骨质疏松研究热点:骨髓间充质干细胞分化命运

骨质疏松症是一种常见的代谢性骨病,以骨量减少、骨密度降低和骨微结构破坏为特征,容易发生脆性骨折,其发病率逐年增高.骨质疏松症发病与骨平衡的破坏有关,一方面破骨细胞活性增强、骨吸收加快,另一方面成骨细胞功能衰减、骨形成不足,最终导致净骨量丢失.成骨不足与骨髓间充质干细胞分化方向密切相关.在骨质疏松症患者中,骨髓间充质干细胞向脂肪方向分化增多,向成骨方向分化减少,其分化命运受BMP/Smad、Wnt、Notch、Hedgehog等多条信号通路调控,并涉及转录调控、转录后调控和表观遗传等多种调控机制,是目前研究的热点与焦点.未来研究可集中于寻找决定骨髓间充质干细胞分化方向的关键因子和间充质干细胞移植,为骨质疏松症的治疗提供新思路.     

影响骨髓间充质干细胞成脂化的部分因素

摘要：随着人口的不断增长和老龄化社会的到来,骨质疏松症及其所引起的骨折已成为严重危害人类健康的世界性公共卫生问题。目前,全世界约2亿多人患有骨质疏松症。研究发现,骨质疏松症患者骨髓中的脂肪细胞与松质骨的骨量成反比,骨量的减少与骨髓腔内脂肪细胞增多总是相伴出现。[1]而骨髓间充质干细胞是近年来发现的一种易于扩增、具有多种分化潜能的细胞,在不同诱导条件下,能够向成骨细胞、脂肪细胞等不同的细胞系分化[2]。许多体内、外实验证明能结合在PPAR、糖皮质激素、雌激素、维生素D 、雄激素受体上的配体可调节MSCs向成骨和成脂肪分化。因此探讨骨髓间充质干细胞成脂分化的影响因素对骨质疏松症防治具有重要意义,可以为临床上治疗骨质疏松提供新思路。为了进一步了解骨质疏松与骨量减少、骨髓脂肪增多的关系,我从细胞核激素受体水平上对影响BMSCs分化为脂肪细胞的因素作一综述。     

骨质疏松发病过程中骨髓间充质干细胞差异性表达microRNA的筛选及其在干细胞多向分化中的功能

目的:研究去势小鼠骨质疏松模型中骨髓间充质干细胞(BMMSC)microRNA表达谱的改变,确定特异性改变microRNA的功能,明确其在骨质疏松发病中的作用。方法:通过微阵列芯片筛查,寻找在骨质疏松模型骨髓间充质干细胞中差异性表达的microRNA,并在成骨成脂分化诱导后行RT-PCR检测其表达水平,研究其在BMMSC多向分化中的作用。结果:本研究发现了10个在骨质疏松发病过程中有差异性表达的microRNA,其中5个microRNA在BMMSC成骨分化过程中,3个microRNA在成脂分化过程中表达出现明显改变。结论:microRNA表达异常可能导致骨质疏松发病过程中BMMSC的功能缺陷。     

骨质疏松症抑制人间充质干细胞的成骨分化

摘 要: 【目的】 为研究患者来源干细胞成骨分化的差异性,选取临床诊断为骨质疏松症患者的骨髓干细胞进行成骨分化诱导? 【方法】 采用密度梯度离心法,从临床6名患者(骨质疏松症3人,非骨质疏松症3人)的腰椎骨髓血液中分离获得原代骨髓间充质干细胞,并体外扩增至3-4代后进行实验?成骨诱导液的成分包括地塞米松(100 nmoL/L),二磷酸抗坏血酸(0.05 mmoL/L),β-甘油磷酸钠(10 mmoL/L)溶解于含有100 mL/L胎牛血清的低糖DMEM中?通过测定hMSC的增值与碱性磷酸酶(ALP)含量反应干细胞成骨分化活性?定量PCR检测Runx-2?ALP及成骨标志基因osteocalcin(OC)和osteonectin(ON)表达水平;通过矿化结节茜素红染色确认并定量检测钙离子浓度?【结果】 比较两组干细胞增殖差异,骨质疏松组较非骨质疏松组降低,而ALP含量无显著差异?Q-PCR检测显示在第3?7天时,骨质疏松组Runx-2?ALP的mRNA表达水平均显著低于非骨质疏松组?骨质疏松组的成骨相关基因OC在3?7?14 d时mRNA表达水平均显著低于非骨质疏松组,而ON仅在第7天表达具有显著差异;矿化结节染色及钙离子定量检测显示,较之非骨质疏松组,骨质疏松组矿化结节染色浅,钙定量降低?【结论】 使用成骨诱导干细胞分化方案(地塞米松?二磷酸抗坏血酸?β-甘油磷酸钠)结果提示骨质疏松症患者的干细胞成骨分化能力较非骨质疏松患者降低?因此,选取有骨质疏松症患者自身的骨髓间充质干细胞作为治疗的种子细胞可能并不适用于临床?     

兔骨髓间充质干细胞的体外培养、鉴定及诱导分化

目的建立兔骨髓间充质干细胞的体外分离、培养、鉴定方法。方法通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化兔骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,绘制生长曲线,检测细胞表面标志物,加入诱导剂诱导细胞向成骨、成脂方向分化,油红O染色,检测细胞内碱性磷酸酶(ALT)、甘油三酯(TG)含量。结果兔骨髓间充质干细胞符合正常细胞生长特性,形状以梭形、纺锤形为主,后期多数细胞呈长梭形;细胞生长较旺盛,可连续传7~10代,以第3代细胞状态最佳;第3代骨髓间充质干细胞CD29表达呈阳性,CD34表达呈阴性;成骨、成脂诱导后,油红O染色出现明显脂滴,ALT、TG含量明显增高。结论全骨髓贴壁法可成功分离和培养出兔骨髓间充质干细胞,具有间充质干细胞的一般生物学特性,且生长状态良好,增殖力强,经诱导后具有向成骨和成脂分化的潜能,该方法获得的骨髓间充质干细胞可能成为组织工程的优良种子细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞原代培养及成骨成脂分化能力染色鉴定

目的：实验旨在建立一套简便有效的骨髓间充质干细胞原代培养、诱导分化及染色方法,观测骨髓间充质干细胞生物学特性,及其成骨、成脂分化潜能,为后续进行骨髓间充质干细胞基因修饰实验做好准备。方法本实验通过全骨髓培养法分离骨髓间充质干细胞,并用诱导分化培养液做定向诱导培养,观察骨髓间充质干细胞向成骨及成脂肪细胞分化过程中的细胞形态学变化,进行成骨成脂细胞染色鉴定,以探讨骨髓间充质干细胞的分离培养方法、生长规律及向成骨成脂细胞分化的条件。结果(1)通过全贴壁法成功进行了骨髓间充质干细胞原代及传代培养并绘制出第4代细胞生长曲线;(2)通过茜素红染色验证了骨髓间充质干细胞的成骨分化能力;(3)通过油红O染色验证骨髓间充质干细胞的成脂分化能力。结论全贴壁法提取的大鼠骨髓间充质干细胞经传代4次左右可达到一定纯度,在一定诱导条件下,经特定染色方法鉴定,可分化为成骨细胞,成脂细胞。     

DAPT阻断Notch信号通路抑制去势大鼠骨髓间充质干细胞增殖及诱导其成骨分化的作用研究

目的:观察阻断Notch通路对于大鼠骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells;BMSC)增殖及成骨分化的影响。方法:建立绝经后骨质疏松大鼠模型,对BMSC进行分离鉴定及培养。设置阴性对照组及DAPT应用组,利用MTT法及ALP(Alkaline phosphatase)检测观察骨质疏松大鼠BMSC的增殖与成骨分化。结果:对照组及DAPT组BMSC到第9d增殖达到最高峰。自第3d开始,DAPT组OD值要低于对照组(n=6,P<0.05)。对照组与DAPT组ALP表达均在第7d达到峰值,第7d前两组之间ALP表达无明显差异(P>0.05),DAPT组在第7-11d时ALP表达要高于对照组,具有统计学差异(n=6,P<0.01)。结论:DAPT阻断Notch通路后,骨质疏松大鼠BMSC的增殖受到了抑制,但对于诱导骨质疏松大鼠BMSC向成骨细胞定向分化的能力是增强的。     

R-spondin1在促进人骨髓间充质干细胞成骨分化中的作用

目的:研究Wnt信号通路激活剂R-spondin1在人骨髓间充质干细胞(hBMSC)成骨分化中的作用.方法:用0、5、10、20 μg/L R-spondin1处理hBMSC,利用荧光素酶实验检测R-spondin1对hBMSC中Wnt信号通路的作用,Western blot检测R-spondin1对Wnt信号通路下游靶基因β-catenin蛋白表达的影响;在成骨分化培养基中添加20 μg/L R-spondin1诱导hBMSC成骨分化,检测R-spondin1对早期成骨分化指标ALP活性及成骨分化晚期钙沉积、成骨分化标志物OSX、OCN和成骨分化关键转录因子RUNX2表达的影响.结果:R-spondin1增强hBMSC中Wnt信号通路,R-spondin1增强ALP活性和钙沉积,促进OSX、OCN及RUNX2的表达.结论:R-spondin1增强hBMSC中Wnt信号通路的作用,促进hBMSC成骨分化.     

人胚胎干细胞向类间充质干细胞的诱导分化及鉴定

目的 建立诱导人胚胎干细胞向类间充质干细胞分化的方法,并鉴定细胞的生物学特性.方法 人胚胎干细胞在无血清条件下悬浮培养形成类胚体,10 d后在含血清条件下使类胚体贴壁生长,5～6 d后机械法剔除类胚体中心区高密度重叠细胞,保留周边铺展细胞并传代扩增.观察诱导分化与传代扩增后细胞的形态学变化;免疫荧光染色和流式细胞术进行细胞表型分析.取第5代细胞进行成脂、成骨和成软骨诱导,3～4周后运用特殊染色及RT-PCT技术检测细胞成脂、成骨及成软骨分化能力.结果 诱导分化后细胞具有与骨髓间充质干细胞相似的形态,扩增能力较强,多次扩增传代后细胞形态和增殖能力无明显改变.免疫荧光染色发现细胞表达中胚层标志波型蛋白(vimentin).流式细胞术分析显示,细胞表达CD29、CD105、CD166等间充质干细胞表面标志.特殊染色及RT-PCT检测结果显示,成脂诱导后多数细胞油红染色阳性,脂蛋白酶和leptin表达增加;成骨诱导后细胞茜素红染色阳性,碱性磷酸酶和Cbfa-1表达增加;成软骨诱导后细胞Ⅱ型胶原染色阳性,Ⅱ型胶原和软骨寡聚基质蛋白(COMP)表达增强.结论 成功诱导人胚胎干细胞向类间充质干细胞分化.分化获得的细胞增殖能力强,表达间充质干细胞的特异性标志,并具有多向分化潜能.     

VEGF与Notch信号通路对再生障碍性贫血患者骨髓间充质干细胞的调控机制研究

目的观察血管内皮生长因子(VEGF)通过Notch信号通路对再生障碍性贫血（AA）患者骨髓造血微环境的影响,探讨VEGF与Notch信号通路对骨髓间充质干细胞（MSC）的调控机制。方法选取AA患者与健康志愿者的骨髓MSC,VEGF干预后分别采用CCK-8法、流式细胞仪检测MSC细胞增殖、分化情况,分别采用Westernblot、qRT-PCR法检测MSCVEGF与Notch信号通路相关蛋白、基因表达情况,采用免疫荧光法检测MSC内皮分化能力。结果CCK-8法检测显示,VEGF的干预可明显上调AA患者MSC的增殖能力。流式细胞仪检测显示,VEGF通过阻断S期细胞促进AA患者MSC的增殖,抑制其凋亡。Westernblot、qRT-PCR法检测显示,AA患者MSCVEGF与Notch信号通路相关蛋白、基因表达受抑制,VEGF的干预可促进MSC的Notch信号通路传导。免疫荧光法检测提示,AA患者MSC内皮分化能力弱于正常MSC。结论VEGF或可通过Notch信号通路调控AA患者MSC,从而改善骨髓造血微环境。     

Notch信号通路与骨髓间充质干细胞分化的研究进展

骨髓间充质干细胞（MSCs）是来源于中胚层具有多向分化潜能和自我复制的一类干细胞,主要存在于全身结缔组织和多个器官间质中,其中在骨髓组织中含量最丰富。在不同的诱导条件下,MSCs可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞以及神经细胞等多种类型的组织细胞。Notch信号通路广泛存在于动物细胞中,在调节细胞增殖、分化和凋亡中发挥重要作用,它的配体和受体都是细胞膜表面蛋白,因此Notch信号是介导细胞间通讯的一种重要方式。在MSCs多条分化途径中都有Notch通路存在。该文针对Notch信号通路在MSCs向成骨细胞、软骨细胞及神经细胞分化中的作用予以综述。     

人骨髓间质干细胞向脂肪细胞诱导分化过程中端粒酶活性的变化

目的观察体外培养人骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成脂分化过程中端粒酶活性的变化规律,并探讨其可能的机制。方法通过贴壁培养法从人骨髓中分离MSCs,利用造血干细胞相关表面抗体对MSCs进行表型鉴定,利用相应诱导分化剂,诱导MSCs向成骨细胞、脂肪细胞和神经元样细胞分化,分析其多向分化潜能。以端粒重复序列扩增法(TRAP)检测MSCs及MSCs诱导成脂分化过程中端粒酶活性;以Western印迹法检测MSCs及MSCs诱导成脂分化过程中端粒酶反转录酶(hTERT)及端粒相关蛋白[端粒重复序列结合因子1(TRF1)、端锚聚合酶1(Tankyrase 1)]的表达水平。结果 TRAP法检测传代培养的MSCs端粒酶呈阴性表达,而MSCs诱导成脂分化过程中,端粒酶活性明显升高,以第7天最高(P<0.05),其后呈下降趋势;Western印迹法检测显示,hTERT在MSCs中有微弱表达,在MSCs诱导成脂分化过程中,hTERT和Tankyrase 1表达水平升高,以第7天最高,此后逐渐下降,而TRF1表达水平保持不变。结论体外培养的MSCs端粒酶呈微弱表达,MSCs在成脂诱导分化过程中,端粒酶活性先升高,其后逐渐下降,而Tankyrase 1可能在其中发挥重要作用。     

Notch-1在骨髓间质干细胞分化为神经细胞中的作用

目的观察Notch-1信号在骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经细胞中的作用。方法采用RNA干扰技术,构建小鼠Notch-1shRNA,转染小鼠MSC后诱导其分化为神经细胞;同时以未转染MSC和转染甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)shRNA为对照。采用免疫细胞化学染色和Western印迹检测巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经微丝蛋白200(NF200)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和Notch-1蛋白表达;原位末端标记染色评价细胞凋亡率。结果诱导6d后,转染Notch-1shRNA诱导后细胞形成较典型的神经细胞形态,同时高效表达巢蛋白、NSE和NF200等,不表达GFAP,对照组无此现象。但是转染mNotch-1shRNA后细胞凋亡率(13·3%±2·3%)显著高于对照组。结论MSC的横向分化过程可能与神经干细胞类似,阻断Notch信号通路,会增加MSC向神经细胞分化的效果。     

腺病毒介导的人内皮型一氧化氮合酶基因和增强型绿色荧光蛋白基因在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达

目的:研究腺病毒载体介导人内皮型一氧化氮合酶(human endothelial nitric oxide synthase,heNOS)和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)在体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymalstem cells,MSCs)的表达。方法:体外培养、扩增大鼠骨髓间充质干细胞,并对培养的细胞进行成骨、成脂肪诱导分化和细胞免疫表型鉴定;用Pme I线性化后去磷酸化的pShuttle-heNOS-EGFP转化含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态BJ 5183,使其在细菌内发生同源重组,获得阳性重组质粒pAdEasy-heNOS-EGFP。重组质粒经PCR、酶切和测序鉴定正确后经PacⅠ酶切,转入AD 293细胞,包装成重组腺病毒Ad-heNOS-EGFP。用重组腺病毒Ad-heNOS-EGFP对MSCs进行转染,并用荧光显微镜及免疫荧光染色法观察转染细胞内EGFP和heNOS蛋白质的表达。结果:pShuttle-heNOS-EGFP与pAdeasy-1在BJ 5183中成功地发生了同源重组,得到了重组腺病毒质粒pAdEasy-heNOS-EGFP。重组质粒在AD 293细胞中包装成重组腺病毒Ad-heNOS-EGFP。经基因转染的MSCs中高表达heNOS和EGFP。结论:采用腺病毒载体可以将外源性的heNOS基因转染至MSCs中,并得到有效表达,且携带的EGFP标记可以直观地检测靶细胞感染和外源基因的表达情况,这将为勃起功能障碍的细胞治疗提供一条新的途径。     

Wnt信号通路调控间充质干细胞成骨分化的研究进展

Wnt通路作为调控细胞生长、发育和分化的重要信号途径一直是医学研究的热点。近年来的研究表明,Wnt信号通路在调控间充质干细胞（MSCs）成骨分化过程中发挥重要作用,其机制已成为骨组织工程研究的热点,也为骨质疏松症等疾病的治疗提供了新思路。该文对Wnt信号通路调控MSCs成骨分化的研究进展进行综述。     

全骨髓培养法对大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定

目的探讨一种易操作、高效的分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的方法。方法采取全骨髓培养法分离和纯化大鼠MSCs,用显微镜观察细胞形态,用流式细胞仪检测mMSCs纯度和形态特征,观察MSCs在不同诱导条件下向成骨细胞及脂肪细胞分化的能力。结果全骨髓培养法培养的MSCs具有良好的贴壁性,形态均一,流式细胞仪检测:CD45、CD90分别为1.3%、98.6%。第3代MSCs经适当诱导后可向成骨细胞和脂肪细胞分化。结论全骨髓培养法从大鼠骨髓中分离培养出的MSCs纯度较高,稳定性好,且操作相对简便。     

骨髓间质干细胞在糖尿病性骨质疏松发病中的作用

1型或2型糖尿病人患骨质疏松症和发生骨折的风险明显增加,其机制可能是由于骨髓间质干细胞(BMSCs)的耗竭。糖尿病通过高血糖等多种因素影响成骨细胞功能和骨形成,诱导骨髓细胞中脂肪累积,减少可用于骨形成的成骨细胞的数量,其中过氧化物酶体增殖物激活受体γ在BMSCs向成骨细胞或脂肪细胞分化上起着关键的闸门作用。由于糖尿病降低骨密度主要通过影响骨形成而非骨吸收,增加成骨细胞产生和禁止BMSCs流向脂肪细胞的途径,在理论上是预防和治疗糖尿病骨质疏松症的最根本方法。