胃癌患者JAK3表达的研究

目的探讨胃癌患者JAK3的表达与胃癌发病的关系。方法采用荧光定量逆转录聚合酶链反应检测33例胃癌患者胃癌组织及其相应切缘组织中JAK3mRNA的表达,并分析JAK3mRNA在胃癌中的表达水平与癌胚抗原(CEA)之间的关系。结果①胃癌及其相应切缘组织中均有JAK3的表达,胃癌中的JAK3mRNA表达(6.27±0.89)极显著高于其相应切缘组织中的表达(0.93±0.18),P<0.01。②CEA阳性的胃癌患者胃癌组织中JAK3mRNA的表达水平较CEA阴性的胃癌患者高(P<0.05)。结论正常胃组织及胃癌组织均存在JAK3,JAK3的高表达在胃癌发病机制中有着重要意义。     

转导JAK2基因可促进原始多能造血细胞在体外的长期扩增

目的 探讨激活JAK2信号通路是否能够长期扩增调控造血干祖细胞并评价扩增细胞的定向分化潜能。方法 构建克隆1个含有JAK2基因和二聚化化学诱导物(AP20187)结合位点所组成的逆转录病毒载体。AP20187可以使JAK2二聚化激活细胞内信号传导。将该载体转人小鼠原始骨髓造血细胞,在无血清培养基中,将JAK2转基因的细胞分为：①空白对照组,②AP20187组,③细胞因子联合组[干细胞因子(SCF) Flt3-配体(Flt3-L)],④。AP20187 SCF Flt3-L组。对扩增的细胞进行免疫表型、定向分化、造血祖细胞集落分析及脾集落形成单位的研究。结果 只有AP20187 SCF Flt3-L组能够使JAK2转基因的骨髓细胞持续大量对数级增殖。约8d时,细胞数量可以达到扩增前的10^19倍。扩增的细胞经流式细胞仪检测为：Seal阳性细胞为52％～98％,C-kit阳性率为56％～69％,CD34阳性率40％～85％;而其他表型TER119阳性0～20％,CD41阳性5％～36％,B220阳性12％～46％,Grl阳性6％～17％,CD11b阳性35％～46％,CD3为阴性。扩增细胞在SCF/粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)／白介素(IL)-3条件下,可分化形成明显的粒细胞和巨噬细胞;在SCF／红细胞生成素(EPO)条件下,可分化为红细胞;在SCF／血小板生成素(TPO)／IL-11条件下,可分化为巨核细胞。祖细胞半固体集落培养,可以形成红系爆式集落形成单位(BFU-E)、粒-巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM)、混合集落形成单位(CFU-Mix)以及IL-7产生的B淋巴细胞集落,并可在照射过的小鼠体内形成脾集落形成单位。结论 JAK2介导的转基因骨髓造血细胞可以长期扩增调控,扩增的细胞仅限于JAK2转基因的细胞,并且具有多系分化的潜能。     

大鼠骨髓内皮祖细胞的体外扩增培养

目的探讨建立体外培养内皮祖细胞（EPC）的方法。方法通过密度梯度分离法从大鼠骨髓中分离单个核细胞,培养7 d后,行Dil-acLDL和FITC-UEA-1双荧光染色,并行流式细胞检测及细胞迁移实验。结果细胞培养7 d后,可见梭形细胞呈优势生长,Dil-acLDL与FITC-UEA-1荧光标记的双阳性细胞占细胞总数的比例为82.7%±5.1,培养第10天开始出现铺路石样细胞集落,培养后第7、14天CD34阳性细胞所占的比例分别为（32.3±3.2）%、（39.2±4.4）%（t=5.18,P〈0.01）,FLK-1阳性细胞所占的比例分别为（28.7±3.2）%、（44.5±3.8）%（t=5.32,P〈0.01）。培养7 d后迁移至膜下层的EPC数为（10.4±1.9）个,培养14 d后迁移至膜下层的EPC数为（11.8±2.5）个（t=0.83,P〉0.05）。结论分离大鼠骨髓单个核细胞,用选择性内皮生长体系培养EPC,再通过细胞免疫及细胞功能检测所分离的细胞,是一种较为良好的分离与鉴定EPC的方法。     

人类中脑神经祖细胞的体外扩增及诱导分化

目的：探讨人类中脑祖细胞体外分离、培养及向多巴胺能神经元诱导分化的方法。方法：利用neurosphere法，在低氧分压的情况下建立中脑祖细胞克隆，并用纹状体培养上清对其进行诱导分化，观察TH阳性神经元的分化比率及成熟度。结果：中脑来源的神经祖细胞克隆，能以neurosphere形式生长，低氧分压对其克隆生长具有促进作用；纹状体培养上清可增加TH阳性神经元的分化比率，并能使TH阳性细胞具有更成熟的多巴胺能神经元的形态特征。结论：低氧分压更适于中脑神经祖细胞的体外扩增，纹状体培养上清对中脑祖细胞向多巴胺能神经元的分化及成熟具有促进作用。     

骨肉瘤特异杀伤性T淋巴细胞的体外扩增

目的 研究骨肉瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）体外扩增培养的方法，并进行细胞毒检测。方法 抽取骨肉瘤患自身的外周血，分离淋巴细胞，用IL-2体外短期刺激方法提高对骨肉瘤细胞的免疫性，再按一定比例体外与多西紫杉醇处理的骨肉瘤细胞及巨噬细胞混合培养（MTLC）可获得骨肉瘤的特异性CTL细胞，进行鉴定并观察其杀伤特性。结果 混合培养4d后，即可扩增出大量淋巴细胞，流式细胞仪证实主要是CD8^ 细胞，这些具有杀伤活性的CTL细胞体外对自身肿瘤细胞有很强的细胞毒作用。结论 在IL-2作用下，应用巨噬细胞、自体肿瘤细胞及淋巴细胞体外混合培养，是体外扩增特异性细胞毒性T淋巴细胞的较好方法，CTL作为新的特异性免疫治疗方法有望提高骨肉瘤的免疫治疗效果。     

脐血造血干／祖细胞体外扩增的实验研究

目的 探讨因子组合FL＋TPO＋SCF＋IL－6对脐血CD34^ 细胞的体外扩增效应。方法 采用Mini-MACS分离纯化出CD34^ 细胞,在无基质接触的液体悬浮培养体系培养,通过间接免疫荧光染色、流式细胞仪技术、集落形成试验等动态测定细胞扩增情况。结果 培养4周后,FL＋TPO＋SCF＋IL－6组细胞总数、集落形成数均比扩增前显著增加（P＜0．05）,并且能维持一定比例的CD34^ 、Thy-1^ 细胞;SCF＋IL－3＋IL－6＋GM－CSF＋EPO组在第2周时集落形成数已降低,第4周时集落形成数、CD34^ 细胞基本检测不到。结论 与经典因子组合SCF＋IL－3＋IL－6＋GM－CSF＋EPO相比,因子组合FL＋TPO＋SCF＋IL－6能在较长时间内有效扩增脐血造血干／祖细胞,是一个优化组合方案。     

脐血CD34+细胞的体外扩增研究

目的:探讨造血生长因子不同组合方式对脐血CD34+造血干/祖细胞(HSC/HPC)的扩增作用.方法:应用StemsepTM阴性分选系统分离纯化CD34+细胞,在体外液体培养体系中经不同组合细胞因子进行扩增1～3w.结果:FL+Tpo+SCF+IL-3+GM-CSF+G-CSF+Epo组合的扩增效果最佳,可分别扩增细胞总数、造血祖细胞集落总数(CFCs)、CD34+细胞达1627.57±52.93、56.78±8.13、41.09±4.11倍.FL和Tpo具有明显的协同扩增早期祖细胞的作用,CFCs和CD34+细胞在1～2w维持在较高水平,以后逐渐衰退.结论:合理的细胞因子组合在大量扩增造血细胞的同时也有助于早期造血祖细胞的自我更新,把握适宜的扩增时机,将有助于扩增细胞在质和量上满足移植和基因治疗等的要求.     

体外高效扩增人外周血调节性T细胞技术的建立

目的：建立一种调节性T细胞（regulatory T cells,Tregs）体外高效扩增技术。方法：流式细胞仪分选健康人外周血CD4+CD25+CD127low T细胞,CD3/CD28磁珠刺激联合高浓度白介素?2（interleukin 2,IL?2）培养14 d。通过细胞计数评估Tregs体外扩增能力,采用流式细胞仪鉴定扩增Tregs的表型,采用混合淋巴细胞反应（mixed lymphocyte reaction,MLR）实验检测Tregs的抑制功能。结果：CD4+CD25+CD127low T细胞培养14 d后增殖（755.5 ± 213.5）倍。流式细胞鉴定扩增后的细胞：CD4分子表达为（98.3 ± 1.04）%,CD19分子表达为（0.039 ± 0.021）%,CD8分子表达为（0.443 ± 0.239）%,CD25分子表达为（97.6 ± 1.35）%。FOXP3分子表达为（87.7 ± 5.5）%,Helios分子表达为（73.3 ± 2.9）%。MLR实验显示：Tregs以不同比例与外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）共培养,当Tregs∶PBMC为1∶1时,PBMC增殖抑制率最高,为（84.39 ± 1.98）%。结论：成功建立一种体外高效扩增Tregs技术。扩增后细胞保留原有的细胞表型,并具备免疫抑制功能,为临床运用Tregs治疗自身免疫性疾病、抑制移植排斥反应提供了广阔的应用前景。     

JAK2-STAT3信号通路介导骨关节炎发病机制的研究进展

骨关节炎是一种以骨关节肿痛、畸形伴活动受限的慢性进行性、退变性疾病,发病机制较复杂,目前尚未完全阐明。JAK激酶(JAK)-信号转导及转录激活因子(STAT)信号通路可广泛参与机体的生物学过程,主要通过细胞因子介导发挥相应的生物学效应,对调节细胞增殖、分化、凋亡及炎症反应起重要作用。JAK2-STAT3信号通路与骨关节炎发病机制密切相关,通过检测骨关节炎患者关节液、滑膜及关节软骨中相关蛋白的表达水平可明确其与骨关节炎的相关性,对骨关节炎发病机制中JAK2-STAT3信号转导通路作用的研究将为骨关节炎的治疗提供新的思路。     

WT1多肽特异性T细胞受体基因转导正常T细胞的抗肺癌效应

目的通过基因转导技术获得WT1多肽特异性TCR基因转导的正常外周CD8+ T细胞,检测其对肺癌细胞的杀伤活性,探
讨TCR基因转导用于过继性细胞治疗肺癌的可行性及安全性。方法通过克隆HLA-A*2402限制性WT1特异性细胞毒性T细
胞（CTL）之TCR基因,经构建逆转录病毒载体后转导WT1-TCR基因至正常外周CD8+ T细胞;所获得的CD8+ T细胞对靶细胞
的杀伤效应经标准51Cr 释放试验测定。结果WT1-TCR 基因转导后的正常外周CD8+ T 细胞显示出对WT1 多肽负载的
HLA-A*2402+LCL细胞的特异性杀伤作用,同时TCR基因改造后的CD8+ T细胞可特异性杀伤HLA-A*2402及WT1表达阳性
的肺癌细胞株而不对HLA-A*2402表达阳性的正常细胞产生杀伤作用。结论这些数据论证了WT1-TCR基因转导正常外周T
细胞具有与亲代CTL一致的特异性杀伤特性,提示该方法用于过继性细胞免疫疗法治疗肺癌具有可行性。
     

消银解毒方颗粒对Jurkat T细胞内JAK1/STAT3信号通路作用机制的研究

目的探讨消银解毒方颗粒对人急性T淋巴细胞白血病细胞株(Jurkat T)细胞内酪氨酸激酶1(JAK1)/信号转导和转录激活因子3(STAT3)信号通路的调控作用。方法以植物血凝素(PHA)和白细胞介素-6(IL-6)共同诱导Jurkat T淋巴细胞建立血热证银屑病T细胞异常活化病理细胞模型,将模型细胞接种于24孔板,制备消银解毒方颗粒、凉血方颗粒(消银解毒方颗粒拆方)、解毒方颗粒(消银解毒方颗粒拆方)、阿维A(阳性对照)、蒸馏水(阴性对照)的药理血清,择取最佳浓度药理血清及JAK/STAT信号通路阻断剂Filgotinb(GLPG0634)作用于模型细胞48 h,同时设空白细胞组。收集各组细胞,采用蛋白质印迹(Western blot)、实时定量聚合酶链式反应(real-time PCR)法检测JAK1、STAT3、糖蛋白(GP)130的蛋白表达与基因转录水平。结果模型组的JAK1、STAT3、GP130的蛋白和mRNA表达较空白组明显增高(P0.01)。与模型组相比,各实验组磷酸化酪氨酸溶酶(p JAK)1/JAK1、磷酸化信号转号和转录激活因子(p STAT)3/STAT3、GP130蛋白表达量均明显降低(P0.01);与模型组相比,各实验组JAK1、STAT3、GP130的mRNA表达量均降低(P0.05或P0.01)。结论消银解毒方颗粒能够通过抑制JAK1/STAT3信号通路的开放进而抑制T细胞异常活化,以发挥其治疗银屑病的作用。     

表达谱基因芯片筛选前体脂肪细胞分化相关基因的研究

目的:运用基因芯片技术研究前体脂肪细胞分化相关基因表达谱的变化。方法:体外培养前体脂肪细胞(3T3-L1),诱导分化为成熟脂肪细胞。提取脂肪细胞总RNA,纯化mRNA后逆转录制备目标序列,应用含有45038种小鼠基因cDNA的表达谱芯片Mouse430_2进行差异表达谱分析。结果:在前体脂肪细胞分化的基因表达谱中差异表达基因共有640条,其中表达水平显著变化的有38条(表达水平改变5倍以上),上调基因24条,下调基因14条。差异表达基因中有细胞凋亡相关基因、原癌基因和抑癌基因、细胞信号和传递蛋白基因等多种基因。这些基因可能与脂肪细胞分化相关疾病的发病机制有关。结论:采用基因芯片技术筛选脂肪细胞分化相关基因,可能为脂肪细胞分化相关疾病病因和发病机制的研究提供新思路。     

Galectin-3重组真核表达载体的构建及其在NIH/3T3细胞中的表达

目的:构建半乳糖凝集素-3(Gal-3)的真核表达载体,在NIH/3T3细胞中表达,并检测其表达?方法:通过DNA重组技术和PCR方法从人肿瘤细胞克隆Gal-3基因,插入真核表达载体pEGFP-N1中,通过酶切和测序鉴定重组载体的正确性;采用脂质体转染技术将重组质粒pEGFP-Gal-3瞬时转染NIH/3T3细胞,经荧光和Western blot方法检测Gal-3表达,MTT法检测Gal-3对NIH/3T3细胞增殖的影响?结果:限制性内切酶鉴定和核酸序列测序证实成功构建含Gal-3的重组真核表达载体pEGFP-Gal-3?以重组质粒瞬时转染NIH/3T3细胞,检测到Gal-3蛋白表达,并证实Gal-3蛋白促进NIH/3T3细胞增殖?结论:成功构建的pEGFP-Gal-3真核表达载体在小鼠NIH/3T3细胞中成功表达,并促进NIH/3T3细胞增殖?     

肿瘤特异性T细胞受体基因转染诱导记忆性T细胞体外分化的研究

目的 探讨肝癌特异性T细胞受体基因转染对记忆性T细胞体外诱导分化的影响.方法 以肝癌特异性T细胞受体V β7.1转染PBMC,流式细胞术检测目的基因表达.肝癌细胞BEL-7402刺激诱导记忆性T细胞;以流式细胞术检测记忆性T细胞标志性表面分子表达验证记忆性T细胞表型及分化亚群:以Annexin V-PI双染检测肿瘤细胞的凋亡,ELISA检测细胞因子IFN-γ分泌探讨记忆性T细胞免疫功能.结果 TCRVβ7.1基因成功转染到T细胞并得到有效表达.与PBMC对照组相比.TCRVβ37.1转染组CD45RO表达显著上升.以CD45RA及CCR7表达分析记忆性T细胞亚群显示其表型主要为效应型记忆性T细胞.分化后的记忆性T细胞诱导肿瘤细胞凋亡率及IFN-γ分泌显著上升.结论 肿瘤特异性TCR基因转染可促进以效应型记忆性T细胞(TEM)为主的记忆性T细胞分化.TEM将通过诱导凋亡与分泌细胞因子作用发挥其免疫功能.     

人乳头瘤病毒16型基因组体外转化活性的研究

目的应用重组的人乳头瘤病毒16型（HPV－16）基因组体外转化NIH／3T3细胞，以评价HPV－16的转化活性。方法将HPV－16基因组正向括人pSV2／neo质粒，构建成pSV2－neo／HPV－16真核细胞表达质粒；用磷酸钙转染法，将其导人体外培养的NIH／3T3细胞；对经转化的细胞进行G418选择培养和核酸杂交分析。结果经选择培养获得了具有恶性表型的转化细胞，其主要表现为接触性抑制消失和非锚地依赖性生长；核酸杂交证明，转化细胞内含有HPV—16DNA序列。结论HPV—16基因组具有体外转化NIH/3T3细胞的活性。     

核仁磷酸蛋白突变基因表达对NIH3T3细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨核仁磷酸蛋白(nucleophosmin,NPM)突变基因对小鼠NIH3T3成纤维细胞系体外增殖和凋亡的影响以及其分子机制。方法通过脂质体介导将真核表达载体pEGFP-C1-NPMc+转染NIH3T3细胞,G418筛选稳定表达NPM突变蛋白细胞株,RT-PCR和Western blot检测NPM突变基因和蛋白的表达。MTT、克隆形成实验检测细胞体外增殖能力;FCM检测细胞周期分布及凋亡水平的改变,并通过对周期调控因子p21及凋亡相关分子Caspase-3活性检测,初步探讨NPM突变参与细胞恶性增殖的分子机制。结果建立了稳定表达NPM突变基因的NIH3T3细胞株。NPM-mA实验组细胞较对照组细胞增殖能力及平板克隆形成率明显增高(P<0.05);甲基纤维素集落形成实验显示各组细胞在甲基纤维素上均不能形成集落;与对照组比较,NPM-mA实验组细胞中G1期细胞比例(42.27±0.86)%显著减低(P<0.01),S期细胞比例(43.08±0.74)%显著增加(P<0.01),同时伴有p21 mRNA水平下降,稳定表达NPM突变基因的NIH3T3细胞凋亡率(1.00±0.13)%明显降低(P<0.01),C...     

三氧化二砷诱导骨髓瘤细胞JAK/STAT3通路抑制作用的研究

目的 研究三氧化二砷（As₂O₃)诱导人骨髓瘤细胞U266、RPMI8226细胞内JAK/STAT3信号转导通路抑制与细胞增殖之间存在的关系。方法 采用MTT法观察As₂O₃对骨髓瘤细胞作用的半数抑制浓度（IC₅₀）,流式细胞技术检测As₂O₃作用前后细胞周期的改变情况,甲基化特异性PCR法检测As₂O₃作用前后骨髓瘤细胞内SOCS-1基因甲基化状态的变化,Western blotting法检测As₂O₃作用前后磷酸化STAT3蛋白的表达差异。结果 As₂O₃作用72 h后,骨髓瘤细胞U266、RPMI8226细胞内磷酸化STAT3蛋白表达水平明显降低,同时伴随SOCS-1基因启动子区CpG岛甲基化程度明显减弱至消失,细胞增殖发生G₀/G₁期阻滞,上述三者变化均与As₂O₃浓度呈正相关（r=0.85,P<0.05）。结论 As₂O₃可诱导骨髓瘤细胞增殖受抑,与As₂O₃诱导细胞内JAK/STAT3信号转导通路抑制存在一定关系,且与细胞内SOCS-1基因甲基化状态改变相关。