高压培养对血管内皮细胞t-PA和PAI-1的影响及卡托普利干预的效果

目的：高血压常伴有纤溶功能的异常,但其机制尚不清楚。本研究拟观察高静水压培养对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）t-PA和PAI-1的影响以及卡托普利的干预效果,并探讨其可能的作用机制。方法：选用第4～6代HU-VECs,接种于24孔培养板中。依培养压力分为3组：大气压组（0mmHg）,中压组（90mmHg）,高压组（180mmHg）。在同一压力组,根据不同药物干预又分为两个亚组。即对照组（Ctrl）和卡托普利组（Cap,10^-5mol/L）。每组6份标本。采用ELISA法测定上清液t-PA和PAI-1的抗原浓度,并用细胞内总蛋白进行标化（单位：ng/μg proteins）。同时测定细胞内Ca^2＋浓度（nmol/L）。结果：与大气压组相比,中压和高压组t-PA浓度均显著降低,PAI-1浓度显著增高,t-PA/PAI-1比值显著降低,[Ca^2＋]i也显著增高。卡托普利对大气压组的t-PA、PAI-1和[Ca^2＋]i无显著影响,但在两个高压组,卡托普利显著升高t-PA浓度,显著降低PAI-1浓度,t-PA/PAI-1比值显著升高,[Ca^2＋]i显著地降低。结论：高静水压可损害内皮细胞的纤溶功能,而卡托普利的干预可降低高压所升高的[Ca^2＋]i,并改善高静水压对内皮细胞纤溶功能的影响。     

高静水压培养对人脐静脉内皮细胞t-PA和PAI-1的影响

目的探讨高静水压培养对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）t—PA和PAI-1的影响及其可能的作用机制。方法选用第4～6代HUVECs，接种于24孔培养板中。依培养压力分为3组：大气压组（0mmHg），中压组（90mmHg）和高压组（180mmHg），每组18份标本。在同一压力组，根据不同药物干预又分为3个亚组：对照组（Ctrl组），双丁酰环磷腺苷组（DBA组，10μmoL／L）和硝普钠组（NP组，10^-4moL／L），每组6份标本。采用ELISA法测定上清液t-PA和PAI-1的抗原浓度，并用细胞内总蛋白进行标化，同时测定细胞内Ca^2＋浓度。结果与大气压组的对照组比较，中压和高压组t-PA浓度均显著降低（P〈0.01），PAI-1浓度显著增高（P〈0.01），t-PA／PAI-1比值显著降低（P〈0.01），[Ca^2＋]i也显著增高（P〈0.01）。cGMP诱导剂NP显著降低三个压力组的PAI-1浓度（P〈0.01）和增高t—PA／PAI-1比值（P〈0.05），cAMP的同功异构体DBA显著升高三个压力组的PAI-1浓度（P〈0．01，P〈0．05）。DBA和NP对t-PA浓度没有显著影响（P〉0.05）。结论高静水压可损害内皮细胞的抗纤溶功能。第二信使cAMP、cGMP和细胞内钙离子在此可能起调节作用。     

半边莲生物碱对内皮素诱导损伤的人血管内皮细胞纤溶系统的影响

目的：研究半边莲生物碱对内皮素诱导损伤的人血管内皮细胞的保护作用。方法：常规提取半边莲生物碱,培养人血管内皮细胞．ELISA法测定细胞培养上清中组织纤溶酶原激活物（t-PA）和纤溶酶原激活物抑制物-1（PAI-1）的含量。结果：内皮素组PAI-1含量显著高于正常对照组（P〈0．01）．t-PA含量在数值上低于正常对照组,但无统计学意义。半边莲生物碱各组PAI-1含量均低于内皮素组（P〈0．01）．与内皮素B受体拮抗剂BQ7S8作用相似。半边莲生物碱低剂量组t-PA含量高于内皮素组（P〈0．01）．高、中剂量组t-PA含量虽然有增高趋势．但无统计学意义。结论：内皮素能够使人血管内皮细胞释放PAI-1增加．半边莲生物碱通过抑制该效应而起到保护血管内皮细胞的作用。     

卡托普利对内皮细胞分泌组织型纤溶酶原激活物和纤溶酶原激活物抑制剂-1的影响

目的研究转换酶抑制剂卡托普利对内皮细胞组织型纤溶酶原激活物(t-PA)和纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)的影响.方法培养肺静脉内皮细胞(ECV304),分别用肿瘤坏死因子(TNF)-α(浓度为5、10、25、50、100μg/L)和血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)(5、10、25、50、100 nmol/L)刺激,在50μg/L TNF-α刺激的基础上用卡托普利(20、50、100、200 nmol/L)共育,用ELISA的方法检测培养上清中的t-PA和PAI-1的浓度.结果各浓度的TNF-α和AngⅡ刺激24 h后PAI-1的浓度明显增加,与空白对照相比P＜0.05,而t-PA的差异则无统计学意义;各浓度的卡托普利明显抑制TNF-α(50μg/L)诱导的PAI-1分泌增多,P＜0.05,而t-PA的变化不明显.结论TNF-α和AngⅡ可以增加内皮细胞PAI-1的分泌,卡托普利可以抑制TNF-α诱导PAI-1的分泌,而t-PA则不受TNF-α、AngⅡ和卡托普利等因素影响.     

辛伐他汀对内皮细胞分泌t-PA和PAI-1的影响

目的　研究HMG CoA还原酶抑制剂辛伐他汀对内皮细胞分泌t PA和PAI 1的影响。方法　培养肺静脉内皮细胞 (ECV30 4 ) ,分别用不同浓度TNF α刺激 ,在 5 0ng/mlTNF α刺激的基础上用辛伐他汀 ( 0 .1、1.0、5 .0、10 .0 μmmol/L)共育 ,用ELISA方法检测培养上清中的t PA和PAI 1的浓度。 结果　各浓度的TNF α刺激 2 4h后PAI 1的浓度明显增加 ,与空白对照相比 ,有显著性差异 (P <0 .0 1) ,而t PA变化没有统计学差异 ;各浓度的辛伐他汀明显抑制TNF α( 5 0ng/ml)诱导的PAI 1分泌增多 (P <0 .0 1) ,而该作用可被甲基戊酸逆转 ,同样t PA的变化不明显。结论　TNF α可以增加内皮细胞PAI 1的分泌 ,辛伐他汀可以抑制TNF α诱导的PAI 1的分泌 ,而该作用可被甲基戊酸逆转 ,t PA则不受TNF α、辛伐他汀、甲基戊酸等因素的影响。     

益气活血方对气虚血瘀型冠心病模型大鼠的影响研究

目的探讨益气活血方对气虚血瘀型冠心病模型大鼠的影响。方法32只SD大鼠随机分为空白组、模型组、益气活血方组和芪参益气滴丸组,每组8只。除空白组外,各组均采用“游泳力竭+控制饮食+结扎冠状动脉左前降支”制备病证结合气虚血瘀型冠心病动物模型,时间均为11 d。造模结束后,分别灌胃予以相应干预14 d。采集大鼠心电图,进行Morris水迷宫、旷场实验并HE染色、Masson染色,并采用ELISA检测血浆纤溶酶原激活物抑制剂-1(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)、血管性假血友病因子(von Willebrand factor,vWF)、组织型纤溶酶原激活剂(tissue-type plasminogenactivator,t-PA)的含量。结果与空白组比较,模型组心电图ST段抬高;Morris水迷宫实验潜伏期延长(P<0.01),穿台次数显著减少(P<0.01);旷场实验水平得分、垂直得分减少(P<0.05),中心活动时间延长(P<0.05),角落活动时间、周边活动时间均减少,焦虑程度降低(P<0.05或P<0.01);心肌细胞排列较紊乱,在梗死灶周围出现核破裂,血浆中PAI-1、vWF水平明显增高(P<0.05或P<0.01),t-PA水平明显降低(P<0.05)。与模型组比较,益气活血方组心电图ST段恢复正常;Morris水迷宫潜伏期显著缩短(P<0.01),穿台次数显著增加(P<0.01);旷场实验中心活动时间减少(P<0.05),角落活动时间延长(P<0.05),焦虑程度增高(P<0.05);梗死灶周围心肌细胞排列整齐,心肌细胞凋亡指数降低(P<0.05);血浆中PAI-1、vWF水平均降低(P<0.05或P<0.01),t-PA水平增高(P<0.05)。结论病证结合动物模型更能满足中西医结合研究的需要;益气活血方能有效修复气虚血瘀型冠心病模型大鼠心肌细胞损伤并改善记忆力减退、健忘、疲劳及反应迟钝的症状,且改善高凝状态的机制与调节vWF、PAI-1、t-PA水平有关。     

高压培养对血管内皮细胞t-PA和PAI-1的影响及卡托普利干预的效果

目的:高血压常伴有纤溶功能的异常,但其机制尚不清楚。本研究拟观察高静水压培养对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)t-PA和PAI-1的影响以及卡托普利的干预效果,并探讨其可能的作用机制。方法:选用第4～6代HU-VECs,接种于24孔培养板中。依培养压力分为3组:大气压组(0mmHg),中压组(90mmHg),高压组(180mmHg)。在同一压力组,根据不同药物干预又分为两个亚组。即对照组(Ctrl)和卡托普利组(Cap,10-5mol/L)。每组6份标本。采用ELISA法测定上清液t-PA和PAI-1的抗原浓度,并用细胞内总蛋白进行标化(单位:ng/μg proteins)。同时测定细胞内Ca2 浓度(nmol/L)。结果:与大气压组相比,中压和高压组t-PA浓度均显著降低,PAI-1浓度显著增高,t-PA/PAI-1比值显著降低,[Ca2 ]i也显著增高。卡托普利对大气压组的t-PA、PAI-1和[Ca2 ]i无显著影响,但在两个高压组,卡托普利显著升高t-PA浓度,显著降低PAI-1浓度,t-PA/PAI-1比值显著升高,[Ca2 ]i显著地降低。结论:高静水压可损害内皮细胞的纤溶功能,而卡托普利的干预可降低高压所升高的[Ca2 ]i,并改善高静水压对内皮细胞纤溶功能的影响。     

AP-1在血管内皮细胞PAI-1表达中的作用

目的 研究核转录因子激活蛋白-l(activator protein-l,AP-1)在肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)、弱氧化修饰低密度脂蛋白(minimal modified low density lipoprotein,mmLDL)诱导血管内皮细胞PAI-l基因表达中的转录调控机制。方法 进行人脐静脉内皮细胞(human vascular endothelial cells,HUVECs)的培养和鉴定。采用基因重组技术,构建4个含人PAI-l基因不同长度5′上游序列的荧光素酶报告基因质粒,并结合瞬时转染分析实验,初步确定PAI-l基因上游具有调控作用的是位于-823到-553之间的AP-l元件。为进一步确证AP-l元件的调控作用,采用PCR法对该元件进行定点突变。结果 TNF-α能明显诱导构建质粒pGL3-PAl-l-823／ 90荧光素酶的表达,但对质粒pGL3-PAl-l-823／ 90的3个突变体诱导作用明显降低;mmLDL也能明显诱导质粒pGL3-PAI-1-823／ 90荧光素酶表达,但对质粒pGL3-PAl-l-823／ 90的3个突变体的诱导作用不明显。结论 在TNF-α、mmLDL作用下,内皮细胞转录表达PAI-l基因过程中,3个AP-l元件起着重要的作用。     

IL-6诱导血管内皮细胞纤溶相关蛋白的表达

目的:观察IL-6对脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)表达组织纤溶酶原激活物(tPA)和纤溶酶原激活物抑制物1(PAI-1)的影响.方法:用生长良好的第2、3代HUVECs细胞进行实验,用CCK-8测定IL-6(0.125、0.25、0.5、1.2 ng/ml)作用前后细胞活性;用发色底物法测定0.5 ng/ml IL-6组和对照组(不加IL-6)培养上清液中tPA、PAI-1活性;进一步用RT-PCR检测细胞内tPA和PAI-1 mRNA水平.结果:与对照组相比, IL-6(≤0.5 ng/ml)对细胞增殖活性的影响无差异性.0.5 ng/ml IL-6组tPA活性在12～72 h显著升高(P<0.05),且显著上调tPA mRNA,12 h达到峰值,以后渐降,48 h mRNA达正常水平.而IL-6组PAI-1活性与PAI-1 mRNA表达与对照组无差异性.结论: IL-6可活化内皮细胞,显著上调HUVECs的tPA mRNA的转录和tPA分泌,诱发纤溶系统活化,而对PAI-1 mRNA或PAI-1活性无影响.IL-6的这种效应在炎症反应的病理生理过程中可能发挥重要作用.     

TF、TFPI、tPA、PAI1在DIC和DIC前期的检测及意义探讨

目的观察凝血和纤维蛋白溶解系统在弥漫性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation,DIC)前期和DIC期的变化,为早期发现和治疗DIC提供依据。方法ELISA法检测DIC前期、DIC期、非DIC患者血浆组织因子(tissue factor,TF)和组织因子途径抑制物(tissue factor pathway inhibitor,TFPI),组织型纤维蛋白酶原活化剂(tissue type plasminogen activator,t-PA)及其抑制物PAI-1(plasminogen activator inhibitor-1)和D-二聚体浓度。比较TF/TFPI和t-PA/PAI-1比值。结果在DIC发生发展过程中,TF、TFPI、t-PA、PAI-1和D-二聚体均增高,DIC前期TF/TFPI比值增高,DIC期t-PA/PAI-1比值增高。结论DIC的发生发展与凝血系统和纤维蛋白溶解系统失平衡有关,DIC前期TFPI对TF抑制不足可能是DIC凝血和血栓形成的主要原因,TF/TFPI可以作为DIC前期指标,提示有DIC趋势;DIC的出血可能主要与PAI-1对t-PA抑制不足继发纤维蛋白溶解亢进相关,该研究可为今后应用抗纤维蛋白溶解药物治疗DIC提供理论依据。     

益气活血化痰汤对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织VEGF和ICAM-1基因表达的影响

【目的】观察益气活血化痰汤对溃疡性结肠炎(UC)模型大鼠结肠黏膜血管内皮细胞生长因子(VEGF)和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)基因表达的作用。【方法】采用三硝基苯磺酸(TNBS)法复制UC大鼠模型,将60只大鼠分为正常组,模型组,中药高、中、低剂量组(剂量分别为52、26、13 g·kg~(-1)·d~(-1))和美沙拉嗪组(剂量为0.5 g·kg~(-1)·d~(-1)),分别检测各组大鼠体质量、结肠黏膜病理变化,以及肠黏膜VEGF、ICAM-1基因表达水平。【结果】模型组体质量显著降低,结肠黏膜出现明显病理改变,VEGF和ICAM-1基因相对表达量均显著高于正常组(P0.01)。中药各剂量组均可显著升高大鼠体质量,改善结肠黏膜病理变化,显著降低VEGF、ICAM-1表达水平(P0.01),其中中药高剂量组作用更佳。【结论】益气活血化痰汤对VEGF和ICAM-1基因表达有下调作用,这可能是其治疗UC作用的机理之一。     

过氧化损伤对培养人内皮细胞纤溶效应的影响

血管内皮细胞具有纤溶功能，其表现之一为内皮细胞表面的特异性受体与纤溶系统的启动因子——组织型纤溶酶原激活物（ｔＰＡ）结合，结合后ｔＰＡ活性明显增高且免受其抑制物（ＰＡＩ）的灭活，从而使内皮细胞纤溶活性升高。本实验用联胺作用于内皮细胞，诱发内皮细胞过氧化损伤，用放射性核素测定及放射自显影方法观察内皮细胞损伤前后与ｔＰＡ结合力的改变。结果表明：内皮细胞过氧化损伤后与ｔＰＡ结合力明显下降。提示内皮细胞损伤后纤溶活性降低的可能机制与二者结合力下降有关。     

参附对失血性休克大鼠肝脏TF,TM,t-PA,PAI-1 mRNA表达的影响

目的：探讨失血性休克大鼠肝脏组织组织因子（TF）、血栓调节蛋白（TM）、组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）和纤溶酶原激活剂抑制物-1（PAI-1）的表达情况以及参附注射液的干预作用。方法：成年健康SD大鼠分成4组：对照组、休克组、林格液组、参附液组。对照组常规饲养,其余3组大鼠复制失血性休克模型。休克组不予治疗,林格液组用3倍失血量的林格液治疗,参附组用含参附注射液（10 mL/kg）和林格液组成的3倍失血量的液体治疗。治疗后2 h取肝脏组织,-70℃保存,用逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）法检测肝脏组织中t-PA,PAI-1和TF,TM mRNA的表达。结果：①休克组肝脏组织TF,TM,t-PA,PAI-1 mRNA表达与对照组相比明显升高（P〈0.05）。②林格液组肝脏组织TF,TM,t-PA,PAI-1 mRNA表达与对照组及休克组比较明显升高（P〈0.05）。③参附液组肝脏组织TF,TM,t-PA,PAI-1 mRNA与对照组相比较,差异无显著性,与休克组及林格液组比较表达有降低,差异有显著性（P〈0.05）。结论：休克状态下肝脏组织及内皮细胞损伤持续存在,参附注射液可使凝血活性下降,同时又可防止纤溶过度亢进。     

RT-PCR半定量法检测人脐静脉内皮细胞t-PA和PAI-1 mRNA表达

目的 建立一种敏感的检测组织型纤溶酶原激活物（ｔ－ＰＡ）及其抑制剂（ＰＡＩ－１）基因表达的方法。方法 用异硫氰酶胍一步法提取细胞总ＲＮＡ。用单管ＲＴ＿ＰＣＲ法逆转录－扩增ｔ－ＰＡ、ＰＡＩ－１和内参照三磷酸甘油醛脱氢酶（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡ，扩增产物经电泳分离后，用凝胶图像分析仪照相和扫描分析，测定各条带分子量和光密度值。结果 ＰＣＲ产物均与预期长度相吻合，且ＰＣＲ产一与扩增初始模板量之间存在良好的     

凝血酶对U937细胞uPAR mRNA表达的影响

目的 研究凝血酶通过凝血酶受体（ＴＲ）对细胞ｕＰＡＲ ｍＲＮＡ表达的影响。方法 在凝血酶、灭活凝血酶、和抗ＴＲ小肽多抗等作用下,以ＲＴ－ＰＣＲ法测定培养Ｕ９３７细胞ｕＰＡＲ ｍＲＮＡ的表达量。结果 凝血酶增强ｕＰＡＲ ｍＲＮＡ表达呈现凝血酶剂艇时间的依赖性。其作用机制与凝血酶和细胞膜上ＴＲ间的结合、以及凝血酶的蛋白水解活性有关。高浓度凝血酶或中等浓度凝血酶在延长作用时间长,对Ｕ９３７细胞ｕＰＡＲｍ     

转染Smad7基因的大鼠肾系膜细胞uPA及PAI-1表达的改变

目的通过对大鼠肾小球系膜细胞(mesangial cell，MsC)转染Smad7基因，观察转染阳性细胞克隆uPA及PAI-1表达的改变，以进一步阐明Smad7阻断组织纤维化过程的作用机制。方法经脂质体介导将含有Smad7重组表达质粒转染大鼠MsC，用G418筛选及PT-PCR、Western blot法鉴定；又分别采用RT-PCR与Western blot法，检测转染阳性细胞克隆uPA及PAI-1表达改变。结果成功建立高表达Smad7的阳性MsC克隆(S-22、S-26)，并证实其uPA mRNA及蛋白表达明显增加，而PAI-1 mRNA及其蛋白的表达显著下降。结论Smad7可能通过增强组织内uPA酶的生成和减少PAI-1的合成而减轻组织纤维化进展。     

重组尿激酶原对人肺动脉内皮细胞u-PA系统的影响

目的探讨重组尿激酶原对体外培养的正常人肺动脉内皮细胞(HPAECs)尿激酶型纤溶酶原激活物系统表达的影响。方法将重组尿激酶原0或150 IU/mL与人肺动脉内皮细胞共同孵育8 h,收集培养上清并应用ELISA方法检测其中尿激酶型纤溶酶原激活物受体(u-PAR)和纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)的含量;将重组尿激酶原(0~150 IU/mL)分别与HPAECs共同孵育(0~24 h),提取细胞总RNA并应用RT-PCR技术检测尿激酶型纤溶酶原激活物(u-PA)mRNA表达的变化。结果细胞培养上清ELISA实验表明,与对照组相比,重组尿激酶原150 IU/mL组细胞培养液中u-PAR的含量显著增加〔(0.51±0.04)μg/Lvs(0.58±0.05)μg/L,P=0.005;〕PAI-1的含量显著下降〔(66.75±7.92)μg/Lvs(53.38±12.18)μg/L,P=0.009〕。RT-PCR结果表明,HPAECs与重组尿激酶原150 IU/mL共同培养后0 h、4 h、8 h、12 h和24 h 5个时间点u-PA条带与GAPDH条带平均光密度之比分别为(0.34±0.11)、(0.51±0.12)、(0.58±0.12)、(0.50±0.18)和(0.35±0.10)。其中8 h组与对照组相比差异有统计学意义,8 h组与24 h相比P=0.053。结论重组尿激酶原能够明显促进HPAECs释放u-PAR并显著抑制PAI-1的表达和释放。重组尿激酶原能够呈时间依赖性提高u-PA mRNA在HPAECs的表达。重组尿激酶原直接影响人肺动脉内皮细胞u-PA系统的表达,该作用可能是增强药物本身溶栓疗效的一种重要途径。