照组(P < 0.05);各时间点鹿茸多肽组糖胺多糖含量及Ⅱ型胶原mRNA表达均高于诱导组,但低于关节软骨组 (P < 0.05).提示骨髓间充质干细胞在特定培养条件下能向软骨细胞表型分化,且鹿茸多肽对其定向软骨分化有明显促进作用.虽然在体外可以构建出软骨组织,但其与关节软骨质量相比仍有很大差距.     

骨髓间质干细胞体外分化软骨细胞的实验研究

目的：应用转化型生长因子TGF-β1，体外诱导骨髓间质干细胞（MSCs）向成软骨细胞表型分化，探讨其作为组织工程化软骨种子细胞的可行性。方法：由大鼠骨髓中分离出MSCs，体外传代培养，取第3代细胞通过TGF-β1、地塞米松和维生素C诱导向软骨细胞分化。诱导后14d观察细胞形态变化，进行阿辛蓝染色检测软骨基质的分泌、免疫组化检测细胞Ⅱ型胶原的表达。采用Western-blot和RT-PCR检测诱导前后成软骨相关的SOX9、蛋白聚糖与Ⅱ型胶原的表达。结果：诱导后阿辛蓝染色示糖胺聚糖均匀分布于基质中，免疫组化染色示基质中Ⅱ型胶原表达阳性。RT-PCR检测示成软骨相关的SOX9、蛋白聚糖、Ⅱ型腔原mRNA表达阳性。Western-blot印迹检测示细胞诱导后Ⅱ型胶原蛋白表达阳性。结论：MSCs在特定培养液的诱导下可向软骨细胞表型分化．并能分泌软骨细胞特异性基质．可成为软骨组织工程理想的种子细胞来源。     

藻酸钙微载体培养胎儿关节软骨细胞

目的观察胎儿关节软骨细胞在藻酸钙微载体培养中的特征,探讨用藻酸钙微载体培养胎儿关节软骨细胞的优缺点。方法用藻酸钙微载体和体外单层培养法培养胎儿关节软骨细胞,观察细胞形态学变化,测定细胞数量变化及其生长曲线,观察细胞增殖;借助免疫组织化学的方法了解细胞II型胶原的合成情况。结果体外单层培养的胎儿关节软骨细胞传至第5代已出现明显的反分化,多数细胞变为成纤维细胞状,合成II型胶原的能力明显减弱;而用藻酸钙微载体培养的软骨细胞3个月后仍保持有旺盛的合成Ⅱ型胶原的能力。结论用藻酸钙微载体培养胎儿关节软骨细胞可较长时间保持其表型及合成基质能力,防止反分化的发生。     

人软骨细胞培养上清诱导脐血间充质干细胞向软骨细胞分化

背景：人脐血间充质干细胞作为软骨缺损修复的种子细胞日益受到关注,现有常用诱导方法无论是应用诱导培养基还是诱导因子,因其价格昂贵、用量大等因素限制了实际应用。
　　目的：验证人软骨细胞培养上清诱导人脐血间充质干细胞向软骨细胞分化的可行性。
　　方法：利用密度梯度离心法和贴壁培养法分离新生儿脐血,获取并培养人脐血间充质干细胞,流式细胞仪鉴定细胞表面抗原。切取股骨头置换或全髋关节置换患者透明软骨组织,体外分离培养软骨细胞,利用其培养上清培养人脐血间充质干细胞,培养2周后观察细胞表型外观变化,免疫组化染色检测Ⅱ型胶原表达结果。
　　结果与结论：密度梯度离心法与贴壁培养法可以分离获取人脐血间充质干细胞,流式细胞仪鉴定表面标记CD90,CD105高表达,不表达CD34,CD45。软骨细胞培养上清诱导2周后,人脐血间充质干细胞向多角形、圆形转变,Ⅱ型胶原免疫组化检测表达阳性。提示软骨细胞培养上清可诱导人脐血间充质干细胞表达Ⅱ型胶原,向软骨细胞分化。     

兔骨髓间充质干细胞体外培养定向诱导分化为软骨细胞

背景：骨髓间充质干细胞具有分化为骨、软骨、肌腱、脂肪等组织的多分化潜能。目的：体外培养兔骨髓间充质干细胞并定向诱导分化为软骨细胞,探讨体外诱导分化为软骨的方法和条件。方法：取兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,碱性成纤维生长因子体外培养后,取第3代细胞在培养基中添加不同质量浓度转化生长因子β1的软骨分化诱导剂,2周后倒置显微镜观察细胞形态,甲苯胺蓝染色,RT-PCR技术检测Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达。结果与结论：可以从兔骨髓中培养出骨髓间充质干细胞,碱性成纤维生长因子能明显的促进骨髓间充质干细胞增殖。经软骨诱导分化后骨髓间充质干细胞呈软骨细胞形态,甲苯胺蓝染色阳性,Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达阳性。10μg/L的转化生长因子β1诱导成软骨分化能力最强。     

兔关节软骨细胞在藻酸盐串珠中培养维持其表型稳定的研究

目的：软骨细胞在单层培养时，多次传代后细胞表型发生改变。将兔关节软骨细胞在藻酸盐串珠中作立体培养，以保持其特有表型。方法：用酶消化法获取兔关节软骨细胞，分别在普通培养瓶中作贴壁的单层培养，并传代；或制成细胞/藻酸盐悬液，再进一步制成串珠，使细胞在具有三维立体结构的串珠中生长、繁殖。细胞涂片、石蜡切片，受尔新蓝染色，采用倒置微镜、透射电镜观察；以RT-PCR方法检测软骨细胞中Ⅱ型胶原及凝集聚糖mRNA的表达。结果：单层培养时有较高的细胞增殖率，5代以后渐失去软骨细胞特有的表型。立体培养时细胞分泌的基质大部分位于自身的周围，特有表型可长期保持稳定。3个月后藻酸盐串珠中的软骨细胞仍可测得Ⅱ型胶原和凝集聚糖的表达。结论：软骨细胞在藻酸盐串珠中培养有助于其合成、分泌基质，维持细胞特有表型的稳定。     

体外定向诱导鹿茸间充质干细胞向软骨细胞的分化

目的：间充质干细胞的诱导分化的研究多见于骨髓、脐血等组织，而在鹿茸组织中分离的间充质干细胞是否能诱导为软骨细胞目前尚不清楚。实验拟建立梅花鹿鹿茸生长中心间充质干细胞体外培养方法，观察转化生长因子β1体外诱导鹿茸间充质细胞分化为软骨细胞的可行性。 方法：实验于2006—03／2007—06在吉林大学畜牧兽医学院基础兽医研究室完成。①实验材料：4岁龄健康雄性梅花鹿由中国农科院左家特产研究所提供，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：于生长早期锯取梅花鹿鹿茸，在解剖显微镜下定位和切取间质层（突起部），即为鹿茸间充质干细胞所在的组织层。Ⅰ型胶原酶消化法原代分离培养鹿茸生长中心间充质干细胞，锥虫蓝染色显示细胞活性达90％以上，将活性确定后的细胞液氮冻存。取第3代细胞，用含10％胎牛血清以及10μg／L转化生长因子β1的条件培养基诱导培养。③实验评估：培养12d后于倒置显微镜下观察细胞形态，采用细胞化学及免疫细胞化学鉴定细胞。 结果：①鹿茸生长中心间充质干细胞的分离与培养：Ⅰ型胶原酶消化法培养可以获得均一的间充质干细胞，贴壁的间充质干细胞形态均匀，呈长梭形，克隆样生长，增殖迅速。②转化生长因子β1体外定向诱导鹿茸间充质细胞分化为软骨细胞：转化生长因子β1诱导分化的鹿茸间充质细胞生长迅速，诱导后细胞形态明显改变，呈典型的软骨细胞形态，甲苯胺蓝染色阳性，Ⅱ型胶原表达阳性。 结论：采用酶消化法可以从鹿茸生长中心间充质层中分离出间充质干细胞，在体外转化生长因子β1具有促进鹿茸生长中心间充质干细胞分化为软骨细胞的能力。     

脂肪干细胞在体外特定培养液中向软骨细胞表型的分化

目的:应用转化生长因子β1,体外诱导脂肪干细胞向成软骨细胞表型分化,探讨其作为组织工程化软骨种子细胞的可行性。方法:实验于2005-04/2006-06在华中科技大学同济医学院公卫实验室完成。①取大鼠腹股沟处脂肪,酶消化法分离、培养脂肪干细胞,体外传代培养。②取第3代细胞通过转化生长因子β1、地塞米松和维生素C诱导脂肪干细胞向软骨细胞分化。③诱导后14d观察细胞形态变化,进行阿辛蓝染色检测软骨基质的分泌、免疫组织化学检测细胞Ⅱ型胶原的表达,采用Western-blot和反转录-聚合酶链反应检测诱导前后成软骨相关的Sox9,蛋白聚糖与Ⅱ型胶原的表达。结果:①细胞接种的最初几日,细胞呈圆形,1周后贴壁细胞呈长梭形,体积增大;14d后贴壁生长细胞基本长满单层,中心细胞排列紧密,形态与骨髓间充质干细胞相似。诱导培养后,细胞形态逐渐由梭型向多角形、多边形转变。诱导14d后多数细胞呈平坦的多边角形状细胞;其夹杂多角突起状或多角纺锤状细胞。②诱导后阿辛蓝染色示糖胺聚糖均匀分布于基质中。③免疫组织化学染色示基质中Ⅱ型胶原表达阳性。④反转录-聚合酶链反应检测成软骨相关的Sox9、蛋白聚糖、Ⅱ型胶原mRNA表达阳性。⑤Western-blot印迹检测细胞诱导后Ⅱ型胶原蛋白表达阳性。结论:脂肪干细胞在特定培养液的诱导下可向成软骨细胞表型分化,并能分泌软骨细胞特异性基质,有望成为软骨组织工程新的细胞来源。     

海藻酸钠三维培养SW1353人软骨瘤细胞株:表型标志物Ⅱ型胶原的生物动力学特征及超微定位

背景:软骨细胞在体外单层培养的去分化改变及其来源困难是目前软骨细胞研究领域中的两大难题,目前关于SW1353人软骨瘤细胞表型和生物学特点及三维培养的相关报道较少.目的:观察SW1353人软骨瘤细胞在海藻酸钠三维培养体系中表型标志物Ⅱ型胶原的生物动力学及超微定位特点.设计、时间及地点:材料-细胞学体外观察,于2004-08/2006-01在中南大学湘雅医学院完成.材料:SW1353人软骨瘤细胞株由ATCC公司提供.方法:细胞复苏后接种,加入含胎牛血清、维生素C的DMEM培养基进行单层贴壁培养.离心后将细胞团块悬浮于低黏性海藻酸钠溶液中,细胞终浓度为2×10~9 L~(-1),滴入凝胶溶液,聚化获得细胞凝珠,每个凝珠约含20 000个细胞.藻酸盐凝胶三维体系培养8周后,柠檬酸钠分解凝胶,收获培养的软骨细胞及上清,并与单层培养的细胞进行比较.主要观察指标:细胞形态及表型变化,细胞生长曲线,细胞上清和海藻酸钠基质中Ⅱ型胶原的表达,细胞超微结构及Ⅱ型胶原的定位,同位素脉冲追踪活细胞Ⅱ型胶原的合成分泌.结果:①单层培养时,细胞由1周时的多角形变为8周后的条梭状或不规则形,三维培养条件下细胞形态始终以多角形为主.甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫组化染色结果显示,单层培养1周时均呈强阳性表达,8周后转为弱阳性,而三维培养8周后仍均呈强阳性表达.②三维培养条件下细胞生长曲线无明显增殖高峰,单层培养的细胞第8~10天达增殖高峰.③ELISA检测结果显示,单层培养8周后细胞上清中Ⅱ型胶原的表达明显高于第1周(P<0.05),同时也明显高于三维培养条件下细胞上清及海藻酸钠基质中Ⅱ型胶原的表达(P<0.05).④透射电镜下细胞超微结构基本正常,免疫电镜下可见细胞内Ⅱ型胶原主要定位于粗面内质网膜内,少数分布在线粒体.⑤~(14)C标记的脯氨酸干预后180 min,是细胞内合成及向细胞外分泌Ⅱ型胶原的高峰期.结论:SW1353人软骨瘤细胞在体外长期单层培养会发生细胞表型改变,其在藻酸盐凝胶三维培养体系中生长状态良好,细胞内软骨细胞标志物Ⅱ型胶原表达丰富,提示SW1353可以作为软骨细胞功能研究的良好模型.     

人骨髓间充质干细胞向成骨细胞和成软骨细胞分化的能力

背景：利用骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的多向分化性，选择合适的生物材料和适当的生长因子联合应用，可达到修复组织缺损的目的，MSCs细胞具有取材方便，对身体健康损害小，来源于自体干细胞诱导构建的组织不存在MHC限制等优点，所以日益受到人们的重视。目的：探讨人骨髓间充质干细胞向成骨和成软骨细胞诱导分化的能力。设计：单一样本研究。单位：苏州大学附属儿童医院骨科，苏州大学生命科学院生物技术研究所。材料：RPMI1640完全培养基，地塞米松，β-甘油磷酸钠，抗坏血酸，鼠抗人一抗，羊抗鼠二抗，链球菌亲和素(三抗)，DAB(1：50)，100mL／L胎牛血清，维生素C，转化生长因子-β1(TGF-B1)等。方法：选用不同代次的MSCs细胞，分别使用成骨和成软骨条件培养基培养，观察细胞的形态学变化，同时采用细胞化学和免疫组化的方法检测碱性磷酸酶，钙盐沉积，糖胺多糖分泌和I，Ⅱ胶原的表达。主要观察指标：骨髓基质干细胞向成骨细胞分化；骨髓基质干细胞向成软骨细胞分化。结果：MSCs细胞在地塞米松、维生素C和β-甘油磷酸钠的作用下，15d后可见细胞变为多边形，ALP和Ⅰ型胶原染色阳性，形成钙结节，表现成骨细胞分化特点；而在维生素C和TGF-β1的作用下，7d可见细胞多为圆形，糖胺多糖和Ⅱ型胶原染色阳性，表现成软骨细胞分化特点。但细胞分化特征的表达随细胞增殖有减弱趋势。结论：在一定培养条件下成功诱导人MSCs细胞向成骨和成软骨细胞分化，为进一步研究打下基础。