骨髓间充质干细胞胰腺包膜下移植与静脉移植治疗大鼠糖尿病的效果比较

背景:目前多数研究集中于探讨骨髓间充质干细胞移植后的转分化及其调控机制,而缺少干细胞移植治疗糖尿病的方法学和功能学研究.目的:观察不同途径移植骨髓间充质干细胞对糖尿病模型鼠的治疗效果.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2008-03/11在深圳市人民医院临床研究中心完成.材料:1周龄雄性SD大鼠4只,用于制备骨髓间充质干细胞.8周龄雌性SD大鼠32只,随机分为胰腺包膜下移植组、静脉移植组、糖尿病对照组、正常对照组,8只,组.方法:全骨髓法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,贴壁法纯化扩增.胰腺包膜下移植组、静脉移植组、糖尿病对照组大鼠通过腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病模型.造模后,胰腺包膜下移植组取5×106个第3代骨髓间充质干细胞,重悬于0.2 mL PBS中,多点注射至胰腺包膜下;静脉移植组经股静脉注射等量骨髓间充质干细胞悬液;糖尿病对照组及正常对照组不接受仟何处理.主要观察指标:动态观察移植后血糖、胰岛素、C-肽水平变化,以及糖耐量实验结果.结果:与糖尿病对照组比较,移植后30 d内胰腺包膜下移植组和静脉移植组血糖值均明显降低(P<0.05),且胰腺包膜下移植组下降幅度更为显著(P<0.05):移植后第2,4,6周胰腺包膜下移植组与静脉移植组的胰岛素、C-肽水平均明显升高(P<0.05),且胰腺包膜下移植组升高幅度更为显著(P<0.05),但仍低于正常对照组(P<0.05).糖耐量实验中腹腔注射葡萄糖后,胰腺包膜下移植组血糖水平30 min达峰值,90 min降低至空腹水平,接近正常对照组的葡萄糖处理能力;静脉移植组对葡萄糖的处理能力略强于糖尿病对照组(P<0.05),但此2组在180 min内均未能恢复到正常血糖水平.结论:骨髓间充质干细胞移植途径与糖尿病的治疗效果有直接关系,胰腺包膜下移植效果优于静脉移植.     

胎鼠胰腺干细胞体内移植向胰岛样细胞团的分化

背景:由于干细胞的转分化受细胞外基质和基因程序的调控,因此在体外很难模拟体内干细胞巢的微环境而使干细胞定向分化,或许干细胞原位移植是可行方法之一.目的:探讨胎鼠胰腺干细胞在糖尿病鼠体内不同部位移植后分化为胰岛细胞团的可能性.设计、时间及地点:细胞学体内观察,于2006-03/2007-04在深圳市人民医院中心实验室完成.材料:16 d龄SD胎鼠12只,10周龄200-250 g的SD雌鼠50只,均由广东省实验动物中心提供.方法:分离纯化胎鼠胰腺干细胞.经荧光原位杂交检测为雄性的第5代胎鼠胰腺干细胞用于体内移植.50只SD雌鼠取10只作为正常对照组,余40只通过腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病模型,造模后分为4组:胰腺实质内移植组在胰腺实质内多点注射1×106个雄性胎鼠胰腺干细胞,肝内移植组行门静脉穿刺注射等量细胞悬液,肾包膜下移植组于左肾包膜下注射等量细胞悬液,模型对照组胰腺实质内多点注射相同体积的PBS液,10只,组,培养8周.主要观察指标:定期监测大鼠血糖及血浆胰岛素水平,观察胰腺、肝脏及肾脏组织病理学变化.结果:雄性胎鼠胰腺干细胞培养传3代后,巢蛋白阳性细胞率为74.1%.胰腺实质内移植组在移植后第3周血糖开始下降,血浆胰岛素水平逐渐升高;第5周血糖降至正常水平并维持,血浆胰岛素达到正常水平,病理学观察在胰腺内可见外源性胰岛样细胞团,胰岛素免疫组化染色呈阳性,巢蛋白免疫组化染色呈强阳性,荧光原位杂交检测Y染色体呈阳性.肝内移植组、肾包膜下移植组大鼠仍维持高血糖状态,相应组织内均未见外源性细胞团形成.结论:分离纯化的胎鼠胰腺干细胞存胰腺内原位移植后,于体内可转分化为胰岛样细胞团,并使血糖降至正常水平.     

人胰腺干细胞诱导胰岛样细胞团及其治疗大鼠糖尿病的效果

目的:观察人胎儿胰腺干细体外诱导分化为胰岛样细胞团及治疗大鼠糖尿病的效果。方法:实验于2005-09/2006-09在西北农林科技大学陕西省干细胞工程技术研究中心完成。人胰腺干细胞为本实验室冻存的1株传至50代的人胎儿胰腺干细胞。采用DMEM/F12培养液,添加B27、1g/L胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠、1g/L牛血清白蛋白、10mmol/L烟酰胺、10μg/L碱性成纤维细胞生长因子及10μg/L肝细胞生长因子,诱导胰腺干细胞分化为胰岛样细胞团,应用双硫腙染色、RT-PCR及葡萄糖刺激试验对该胰岛样细胞团进行鉴定。采用完全随机法将30只SD大鼠分为链脲菌素注射组24只,正常对照组6只。空腹12h后,两组大鼠分别腹腔注射70mg/kg体质量的链脲菌素和0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。大鼠分别于注射前、注射后48h、第5天和第8天空腹断尾采血,测定全血血糖浓度。选取连续2次血糖浓度高于16.7mmol/L的大鼠作为糖尿病模型。采用完全随机法从已成模的糖尿病大鼠中挑出18只分为3组:胰岛移植组9只,进行肾被膜下胰岛样细胞团移植,每只大鼠植入胰岛数(3000±100)个;干细胞移植组3只,肾被膜下移植未进行诱导的胰腺干细胞,细胞数约2×106个;糖尿病对照组6只,肾被膜下移植不含细胞的培养液。3组大鼠均于移植前及移植后48h测定空腹血糖浓度,每周定点测空腹血糖及称体质量1次。结果:18只符合糖尿病模型标准的大鼠与正常对照组6只大鼠均进入结果分析。①成功将人胎儿胰腺干细胞体外诱导分化为胰岛样细胞团,双硫腙染色阳性,RT-PCR检测表达胰岛素,经葡萄糖刺激能释放胰岛素。②共有22只大鼠糖尿病成模,成模率达91.7%。③胰岛移植组大鼠移植后2周内,血糖浓度均有所降低,但仍高于正常血糖浓度范围;移植后第3周血糖浓度迅速上升,之后一直维持高血糖状态。干细胞移植组大鼠移植后血糖一直处于较高水平,移植后第6周血糖开始下降,之后维持于较低水平。糖尿病对照组大鼠血糖浓度一直处于糖尿病血糖浓度范围内。结论:人胎儿胰腺干细胞体外可诱导分化为胰岛样细胞团,该胰岛团能分泌胰岛素,具有一定的抗大鼠糖尿病作用。     

骨髓间充质干细胞移植后2型糖尿病鼠血糖及肾脏病变的改善

背景:胰岛细胞移植可改善胰岛功能,但其来源匮乏.骨髓间充质干细胞可被诱导分化成胰岛细胞,在糖尿病足、糖尿病心肌病、糖尿病神经病变中具有较强的组织修复能力.目的:观察骨髓间充质干细胞移植后存2型糖尿病模型鼠胰腺、肾脏组织中的存活及转归,及对血糖及肾脏病变的改善.设计、时间及地点:细胞学体内实验,于2008-02/07在山西医科大学生物化学与分子生物学教研室完成.材料:雄性Wistar大鼠由山西医科大学实验动物中心提供,造模使用的链脲佐菌素为Sigma公司产品.方法:取1只大鼠体外分离培养骨髓间充质干细胞,反复贴璧纯化,传至第3代行BrdU标记后用于移植.60只大鼠随机分为3组,模犁对照组、细胞移植组向标准混合饲料中添加含体积分数为0.1的猪油和蛋黄高脂成分.喂养2个月后向大鼠腹腔内注射链脲佐菌素,血糖≥16.77mmol/L且维持3d稳定代表成功建立2型糖尿病模型.正常组采用标准混合饲料喂养2个月后,向大鼠腹腔内注射等容积柠檬酸缓冲液.造模成功后,细胞移植组经尾静脉注射骨髓间充质干细胞悬液0.5 mL(细胞数1×1 06个),其余两组注射等最PBS液.主要观察指标:各组大鼠血糖浓度及三酰甘油、胰岛素水平的变化,肾组织病理学变化.细胞在肾脏及胰腺组织中的分布.结果:与移植前比较,移植后7,14,21 d模型对照组血糖浓度无明显变化,细胞移植组血糖浓度明显F降(P＜0.001);移植后21 d与正常组比较,模犁对照组及细胞移植组三酰甘油水平均显著升高(P＜0.001),胰岛素水平均显著降低(P＜0.001),但细胞移植组胰岛索降低幅度小于模型对照组(P＜0.001).糖原染色结果示模型对照组肾小球发生肥大,细胞移植组肾小球基质变薄,肥大得以改善.胰岛素免疫荧光染色后,模型对照组胰岛细胞明显减少,而细胞移植组胰岛细胞增加,在胰腺、肾脏组织中均可见BrdU标记的阳性细胞.结论:经尾静脉注射骨髓间充质干细胞可定位于2型糖尿病大鼠胰腺及肾脏,并对其进行组织修复,同时可降低血糖,增加胰岛素分泌.     

胎鼠胰腺干细胞与胰岛联合移植保护胰岛

背景：胰腺干细胞可在体外维持胰岛的结构,减少胰岛细胞坏死及凋亡,延长胰岛的体外存活时间,保护胰岛的活性。 目的：探索胎鼠胰腺干细胞与胰岛共移植体内保护移植胰岛,提高胰岛移植疗效的可行性。 方法：将成年大鼠35只随机等分为联合移植组、单独胰岛移植组、单纯胰腺干细胞移植组、模型组及对照组,前4组均腹腔注射链脲佐菌素-柠檬酸盐缓冲液建立糖尿病模型。联合移植组、单独胰岛移植组、单纯胰腺干细胞大鼠分别在左侧肾包膜下移植分离纯化孕16 d SD大鼠胎鼠胰腺干细胞和/或成年SD大鼠胰岛。 结果与结论：联合移植组大鼠移植后5 d内血糖可降至正常,血浆胰岛素达到正常水平,胰岛存活时间（18.2±2.4） d;单独移植组大鼠血糖可于移植后1周内降至正常,胰岛存活时间（14.4±2.1） d;两组胰岛存活时间比较差异有显著性意义（P 〈0.05）。而其他组糖尿病大鼠血糖均未能降至正常范围。说明胎鼠胰腺干细胞与胰岛共移植可延长胰岛体内存活时间,保护胰岛功能,提高移植疗效。     

自体骨髓间充质干细胞经动脉介入移植治疗犬糖尿病

背景:目前多数研究倾向于将骨髓间充质干细胞经静脉移植等方法移植入糖尿病动物模型体内,而缺少将骨髓间充质干细胞经动脉介入移植入糖尿病动物模型胰腺内的相关研究。目的:用自体骨髓间充质干细胞经动脉介入移植入糖尿病犬胰腺内,观察骨髓间充质干细胞的分布、分化、对糖尿病的治疗效果及安全性。方法:将30只家犬随机分为骨髓间充质干细胞组(治疗组,n=13),糖尿病模型对照组(模型组,n=10)和对照组(n=7)。治疗组及模型组通过静脉注射四氧嘧啶建立糖尿病模型。造模后,治疗组进行胰岛素治疗,同时进行自体骨髓间充质干细胞的动脉介入移植。模型组仅接受胰岛素治疗,对照组则不接受任何治疗。结果与结论:与模型组比较,治疗组于移植后第12周的胰岛素用量明显减少(P<0.05),血清C-肽水平明显升高(P<0.05)。治疗组于移植后第4周及12周的组织病理切片显示,心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏的组织结构清晰,均未发生坏死、纤维化,与模型组及对照组比较,移植后各器官组织形态无明显异常改变。移植后第4周,骨髓间充质干细胞主要分布在胰腺及肾脏内,免疫荧光发现胰腺内存在CM-DiI和胰岛素共表达细胞。表明将骨髓间充质干细胞经动脉介入移植入糖尿病犬胰腺内来治疗糖尿病的方法,是安全有效的。     

脐带间充质干细胞移植治疗大鼠糖尿病

背景：脐血间充质干细胞具有很强的增殖能力和分化能力,在趋向分化作用下可以分化成胰岛β细胞,进而起到治疗糖尿病的作用。 目的：观察移植脐带间充质干细胞对大鼠糖尿病的治疗效果。 方法：30只雄性SD大鼠中随机取6只作为对照组,注射生理盐水;其中24只按45 mg/kg的剂量注射链脲霉素建立糖尿病模型后,随机等分为移植组和糖尿病组,移植组大鼠尾静脉注射移植脐带间充质干细胞。 结果与结论：造模后30 d,糖尿病组大鼠空腹血糖维持在较高水平,且高于对照组（P 〈0.05）。造模后,与糖尿病组相比,移植组大鼠空腹血糖水平显著下降（P 〈0.05）,体质量显著增加（P 〈0.01）,45 d时移植组大鼠空腹血糖水平与体质量接近对照组水平（P 〉0.05）,而糖尿病组大鼠空腹血糖维持较高水平,且体质量持续下降。提示脐带间充质干细胞移植能有效治疗大鼠糖尿病。     

外源性骨髓间充质干细胞在糖尿病模型大鼠体内向胰腺迁移并分化为胰岛细胞的趋势

目的:观察尾静脉注射骨髓间充质干细胞在糖尿病模型大鼠体内定向迁移至胰腺组织的规律。方法:实验于2004-08/2006-03在唐山工人医院中心实验室,华北煤炭医学院动物中心完成。实验材料:青年SD大鼠购自华北煤炭医学院动物中心(动物级别:SPF/VAF;许可证号:SCXK2002-0003)。实验方法:①采用密度梯度离心结合贴壁培养方法分离、纯化雄性大鼠骨髓间充质干细胞,并采用免疫组织荧光法鉴定。②将30只雌性大鼠完全随机分为3组:生理盐水组、骨髓间充质干细胞组、糖尿病模型组,每组10只。骨髓间充质干细胞组大鼠经尾静脉注射1×106L-1骨髓间充质干细胞0.2mL;生理盐水组大鼠尾静脉注射0.2mL生理盐水;糖尿病模型组检测大鼠各基础血糖值及体质量,按65mg/kg计算所需链脲佐菌素剂量,将其溶于柠檬酸钠缓冲液中,立即腹腔注射。用血糖仪及血糖试纸监测大鼠血糖,当血糖≥16.7mmol/L且稳定2d后经尾静脉注射1×106L-1骨髓间充质干细胞0.2mL。③应用原位杂交法检测雌性大鼠胰腺组织内Y染色体标志物及放射免疫法测定C-肽值。结果:30只大鼠均进入结果分析。①雌性大鼠腹腔注射链脲佐菌素后血糖检测:注射后2d血糖水平开始迅速升高,4d后血糖值大于16.7mmol/L且稳定在21mmol/L左右,30只大鼠均造模成功。②免疫荧光法检测骨髓间充质干细胞表型:呈抗Laminin染色阴性、抗CD44染色阳性。③放射免疫法检测雌性大鼠血清中C-肽值:与注射前比较,骨髓间充质干细胞组及糖尿病模型组注射骨髓间充质干细胞后,大鼠血清中C-肽值呈明显升高的趋势[注射前:(0.398±0.094),(0.263±0.011)μg/L;注射后:(0.443±0.109),(0.374±0.961)μg/L,P<0.05或P<0.01],生理盐水组无明显变化。④鼠胰腺组织石蜡切片中Y染色体标记物表达:生理盐水组大鼠胰腺组织中未见黄绿荧光Y染色体标记物存在,骨髓间充质干细胞组和糖尿病模型组大鼠胰腺组织中均可见黄绿荧光Y染色体标记物存在,糖尿病模型组大鼠胰腺组织中黄绿荧光强度较大、数量较多。结论:体外分离培养的骨髓间充质干细胞经尾静脉注射后,在糖尿病模型大鼠体内可迁移至胰腺组织中,并具有分化为胰岛素分泌细胞的可能性。     

糖尿病大鼠PKB信号传导系统表达的实验研究

目的观察胰岛素,胰高血糖素和磷酸化PKB在实验性糖尿病大鼠胰岛中的表达,探讨PKB信号传导系统对胰岛素表达的影响。方法腹腔内注射链脲佐菌素(STZ)制造糖尿病模型大鼠,实验中监测血糖,用免疫组织化学染色法观察胰腺组织中胰岛素、胰高血糖素和磷酸化PKB的表达。结果实验组与对照组相比,胰岛素和磷酸化PKB的表达水平均降低(P<0.01),而胰高血糖素的表达水平升高(P<0.01)。结论 PKB信号传导系统能促进胰岛素的分泌,而减少胰高血糖素的分泌。     

糖尿病大鼠胰腺中蛋白激酶B表达和细胞凋亡的变化

目的:探讨糖尿病大鼠胰腺中磷酸化蛋白激酶B表达及胰腺β细胞增殖与凋亡的变化。方法:将糖尿病大鼠腹腔内注射链脲佐菌素,实验中监测血糖,用免疫组织化学染色法观察胰腺中胰岛素、磷酸化蛋白激酶B的表达,以及胰腺β细胞的增生及凋亡情况。结果:糖尿病大鼠胰腺中胰岛素、磷酸化蛋白激酶B的表达水平均降低(P<0.01),糖尿病组β细胞凋亡率明显高于对照组(P<0.01),2组大鼠胰腺β细胞均无明显增生。结论:磷酸化蛋白激酶B在糖尿病大鼠胰腺中的表达水平下降,蛋白激酶B介导的信号传导系统可能抑制胰腺β细胞的凋亡。     

大鼠肌源性干细胞植入糖尿病鼠胰腺后的存活能力及血糖调节

背景:肌源性干细胞易于提取、分离及扩增,在特定条件下可分化为骨软骨、肌肉等中胚层组织细胞,还可以跨胚层分化为神经细胞等.目的:观察糖尿病鼠胰腺内植入的肌源性干细胞存活情况,及其调节血糖的效果.设计,时间及地点:细胞学体外观察,于2007-04/09在辽宁医学院科学实验中心完成.材料:SPFNAF级新生5d龄SD大鼠31只,由辽宁医学院实验动物中心提供.造模使用的链脲佐菌素为星隆达公司产品.方法:取5只大鼠的前肢肱三头肌与后肢腓肠肌,采用差速贴壁法纯化扩增大鼠肌源性干细胞,传至第3代用于移植,临用前以携带绿色荧光蛋白的腺病毒悬液进行转染.取20只大鼠,通过尾静脉注射链脲佐菌素建立糖尿病模型,15只成功造模,取12只随机均分为2组:细胞移植组胰腺被膜下移植肌源性干细胞约2×106个,模型对照组同法给予等量不含细胞的培养液.余6只大鼠作为正常对照组.主要观察指标:肌源性干细胞移植至胰腺后的存活情况.移植后大鼠血糖浓度的变化.结果:移植后1周,胰腺组织争网架样结构,表达较强的黄绿色荧光;4周后仍有荧光表达,但强度减弱.与模型对照组比较,移植前2d细胞移植组大鼠血糖浓度无明显差异(P>0.05);移植后4,8d,大鼠血糖浓度一直处于较高水平;至移植后第4,8周大鼠血糖浓度明最下降(t=-2.416-8.372,P<0.01).结论:肌源性干细胞移植后能在糖尿病模型鼠的胰腺部位存活,且一定程度上可下调大鼠血糖浓度.     

人脐带间充质干细胞体外向胰岛样细胞诱导分化及其治疗糖尿病效果

背景:相对于其他来源的干细胞而言,脐带间充质干细胞免疫排斥反应和免疫原性较小,但并不等同于无任何免疫排斥反应.目的:观察人脐带间充质干细胞体外向胰岛样细胞的诱导分化,及其移植后对槠尿病大鼠的治疗效果.设计、时间及地点:细胞学体内对照观察,于2008-11在辽宁医学院解剖学教研室实验窀完成.材料:清洁级雄性SD大鼠36只,随机分为4组:胰岛样细胞组12只、间充质干细胞组12只、模型对照组6只、正常对照组6只.人脐带间充质干细胞由天津国家干细胞中心提供.方法:取传至第3代的人脐带间充质干细胞,待细胞融合至70%～80%后,换用含碱性成纤维细胞生长因子、尼克酰胺的DMEM高糖培养基,向胰岛样细胞诱导分化.除正常对照组外,其余3组大鼠均腹腔注射链脲佐菌素建屯糖尿病模型.造模后,胰岛样细胞组于肾被膜下植入胰岛样细胞2× 106个,间充质干细胞组同法植入等量未诱导的脐带间充质干细胞,模型对照组植入不含任何细胞的培养液1 mL.主要观察指标:诱导后胰岛样细胞的鉴定,胰岛样细胞的移植效果.结果:诱导前脐带间充质干细胞呈长梭形贴壁生长;诱导4 d后细胞向中央聚集,出现胰岛样细胞团,此后胰岛样细胞团逐渐增大且数量增多;诱导7d双硫腙染色呈阳性表达.移植后2周,胰岛样细胞组血糖浓度明显降低,一直维持至第6周;间充质干细胞组血糖浓度在移植后很快下降,但4周后皿糖浓度上升;模型对照组血糖浓度一直处于糖尿病血糖浓度范围内.免疫组化染色结果显示,移植后4周胰岛样细胞组胰腺管腔内可见大量胰岛素表达,间充质干细胞组仪有表达少量胰岛素,正常对照组胰岛素表达无明显变化.结论:人脐带间充质干细胞体外可诱导分化为胰岛样细胞.与脐带间充质干细胞相比,胰岛样细胞能够较长时间维持大鼠血糖浓度在正常水平,且植入后可迅速发挥降糖作用.     

大鼠胰岛细胞的分离提纯及移植效果观察

背景:胰岛细胞移植已成为治疗1型和部分2型糖尿病的有效途径,但供体不足的问题限制了其发展。目的:改进胰岛细胞的分离和纯化方法,并观察其移植效果。设计:实验方法改进。单位:中国医科大学实验动物部和细胞生物研究室。材料:实验于2006-01/10在中国医科大学实验动物部和细胞生物研究室完成。供体为普通级封闭群Wistar大鼠,雌雄不限,体质量250～300g;受体为普通级封闭群SD大鼠,雄性,(Frompage2388)体质量180～220g,两种大鼠均购自中国医科大学实验动物部(许可证号:SYXK(LIAO)2003-0013)。方法:①胰岛细胞的分离纯化及胰岛功能评估:取未禁食的Wistar大鼠,麻醉后处死。于胆总管起始处剪一小口,将连着装有胶原酶的注射器的1mm直径的腰麻管顺行插入,将冷的胶原酶溶液(1.5g/L)注入胰管内,使胰腺充分膨胀。切取胰腺,将装有胰腺的离心管水浴消化,水浴期间间断加入1mol/L的NaOH使消化液的pH值保持在7.8±1.0,经Ficoll密度梯度离心法纯化胰岛。应用双硫腙法评估胰岛的纯度,应用丫啶橙/碘丙啶法评估胰岛的存活率,存活率=活细胞总数/(活细胞总数 死细胞总数)×100%。通过胰岛素释放实验检测胰岛活性:胰岛素释放指数=第3小时(高糖环境)的胰岛素含量/第2小时(低糖环境)的胰岛素含量。②胰岛移植效果的观察:受体SD大鼠腹腔内注射链脲霉素,非禁食状态下2次血糖>16.7mmol/L确定为糖尿病大鼠。将糖尿病大鼠按随机数字表法分为两组,即胰岛移植组和糖尿病组,每组8只。胰岛移植组于肾被膜下注射约1000个胰岛,糖尿病组注射相应体积的1640培养液,再随机取8只血糖浓度≤5.5mmol/L的SD大鼠作为正常对照组。术后每天检测大鼠血糖,以非禁食血糖小于11.1mmol/L者视为胰岛移植存活。胰岛移植组大鼠血糖正常3d后对胰岛移植组、糖尿病组和正常对照组大鼠分别进行静脉糖耐量试验,测定0,15,30,60,90及120min血糖。主要观察指标:胰岛的纯度、存活率及活性。结果:纳入受体SD大鼠24只,全部进入结果分析,无脱失。①平均每只大鼠胰腺可获得(1150±141)个胰岛,纯度>95%,存活率>98%,胰岛形态完好。②体外胰岛素释放实验低、高糖组的胰岛素释放量为(70.5±6.9)mIU/L,(321.4±11.6)mIU/L,胰岛素释放指数为4.60±0.52,提示所提取的胰岛β细胞有良好的功能。③胰岛移植组大鼠胰岛移植当天血糖既开始下降,3d后血糖下降至正常,维持正常血糖水平(6±2)d;而糖尿病组大鼠血糖均在16.7mmol/L以上。胰岛移植组静脉葡萄糖耐量试验曲线与正常对照组相似。结论:经原位灌注法分离、Ficoll密度梯度离心纯化的胰岛制备技术可以获得高纯度和活力良好的大鼠胰岛细胞。     

携带人端粒酶反转录酶基因脐血间充质干细胞移植治疗肺动脉高压

背景:保护机体肺血管的内皮细胞,是降低肺循环压力,预防肺动脉高压的重要环节。目的:观察携带人端粒酶反转录酶基因的脐血间充质干细胞移植对大鼠肺动脉高压的治疗作用。方法:体外进行脐血间充质干细胞的培养及纯化,在腺病毒介导下使人端粒酶反转录酶基因成功导入脐血间充质干细胞。将60只SD大鼠随机分成3组:肺动脉高压组、空腺病毒组、腺病毒转染组,每组20只,腹腔注射野百合碱进行肺动脉高压模型复制后,于颈内静脉分别注射1 mL的伊戈尔低糖培养基(L-DBEB),1 mL(1.5×1010 L-1)脐血间充质干细胞悬液,1 mL(1.5×1010 L-1)腺病毒介导下人端粒酶反转录酶基因转染的脐血间充质干细胞悬液。移植21 d后检测各组大鼠血流动力学水平、血浆内皮素1水平以及右心室的肥大指数。结果与结论:各组大鼠动脉血压差异无显著性意义(P>0.05);与肺动脉高压组及空腺病毒组比较,腺病毒转染组大鼠肺动脉收缩期压力、平均肺动脉压均降低,差异有显著性意义(P<0.05);腺病毒转染组大鼠右心室肥大指数与肺动脉高压组及空腺病毒组相比较,差异均无显著性意义(P>0.05);腺病毒转染组大鼠血浆内皮素1水平明显低于肺动脉高压组及空腺病毒组,差异有显著性意义(P<0.05)。结果表明携带人端粒酶反转录酶基因的脐血间充质干细胞移植后,能够改善大鼠机体血流动力学异常状态,还可以保护机体血管内皮细胞。     

胰腺干细胞体外诱导分化为胰岛素分泌细胞及对1型糖尿病模型鼠的治疗作用

背景：有实验证实人和动物起源的胚胎干细胞或成体干细胞可分化为胰岛素分泌细胞，但其分泌胰岛素的功能及对实验性糖尿病的治疗价值尚需要验证。 目的：观察从大鼠的胰腺组织分离纯化干细胞在体外将诱导分化胰岛素分泌细胞后胰岛素mRNA的表达、分泌胰岛素的能力及对1型糖尿病模型鼠的治疗作用。 设计：随机对照观察。 单位：中日友好医院临床医学研究所。 材料：实验于2004-08／2007—12在北京中日友好医院临床医学研究所病理生理研究室完成。选用8—10周龄雄性SD大鼠及雌性裸鼠各10只，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。尼克酰胺、链脲菌素均为Sigma公司产品，nestin抗体为BD Biosciences产品。大鼠胰岛素放射免疫检测试剂盒购自Linco research。胰岛素抗体及胰高糖素抗体为Santa Cruz产品。 方法：应用nestin结合的免疫磁珠从SD大鼠胰腺导管细胞中分离和纯化干细胞，经体外扩增及诱导分化形成胰岛素分泌细胞。①采用RT-PCR法检测细胞分化过程中胰岛素mRNA的表达。②将干细胞经诱导分化形成的胰岛进行冰冻切片，采用免疫荧光染色观察胰岛素及胰高糖素阳性细胞表达。③对干细胞分化胰岛的胰岛素释放功能进行评价，放射免疫法测定上清中胰岛素检测干细胞分化形成的胰岛分泌胰岛素的能力。④鼠按220mg／kg链脲菌素腹腔注射法制备为1型糖尿病模型，造模后随机摸球分为天然胰岛组及干细胞胰岛组，每组5只。将大鼠天然胰岛（SD大鼠分离）及干细胞分化形成的胰岛分别移植于糖尿病裸鼠左肾包膜下，观察移植后鼠尾静脉血糖变化。 主要观察指标：①细胞分化过程胰岛素mRNA表达。②胰岛样结构中胰岛素及胰高糖素阳性细胞表达。③干细胞分化形成的胰岛分泌胰岛素情况。④移植后鼠尾静脉血糖变化。 结果：①RT-PCR检测结果表明胰岛素mRNA的表达随诱导时间延长而明显升高。②免疫荧光染色结果显示胰岛结构的中间存在大量胰岛素阳性细胞，胰高糖素阳性细胞主要分布于胰岛样结构的周边。③干细胞分化的胰岛在高浓度葡萄糖刺激后明显缺乏快速相的胰岛素释放，而是表现细胞外上清中胰岛素浓度的缓慢升高。④天然胰岛组移植后3d使血糖降低到10mmol／L以下，至观察到60d仍维持在正常水平；干细胞胰岛在移植后8d使血糖降低至10mmol／L以下，且在移植35d后血糖逐渐升高并恢复到胰岛移植前的水平。 结论：大鼠胰腺干细胞经体外扩增和诱导分化后可分化胰岛素分泌细胞，但对葡萄糖的刺激没有快速相的胰岛素分泌。将胰岛素分泌细胞移植到1型糖尿病模型裸鼠后可一定程度地改善糖代谢的紊乱。     

脐带源间充质干细胞与大鼠胰腺细胞共培养向胰岛样细胞分化及移植治疗1型糖尿病

背景:脐带Wharton's Jelly中间充质干细胞可以向胰岛样细胞诱导分化.目的:验证脐带源间充质干细胞与大鼠胰腺细胞共培养向胰岛样细胞诱导分化的可能性,并观察移植后对糖尿病大鼠血糖的影响.方法:分离、诱导、传代脐带Wharton's Jelly中间充质干细胞,再与大鼠胰腺细胞共培养,诱导成胰岛细胞团样组织.将大鼠分为3组,正常对照组不进行移植及造模;模型组仅制备糖尿病大鼠模型;实验组造模后将胰岛样细胞移植入糖尿病大鼠肾脏包膜.结果与结论:脐带Wharton's Jelly细胞培养中有细胞从组织块中爬出,第7天形态发生变化,贴壁细胞部分变成梭形.分离培养的细胞表达具有间充质干细胞表面特有标志CD44、CD29、CD105,不表达CD34、CD45、CD14.诱导第7,10天PDX-1及人胰岛素强染色;胰岛素及C-肽浓度较单纯培养组明显升高;PDX-1及人胰岛素mRNA诱导第7、10天较高表达.移植第1周大鼠尾尖血糖链脲佐菌素实验组明显低于模型组(P < 0.01),但明显高于正常照组(P < 0.01).8周链脲佐菌素实验组肾脏被膜下发现胞核染棕色染色的Brdu阳性、胞浆棕色染色的胰岛素阳性细胞.结果表明,脐带Wharton's Jelly中存在脐带源间充质干细胞,与大鼠胰腺细胞共培养可促进间充质干细胞向胰岛样细胞诱导分化,移植入糖尿病大鼠肾脏被膜下,可显著降低糖尿病大鼠血糖.     

骨髓间充质干细胞及与胰岛细胞共移植治疗糖尿病*

背景：药物是目前糖尿病治疗最主要的方法,但病情的进展以及相关并发症的发生使药物的作用受到挑战。目的：探讨骨髓间充质干细胞与胰岛细胞共移植治疗糖尿病的应用效果以及可行性。方法：分离、纯化大鼠骨髓间充质干细胞并进行体外培养,建立糖尿病模型,对糖尿病模型大鼠分别注射骨髓间充质干细胞、骨髓间充质干细胞和胰岛细胞共培养混合物以及生理盐水或磷酸盐缓冲液作为对照。通过观察监测各糖尿病模型大鼠血糖水平的变化、胰岛素分泌情况以及胰腺组织的病理学变化评估移植治疗效果。结果与结论：骨髓间充质干细胞移植治疗糖尿病模型大鼠,移植后C-肽值明显升高,血糖水平明显下降,但仍未降至正常范围内,且随着时间的延长,血糖水平再次升高。骨髓间充质干细胞与胰岛细胞共移植治疗糖尿病模型大鼠,血糖水平亦明显下降,且下降程度大于单纯骨髓间充质干细胞移植治疗,可下降至正常水平,并在一定时间内能够维持。骨髓间充质干细胞与胰岛细胞共移植治疗糖尿病具有一定的效果,具有应用的可行性。     

肾包膜内注射骨髓间充质干细胞在链脲佐菌素糖尿病模型大鼠体内的定位及功能测评

目的:观察骨髓间充质干细胞在体外不诱导条件下,移植于链脲佐菌素所致糖尿病大鼠后在胰腺的定位及胰岛素分泌情况。方法:实验于2004-08/2006-03在2级实验室唐山工人医院中心实验室和具有国家认证的屏障动物环境实验室华北煤炭医学院动物中心完成。①实验材料:青年清洁级SD大鼠购自华北煤炭医学院动物中心(SCXK2002-0003),4周龄,体质量180～250g,动物级别:SPF/VAF。②实验方法:体外培养雄性SD大鼠骨髓间充质干细胞,并采用流式细胞仪鉴定。选取雌性SD大鼠,按65mg/kg剂量腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病大鼠模型。给药后二三天,大鼠血糖升高,当血糖≥16.7mmol/L且稳定2d,认为糖尿病模型建立成功。将建模成功的40只大鼠完全随机分为对照组、实验组,每组20只。对照组大鼠右侧肾包囊注射磷酸缓冲液0.2mL,实验组大鼠右侧肾包囊下注射骨髓间充质干细胞0.2mL,细胞数为4×105L-1。于移植前及移植后第3,5,7天采大鼠尾静脉血检测血糖。③实验评估:于移植前及注射后7d采大鼠心脏血检测C-肽值,移植后7d取大鼠胰腺组织作石蜡切片,应用原位杂交技术检测Y染色体细胞。结果:40只大鼠全进入结果分析。①骨髓间充质干细胞鉴定:骨髓间充质干细胞呈梭形、放射状,形成数个细胞克隆时排列整齐,原代培养7～10d即可长满,按1∶3传代,生长四五天达融合。流式细胞术表面标志鉴定显示,培养的原代骨髓间充质干细胞表面标志CD90阳性,基质细胞表面标志CD44阳性,造血细胞表面标志CD45及内皮细胞表面标志CD31阴性。②大鼠尾静脉血血糖值、心脏血C-肽值分析:血糖结果显示,对照组治疗后第3,5,7天血糖值及C-肽值与治疗前相比,无明显变化(P>0.05);实验组治疗后第3,5,7天血糖值较治疗前明显下降,治疗后第7天C-肽值明显上升,与对照组对应时间比较,差异均显著[实验组治疗前:(21.75±2.44)mmol/L,(0.21±0.01)μg/L;实验组治疗后:(12.23±1.95)mmol/L,(14.00±2.85)mmol/L,(12.75±2.86)mmol/L,(0.26±0.01)μg/L;对照组治疗后:(21.63±1.34)mmol/L,(23.03±1.11)mmol/L,(22.48±1.92)mmol/L,(0.21±0.01)μg/L,P均<0.01]。③原位杂交技术检测Y染色体细胞:对照组大鼠胰腺组织切片中未见黄绿荧光Y染色体,实验组大鼠胰腺组织切片中可见黄绿荧光Y染色体,存在于胰腺腺泡间隙,或胰腺组织中。结论:雄性大鼠骨髓间充质干细胞在肾包囊注射下可到达雌性糖尿病大鼠胰腺组织,使糖尿病大鼠血糖下降,C-肽值升高,具有分化为胰岛素分泌细胞的可能性。     

人脐血间充质干细胞移植改善肝硬化大鼠的肝功能

背景：人脐血间充质干细胞移植治疗肝硬化的可行性及机制有待深入探讨。目的：观察经门静脉移植人脐血间充质干细胞对肝硬化大鼠肝功能及组织病理学改变的影响。方法：采用四氯化碳法制备肝硬化大鼠模型,造模成功后,细胞移植组经门静脉注射1 mL BrdU 标记的人脐血间充质干细胞(5×106个),模型组注射等体积的 PBS;以经门静脉移植1 mL 人脐血间充质干细胞的正常大鼠作为对照。细胞移植后4周,取大鼠尾静脉血及肝脏组织进行检测。结果与结论：细胞移植后4周,与模型组比较,细胞移植组大鼠血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总胆红素明显降低,而白蛋白明显升高(P <0.01);肝细胞炎性坏死、脂肪变及肝纤维化程度明显改善(P <0.05或 P <0.01)。免疫组化及免疫荧光染色显示细胞移植组和对照组大鼠肝组织中均有人脐血间充质干细胞的定植,但细胞移植组 BrdU 阳性细胞数目明显多于对照组。RT-PCR 检测结果显示,细胞移植组大鼠肝组织表达人源性细胞角蛋白18和白蛋白 mRNA,而模型组未见。可见人脐血间充质干细胞移植可在一定程度上改善肝硬化大鼠的肝功能及病理损伤,其机制可能与移植细胞在肝硬化大鼠肝内归巢定植并向肝样细胞分化有关。     

人端粒酶反转录酶转染的骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠糖尿病

背景:人端粒酶反转录酶是调控增殖及定向分化的首选生长因子之一,具有多重生物学效应。目的:观察人端粒酶反转录酶表达的骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠糖尿病的效果。方法:体外培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,经反转录病毒PLXSN为载体介导人端粒酶反转录酶基因转染骨髓间充质干细胞,在转染前后用RT-PCR检测骨髓间充质干细胞人端粒酶反转录酶基因的表达。60只雌性SD大鼠中随机取15只作为正常对照组,一次性注射生理盐水,余45只按45 mg/kg的剂量注射链脲霉素建立糖尿病模型后,随机分为3组,分别通过大鼠尾静脉注射移植人端粒酶反转录酶基因转染的骨髓间充质干细胞0.2 mL、骨髓间充质干细胞0.2 mL、生理盐水0.2 mL。结果与结论:转染48 h后发现,骨髓间充质干细胞有人端粒酶反转录酶mR NA的表达,且重点集中于胞核内。移植后14 d,糖尿病组大鼠空腹血糖维持在较高水平,且高于正常对照组(P<0.05);与糖尿病组相比,各移植组大鼠空腹血糖水平显著下降(P<0.05);与骨髓间充质干细胞移植组相比,人端粒酶反转录酶基因转染的骨髓间充质干细胞移植组大鼠空腹血糖水平显著下降(P<0.05),接近正常对照组水平(P>0.05)。结果提示人端粒酶反转录酶表达的骨髓间充质干细胞移植能有效治疗大鼠糖尿病。