肠道病毒71型VP1基因的扩增、克隆、表达及蛋白分析

目的 对肠道病毒71型VP1基因片段进行扩增、克隆、生物信息学分析、原核表达、纯化,初步证实重组表达产物的生物学活性。方法 根据GenBank中EV71序列设计一对特异性引物,以EV71患者咽拭子标本中提取病毒核糖核酸为模板,RT-PCR扩增EV71 VP1基因,酶切后插入表达载体pET28a。构建pET28a-EV71 VP1原核表达载体。转化E.coli DH5α,IPTG诱导表达,使用SDS-PAGE及Western blot分析表达结果,利用软件对测序结果进行生物信息学分析。纯化蛋白并包被反应板,用ELISA分别检测EV71阳性与COX A16阳性患者VP-1IgG抗体,进行统计学分析。结果 目的基因经BLAST比对,同源性与GenBank登录号为JQ766207.1 EV71 VP1一致性达99%。EV71 VP1蛋白相对分子质量约为32×103,主要以包涵体形式存在。生物信息学分析得出,EV71 VP1蛋白为亲水性蛋白,无跨膜区,不具有N-端信号肽序列,存在三级结构。ELISA结果显示EV71阳性患者OD值为(2.425±0.521),COX A16阳性患者OD值为(1.205±0.314),健康对照组OD值为(0.353±0.128)。EV71 VP1蛋白检测敏感性和特异性分别为84%和88%。结论 成功构建了pET28a-EV71 VP1表达载体;通过对手足口患者血清进行ELISA初步分析,得出目的蛋白有较高的敏感性和特异性,初步证实具有生物学活性,可进一步用于EV71诊断及疫苗的相关研究。     

不同方法检测肠道病毒71型IgM抗体在手足口病诊断中的意义

目的：研究免疫层析法（ICA）和酶联免疫吸附法（ELISA）检测肠道病毒71型（EV71）IgM 抗体在手足口病诊断中的意义。方法采集135例手足口病确诊患儿和44例排除手足口病诊断的患儿血清标本,采用ICA及ELISA检测EV71 IgM 抗体。结果135例手足口病患儿,ICA、ELISA 检测 EV71 IgM 抗体阳性率分别为21．48％（29/135）和20．74％（27/135）;44例非手足口病患儿,ICA、ELISA检测EV71 IgM抗体阳性率均为0．00％（0/44）。结论ICA或ELISA检测EV71 IgM抗体阳性者均可确诊为手足口病,但检测结果为阴性者,不能排除手足口病的可能性,应结合临床表现进行诊断。     

西安市手足口病肠道病毒71型分离株VP1区基因特征分析

目的：了解西安市2012年手足口病肠道病毒71型分离株VP1区基因特征,探讨基因型与病情轻重间的关系。方法采集肠道病毒71型（EV71）患者咽拭子或粪便标本,按等概率法随机选择6例普通型和6例重型EV71分离株,用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）对EV71分离株进行VP1区基因扩增及核酸测序,并将测序结果与EV7各基因型代表株进行同源性和遗传进化分析。结果12株EV71分离株的基因型为C4基因亚型,其与C4亚型代表株VP1区核苷酸和氨基酸同源性最高,分别91.8%~93.0%和98.3%~99.3%,6例普通型和6例重型EV71分离株在VP1基因型区无明显差异,对12株EV71分离株进行遗传进化分析显示,12株流行株与C4亚型代表株聚集于同一个分支。结论西安12株EV71流行株的基因型属于C4亚型,基因型与病情严重程度可能无关。     

肠道病毒71型VP1蛋白原核表达及初步鉴定

目的采用分子克隆技术,构建肠道病毒71型(EV71)VP1全长基因大肠杆菌原核系统表达载体,诱导重组VP1融合蛋白表达。方法自EV71感染患者血清中提取病毒总RNA,进行一步法RT-PCR,扩增编码VP1蛋白的全长基因片段(891 bp),以pET32(a)为表达载体,构建重组表达质粒pET32(a)-VP1,转化E.coli.Rosseta感受态细胞,获得重组工程菌株。经诱导培养,SDS-PAGE电泳,免疫印迹鉴定表达产物。结果获得了含重组表达质粒pET32(a)-VP1的正相阳性工程菌株,经IPTG诱导能高效表达VP1融合蛋白。结论重组工程菌可表达VP1融合蛋白,对研究EV71发病机制及疫苗研制具有重要意义。     

2011~2012年武汉地区肠道病毒71型VP1基因的遗传进化分析

摘要：目的：观察武汉地区手足口病（HFMD）患儿肠道病毒71型（EV71）的基因型及其重组特点。 方法：收集2011年4月至2012年3月武汉地区1 844例HFMD患儿EV71阳性的咽拭子标本并进行病毒分离鉴定,对124株EV71病毒分离株的508 bp VP1基因序列进行测序,选择2株来自重症和1株来自轻症患儿的EV71毒株,构建VP1序列系统进化树并分析其全基因组序列的重组特点。 结果：VP1序列系统进化分析显示,124株EV71型均属于C4基因型,其中56株属于C4a亚群,68株属于C4b亚群,Bootscan和5′UTR、P1、P2、P3区的进化树证实3株EV71分离株均为亲本株C4a型毒株guangdong/GD/CHN/2009和C4b型毒株SHZH98/GD/CHN/1998在P2区2A-2B基因交界处发生型内重组所产生。 结论: 2011年4月至2012年3月武汉市及周边地区的EV71分离株均为C4基因型,与1998年以来中国大陆的优势株流行一致,且C4基因型存在型内重组现象。     

湖北省手足口病肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型VP1基因特征

目的 了解湖北省手足口病肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A组16型（Cox A16）的VP1基因特点,研究该省EV71和Cox A16的基因型别及分子进化特征。方法 对2014-2015年湖北省26株EV71和27株Cox A16流行株的VP1基因测序,分析其同源性和遗传进化特征。结果 2014-2015年湖北省EV71和Cox A16流行株VP1核苷酸和蛋白氨基酸序列同源性均较高,EV71流行株的蛋白氨基酸和核苷酸序列同源性分别为97.6%~100.0%和92.3%~100.0%。Cox A16流行株的蛋白氨基酸和核苷酸序列同源性分别为96.6%~100.0%和92.3%~100.0%。EV71的VP1基因系统进化分析表明,湖北省流行的EV71与我国其他地区流行的EV71均位于一个大的分支上,均为C4基因型的C4a亚型。Cox A16流行株与B1b亚型代表株位于同一分支上,主要为B1b亚型。结论 2014-2015年湖北省EV71和Cox A16流行株分别为C4a亚型和B1b亚型,其核苷酸和氨基酸与国内外其他地区的手足口病病毒株均有较高同源性。     

噬菌体展示技术筛选人肠道病毒71型3A 蛋白相互作用蛋白

目的：利用 T7噬菌体展示技术筛选与人肠道病毒71型3A 蛋白相互作用的蛋白。方法构建3A 蛋白的原核表达载体,表达并纯化3A 蛋白,以3A 蛋白为靶蛋白,应用 T7噬菌体展示技术对人肝细胞 cDNA 文库进行筛选,对筛选到产物进行DNA 序列分析及同源性研究。结果表达并纯化了3A 蛋白,经过4轮筛选后,选择37个阳性克隆,采用 T7特异性引物扩增插入片段,将 PCR 产物送公司进行测序。经过同源性分析,确定了2个与人肠道病毒3A 蛋白相互作用蛋白。结论通过 T7噬菌体展示技术可以得到与3A 蛋白相互作用蛋白,通过研究此蛋白的功能就可以初步推测出3A 蛋白可能的功能,为进一步研究人肠道病毒的致病机制鉴定了基础。     

982例手足口病患者EV71-IgM抗体检测结果分析

目的研究临床就诊的手足口病肠道病毒71型(EV71)型分布特征。方法以黄梅县人民医院2012年5～11月急性期就诊病例为研究对象,用酶联免疫吸附试验检测患者血浆中EV71-IgM抗体来确诊。结果在就诊的982例患者中检出EV71阳性383例(39.0%),其中男250例,女133例,男女阳性检出比为1.88∶1;检出阳性年龄最小4个月,最大10岁,平均2.133岁,6个月至3岁年龄组检出阳性344例,占阳性总数的89.8%,以6个月至3岁的婴幼儿检出为主(χ2=144.10,P=0.000);阳性383例测量均值为1.212±0.101,中值为0.864。结论 6个月龄至3岁为HFMD EV71的重点感染人群,男性较女性易感染。HFMD仍然是黄梅县重要的公共卫生问题,其中EV71在黄梅县婴幼儿中感染率较高,应引起重点关注,并对临床可能出现重病病例保持高度警惕。     

肠道病毒71型手足口病ELISA诊断试剂盒研制与临床应用

目的 研制早期快速检测抗肠道病毒71型(EV71)抗体的ELISA血清学诊断性试剂盒,评价其临床应用价值.方法 将表达纯化的EV71重组蛋白VP1作为包被抗原,建立EV71型手足口病间接ELISA的血清学检测方法 .通过与逆转录(RT)PCR方法 、EV71病毒分离试验和微量血清中和试验比较,评价抗.EV71 IgM和抗-EV71 IgG血清学诊断方法 在EV71型手足口病的诊断价值.结果 与RT-PCR比较,抗-EV71 IgM敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为83%、85%、81%和87%;抗.EV71 IgG敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为72%、74%、68%和77%.与EV71病毒分离方法 比较,抗-EV71 IgM敏感度、特异度分别为85%和97%;抗-EV71 IgG敏感度、特异度分别为75%和77%.通过直线相关分析发现,抗-EV71 IgG抗体滴度和中和抗体滴度呈显著正相关(r=0.72,P＜0.05).EV71型手足口病患儿恢复期血清抗IgG滴度较急性期升高(P＜0.01),但抗IgM滴度差异无统计学意义(P＞0.05).结论 利用VP1重组蛋白作为包被抗原,成功开发ELISA检测人血清抗-EV71 IgM和抗-EV71 IgG抗体的诊断试剂盒.     

肠道病毒71型感染

1 引言 新型肠道病毒指的是1969年以后鉴定的,除脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒以后,陆续发现符合肠道病毒的理化特性的小RNA病毒.新型肠道病毒感染即由新型肠道病毒所引起的感染.     

82例肝细胞癌患者高尔基体蛋白73的检出与分析

目的：通过定量检测肝细胞癌、慢性肝炎肝硬化患者及健康者血清中高尔基体蛋白73（GP73）和甲胎蛋白（AFP）水平,对比分析GP73与AFP的检出率,探讨GP73用于诊断肝细胞癌的临床意义。方法收集健康者、慢性肝炎肝硬化及肝细胞癌患者血清样本,分别采用酶联免疫吸附测定法和化学发光法检测GP73和 AFP。结果在肝细胞癌患者血清中,GP73检出率为75．61％,AFP检出率为40．24％,GP73明显高于AFP ,差异有统计学意义（P＜0．01）;慢性肝炎肝硬化患者GP73检出率为12．58％,AFP检出率为41．67％,GP73检出率明显低于 AFP ,差异有统计学意义（P＜0．01）;健康者GP73检出率为1．67％, AFP检出率为6．67％,两者比较差异无统计学意义（P＞0．05）。在健康者和慢性肝炎肝硬化患者中GP73特异度为93．42％, AFP特异度为77．78％;ROC曲线分析显示GP73和AFP的曲线下面积分别为0．9341和0．8066,GP73与AFP两者联合检测对肝细胞癌的检出率为87．80％。结论 G P73在健康者中检出率和水平极低,慢性肝炎肝硬化患者为12．58％,肝细胞癌患者高达75．61％。ROC曲线分析与检出率基本一致。GP73在肝细胞癌患者中检出率高,特异度强,是早期诊断肝细胞癌的首选标志物。联合GP73和AFP检测可以提高对肝细胞癌的早期诊断率。     

两种不同方法检测肠道71型病毒的比较

目的研究不同方法检测肠道71型病毒的灵敏度和特异性。方法采集135例临床确诊为手足口病患儿和44例临床确诊为非手足口病患儿血清,分别用免疫层析法（ICA）和酶联免疫吸附试验（ELISA）检测抗肠道71型病毒IgM抗体。结果ICA法检出阳性病例29例,ELISA法检出阳性病例27例;ICA法和ELISA法的灵敏度分别为21．48％和20．0％,特异性为100％。结论ICA法和ELISA法均具有较高特异性,但其灵敏度较低。     

激活素受体相互作用蛋白2在ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块中表达的研究

目的研究激活素受体相互作用蛋白2（activin receptor-interacting protein 2,ARIP2）在小鼠动脉粥样硬化（AS）斑块组织中的表达情况,探讨其与AS斑块的相互关系;检测小鼠血清基质金属蛋白酶9（MMP-9）水平,探讨其与AS的关系。方法载脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠16只,随机分为两组,其中空白对照组给予普通饲料,高脂模型组给予高脂饲料。饲养8周后,分离血清检测MMP-9、甘油三酯（TG）及总胆固醇（TC）水平。采用免疫组织化学法检测小鼠AS斑块中ARIP2的表达水平。采用相关分析方法分析MMP-9与ARIP2表达水平的关系。结果①高脂模型组比空白对照组血清MMP-9、TG及TC水平升高,MMP-9（405.76±53.82）μg/L vs（335.78±46.57）μg/L,TG（1.54±0.35）mmol/L vs（1.13±0.28）mmol/L,TC（23.72±5.43）mmol/L vs（17.59±4.30）mmol/L（P〈0.05或〈0.01）。②苏木素-伊红（HE）染色结果显示：空白对照组主动脉内膜稍增厚,泡沫细胞极少;高脂模型组主动脉内膜明显增厚,可见大量泡沫细胞,胞体增大,胞浆呈空泡状。③ARIP2在空白对照组中表达量很低,而在高脂模型组中呈强阳性表达,其表达量分别为365.46±132.71 vs 1 536.73±634.92（P〈0.01）。血清MMP-9水平与ARIP2的表达量呈正相关（r=0.853,P〈0.05）。结论小鼠AS组织中ARIP2表达明显上调,调节激活素信号转导,干预ARIP2表达水平有望成为动脉粥样硬化治疗的一种新手段。     

心肌营养素-1 ELISA测定法的建立及初步应用

目的 应用生物素-链霉亲和素酶联免疫吸附法(BSA-ELISA)建立血浆心肌营养素-1(CT-1)测定法,并初步应用于冠心病患者血浆CT-1水平的检测。方法 用鼠抗重组人CT-1单抗包被酶标板,加入待测抗原,并依次加入生物素化羊抗重组人CT-1多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记链霉亲合素,用H2O2-邻苯二胺显色。检测35名冠心病患者及对照组血浆CT-1含量的变化。结果 方法的线性范围为10～2000pg／ml,检测下限为10pg／ml,批内变异系数为1．76％～7．64％,批间变异系数为5．96％～9．04％。结论 该方法简便、快速,特异性、敏感性、重复性均在临床检测可接受范围内,标准曲线线性良好,适用于基础研究与临床检验。     

某市乙型肝炎病毒五项检测的结果分析

目的 了解某市高中生乙型肝炎病毒感染情况及乙肝预苗接种情况.方法 2011年9～10月对某市3 869例14～17岁高中生进行乙型肝炎病毒两对半检测,其中来自农村的学生1 975例,城区学生1 894例,并对结果进行分析.结果 农村学生1 975例,HBsAg阳性112例,阳性率5.67%;抗-HBs阳性745例,阳性率37.7%.城区学生1 894例,HBsAg阳性30例,阳性率1.58%;抗-HBs阳性867例,阳性率45.8%.农村学生和城市学生各指标比较,差异有统计学意义(P<0.05).结论 高中生乙型肝炎病毒感染在一定程度上存在,疫苗的接种率偏低.     

酶联免疫吸附法检测梅毒抗体试验灰区结果分析

目的：分析梅毒酶联免疫吸附法（TP-ELISA）在更换为两步法后的灰区结果。探讨适宜的梅毒检测操作规程以减少误诊。方法随机选取50288例血清标本进行TP-ELISA法筛查;对处于灰区的样本,再进行快速血浆反应素试验（RPR）和梅毒螺旋体明胶凝集试验（T PPA ）进行验证。按疾病及年龄段分组,统计各组抗梅毒抗体灰区率。结果50288例血清样本,经过TP-ELISA法初筛灰区结果为61例。不同年龄段造成的灰区率61岁以上年龄段最高。结论 TP-ELISA 检测仍存在一定的假阳性,设定合理的灰区范围,对灰区内的样本进行确认试验具有重要的临床意义。     

脂肪因子Omentin-1与妊娠期糖尿病相关性研究

目的观察妊娠期糖尿病(GDM)患者血清脂肪因子Omentin-1水平变化,并探讨其临床意义。方法采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法定量85例GDM及匹配设置的85例糖耐量正常孕妇(NGT)血清Omentin-1水平,同时检测两组糖脂生化指标、炎性指标、空腹胰岛素(FINS)水平,计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)。结果 GDM组孕前体质量指数(BMI)、超敏-C反应蛋白(hs-CRP)、血脂、血糖、FINS及HOMA-IR均明显高于NGT组,血清Omentin-1明显低于NGT组,差异有统计学意义(P0.05)。产前肥胖和/或HOMA-IR≥2时,血清Omentin-1水平明显降低。血清Omentin-1与高密度脂蛋白(HDL)呈正相关,而与孕前BMI、产前BMI、FPG、FINS及HOMA-IR呈负相关。多元逐步回归分析孕前BMI、三酰甘油(TG)、空腹血糖(FPG)、FINS是GDM血清Omentin-1的独立影响因素。结论血清Omentin-1与GDM关系密切,反映孕妇糖、脂代谢紊乱和胰岛素抵抗程度,可能直接参与了GDM疾病的发生和发展。     

Mutation in enterovirus 71 capsid protein VP1 confers resistance to the inhibitory effects of pyridyl imidazolidinone

Enterovirus 71 is one of the most important pathogens in the family of Picornaviridae that can cause severe complications in the postpoliovirus era, such as encephalitis, pulmonary edema, and even death. Pyridyl imidazolidinone is a novel class of potent and selective human enterovirus 71 inhibitor. Pyridyl imidazolidinone was identified by using computer-assisted drug design. This virologic investigation demonstrates that BPR0Z-194, one of the pyridyl imidazolidinones, targets enterovirus 71 capsid protein VP1. Time course experiments revealed that BPR0Z-194 effectively inhibited virus replication in the early stages, implying that the compound can inhibit viral adsorption and/or viral RNA uncoating. BPR0Z-194 was used to select and characterize the drug-resistant viruses. Sequence analysis of the VP1 region showed that the resistant variants differed consistently by seven amino acids in VP1 region from their parental drug-sensitive strains. Site-directed mutagenesis of enterovirus 71 infectious cDNA revealed that a single amino acid alteration at the position 192 of VP1 can confer resistance to the inhibitory effects of BPR0Z-194.