let-7e甲基化沉默在卵巢癌中的作用

目的:研究let-7e甲基化沉默在卵巢肿瘤中的作用。方法:采用q MSP、RTPCR法检测30例卵巢组织、A2780细胞系(A2780、A2780/CP)中let-7e甲基化水平及let-7e表达。采用DNA甲基化酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)处理A2780/CP细胞,检测let-7e表达。结果:let-7e所在区域富含Cp G岛。高甲基化时,卵巢癌组织和细胞中let-7e表达量降低,let-7e表达与DNA甲基化呈负相关(r=-0.6194,P=0.0003)。5-Aza-CdR处理卵巢癌细胞后,let-7e表达明显升高。结论:卵巢癌组织和细胞中let-7e表达受DNA甲基化负调控。DNA甲基化下调let-7e表达可能参与卵巢癌的发生及进展,也与卵巢癌化疗耐药有关。     

卵巢癌顺铂耐药细胞系的建立及耐药机制的研究

顺铂 (ｃｉｓｐｌａｔｉｎ ,ＤＤＰ)是一种有效的抗肿瘤药物 ,耐药的产生极大地影响卵巢癌患者对化疗的敏感程度 ,限制了其临床疗效[1] 。本研究采用中等浓度、间歇作用[2 ] 的方法 ,于 1998年 12月到 1999年 5月建立了人卵巢癌细胞株ＳＫＯＶ3对顺铂耐药细胞系ＳＫＯＶ3/ＤＤＰ ,对耐药指数、细胞周期分布、细胞内谷胱甘肽 (ＧＳＨ )含量、拓扑异构酶Ⅱ(ＴＯＰⅡ )含量及活性进行检测 ,从细胞水平、分子生物学水平对其基本特征及耐药机制进行研究。1　材料与方法1 1　研究资料　人卵巢癌细胞株ＳＫＯＶ3购自北京医科大学妇科教研室 ,细胞株…     

卵巢癌顺铂耐药的分子机制研究进展

顺铂耐药是卵巢癌术后复发和预后不良的重要原因之一.卵巢癌的顺铂耐药机制复杂,除抑癌基因、癌基因、耐药相关基因的改变外,还涉及染色体改变、细胞解毒过程及DNA损伤修复能力的增强以及细胞骨架、热休克蛋白表达异常等,对其分子机制的了解有助于指导卵巢癌临床治疗方案的选择.     

脱氧氟尿苷逆转人卵巢癌细胞系顺铂耐药的研究

脱氧氟尿苷(FUDR)是高效低毒的新一代氟尿嘧啶类抗肿瘤药物,尚未见有关FUDR用于逆转肿瘤耐药的报道。本研究采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、原子吸收分光光度法、免疫组化SP法等方法,分析了FUDR对卵巢癌细胞系SKOV3/DDP顺铂敏感性的影响,并初步探讨其逆转机制,为临床耐药逆转提供理论依据。     

卵巢癌顺铂耐药的分子机制研究进展

顺铂耐药是卵巢癌术后复发和预后不良的重要原因之一,卵巢癌的顺铂耐药机制复杂,除抑癌基因、癌基因、耐药相关基因的改变处,还涉及染色体改变、细胞解毒过程及DNA损伤修复能力的增强以及细胞骨架、热休克蛋白表达异常等,对其分子机制的了解有助于指导卵巢癌临床治疗方案的选择。     

核苷酸切除修复与卵巢癌顺铂耐药

DNA操作修复能力增强是导致卵巢顺铂耐药的主要原因之一。由铂-DNA加合物引起的DNA损伤修复主要通过核苷酸切除修复途径，该签字径涉及多种蛋白，包括损伤识别、切开、切除、修复合成和DNA连接等5个步骤，大量基础和临床研究表明核苷酸切除修复基因表达水平的增加与卵巢癌顺铂耐药相关联。应用基因治疗、化疗增效液晶或联合化疗抑制肿瘤细胞的DNA修复能力将增加卵巢癌患者顺铂敏感性。     

核苷酸切除修复与卵巢癌顺铂耐药

DNA损伤修复能力增强是导致卵巢癌顺铂耐药的主要原因之一,由铂-DNA加合物引起的DNA损伤修复主要通过核苷酸切除修复途径,该途径涉及多种蛋白,包括损伤识别、切开、切除、修复合成和DNA连接等5个步骤.大量基础和临床研究表明核苷酸切除修复基因表达水平的增加与卵巢癌顺铂耐药相关联.应用基因治疗、化疗增效剂或联合化疗抑制肿瘤细胞的DNA修复能力将增加卵巢癌患者顺铂敏感性.     

CTHRC1对卵巢癌细胞顺铂耐药的作用及机制研究

目的:探究胶原三股螺旋重复蛋白1(CTHRC1)对卵巢癌细胞顺铂耐药的作用及其相关机制。方法:Western blot法检测卵巢癌细胞株A2780、SKOV3及顺铂耐药细胞株A2780/DDP、SKOV3/DDP中CTHRC1蛋白表达水平。慢病毒lenti-sh CTHRC1转染SKOV3/DDP细胞,下调CTHRC1表达水平。CCK-8法检测沉默CTHRC1后SKOV3/DDP细胞增殖情况及顺铂半数抑制浓度(IC_(50))的变化。Western blot法检测转染后SKOV3/DDP细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的表达情况及Akt、STAT3的磷酸化水平。结果:与A2780和SKOV3细胞相比,顺铂耐药细胞株A2780/DDP和SKOV3/DDP细胞中CTHRC1蛋白表达水平相对较高(P0.05)。靶向下调CTHRC1表达后,SKOV3/DDP-sh CTHRC1细胞的增殖能力无明显变化,但顺铂的IC_(50)显著降低(P0.01),Akt、STAT3磷酸化水平受到抑制,Bcl-2表达水平降低(P0.05)。结论:CTHRC1可能通过Akt、STAT3信号通路,调节抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,继而影响卵巢癌细胞对顺铂的敏感度。     

奥曲肽逆转人耐顺铂卵巢癌细胞耐药性及其机制研究

目的观察奥曲肽(octreotide,OCT)逆转人耐顺铂卵巢癌细胞SKOV3/DDP耐药性的作用,并探讨其机制。方法 2009年7月至2010年1月于东南大学医学院中心实验室进行本实验。MTT法及流式细胞术观察顺铂、奥曲肽联合作用后人卵巢癌耐顺铂细胞株SKOV3/DDP增殖与凋亡的变化。实时荧光定量PCR检测奥曲肽对SK-OV3/DDP细胞生长抑素受体-2(somatostatin receptor-2,SSTR2)、多药耐药基因-1(multiple drug resistance-1,MDR1)、多药耐药相关蛋白-2(multidrug resistance related protein-2,MRP2)mRNA表达的影响。结果奥曲肽与顺铂有协同抗卵巢癌耐顺铂细胞增殖的效应,奥曲肽在质量浓度2.5～20mg/L能显著降低顺铂的IC50(P<0.05),提高细胞的凋亡率(P<0.05)。SKOV3/DDP细胞有SSTR2mRNA表达,但奥曲肽对SSTR2mRNA表达的调节作用不明显,奥曲肽显著降低SKOV3/DDP细胞MRP2mRNA的表达(P<0.05),作用呈剂量依赖性,但对MDR1mRNA的表达没有影响。结论奥曲肽可以与卵巢癌细胞表面SSTR2结合,发挥抗增殖、促凋亡等作用,并可能通过降低卵巢癌细胞MRP2的表达逆转顺铂耐药性。     

卵巢癌细胞对顺铂耐药及其逆转的实验研究

目的：探明卵巢癌对顺铂耐药的发生机理，并筛选出逆转其耐药性的有效调节剂。方法：建立对顺铂耐药的人卵巢癌细胞系ＳＫＯＶ３／ｃｐ，采用微囊包裹肿瘤细胞技术建立人类卵巢癌小鼠异种移植耐药模型。比较耐药细胞和非耐药细胞生化特征的差异，采用相应的耐药调节剂来进行耐药逆转实验。结果：在ＳＫＯＶ３细胞内，铂（Ｐｔ）累积浓度、Ｐｔ－ＤＮＡ加合物、ＤＮＡ链间交联指数（ＩＳＣ）分别是ＳＫＯＶ３／ｃｐ细胞的５．１、２．４和４．８倍（Ｐ＜０．０１，Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１）；二性霉素Ｂ（ＡｍＢ）和新生霉素（ＮＶＢ）能提高ＳＫＯＶ３／ｃｐ细胞内铂浓度或Ｐｔ－ＤＮＡ加合物浓度，从而完全或部分逆转ＳＫＯＶ３／ｃｐ对顺铂的耐药性。结论：导致ＳＫＯＶ３／ｃｐ对顺铂耐药的主要原因是细胞内药物浓度下降和对Ｐｔ－ＤＮＡ清除能力增强。ＡｍＢ和ＮＶＢ能够逆转ＳＫＯＶ３／ｃｐ对顺铂的耐药性。     

MicroRNA let-7a: a potential marker for selection of paclitaxel in ovarian cancer management

Objectives

Let-7 is a family of small non-coding RNAs regulating the expression of many genes that control important cellular activities. Let-7 is shown in vitro to sensitize cancer cells to platinum, but induce ovarian cancer resistance to paclitaxel. This study aims to investigate the effect of let-7a expression on survival outcomes of epithelial ovarian cancer (EOC) patients treated with different chemotherapy.

Methods

Let-7a expression was measured with qRT-PCR in ovarian tumors of 178 EOC patients who received platinum-based chemotherapy with and without paclitaxel after surgery. Survival analysis was performed to assess the effects of let-7a and chemotherapy on disease outcomes.

Results

Let-7a expression was detectable in the EOC samples, but the expression was not associated with disease stage, tumor grade, histology and debulking results. Patients who responded to platinum with paclitaxel had significantly lower let-7a than those who did not. Survival analyses showed that patients with high let-7a had better survival compared to those with low let-7a when they were treated with platinum without paclitaxel. The hazards ratios (HRs) for death and disease progression were 0.52 (95% CI: 0.29-0.96) and 0.48 (0.26-0.89) for high let-7a when compared to low let-7a, respectively. However, when patients were treated with platinum and paclitaxel, high let-7a was associated with worse progression-free and overall survival. The HRs for death and disease progression were 3.87 (95% CI: 1.28-11.66) and 3.48 (95% CI: 1.25-9.67) for high let-7a when compared to low let-7a, respectively. Further studies showed that among patients with low let-7a, those treated with paclitaxel in addition to platinum survived better than those treated without paclitaxel [adjusted-HRs were 0.31 (95% CI: 0.15-0.66) for death and 0.40 (95% CI: 0.22-0.75) for disease], while among those with high let-7a, the two types of treatment made no difference in patient survival.

Conclusions

The study suggests that the beneficial impact of the addition of paclitaxel on EOC survival was significantly linked to let-7a levels, and that miRNAs such as let-7a may be a useful marker for selection of chemotherapeutic agents in EOC management.     

PTEN基因逆转卵巢上皮性癌细胞耐药的机制研究

目的通过检测PTEN基因在卵巢上皮性癌（卵巢癌）顺铂敏感细胞株0V2008及0V2008配对的顺铂耐药细胞株C13K中的表达,探讨转染PTEN基因能否逆转C13K细胞对顺铂的耐药及其相关机制。方法半定量RT-PCR技术和蛋白印迹法检测0V2008和C13K细胞中PTENmRNA和蛋白的表达。将野生型PTEN基因真核表达质粒在脂质体介导下转染C13K细胞,同时以转染空载体和未转染的C13K细胞作为对照,分别应用RT-PCR技术检测各组细胞PTENmRNA表达的变化,应用蛋白印迹法检测各组细胞PTEN、蛋白激酶B（AKT）及磷酸化AKT（p-AKT）蛋白表达的变化;四甲基偶氮唑蓝（M1Tr）比色法观察转染PTEN基因后C13K细胞对顺铂敏感性的变化,流式细胞仪分析顺铂作用后的细胞凋亡情况。结果（1）PTENmRNA在0V2008和C13K细胞中的表达水平分别为1．02±0.05和0．45±0.03,而0V2008、C13K细胞中PTEN蛋白的表达水平分别为1.02±0.07、0．55±0．03,两种细胞PTENmRNA和蛋白的表达水平分别比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）。（2）PTEN基因转染48h后,C13K细胞中PTENmRNA、蛋白的表达水平分别为2.04±0．10和0．94±0．04,分别与转染空载体和未转染的C13K细胞比较,差异均有统计学意义（P〈0．01）;p-AKT蛋白的表达水平（0.94±0．07）较转染空载体（1．66±0．10）和未转染（1．68±0．14）的C13K细胞显著降低（P〈0．05）。（3）转染PTEN基因的C13K细胞对顺铂的半数抑制浓度（IC50）为（7.2±0．3）μmol／L,明显高于转染空载体和未转染的C13K细胞[分别为（12．7±0．4）、（13．0±0．3）μmol／L,P〈0,05]。（4）顺铂作用24h后,转染PTEN基因、转染空载体和未转染的C13K细胞的凋亡率分别为（41.7±0.9）％、（18．6±0．7）％和（15,3±0．8）％,前者明显高于后两者（P〈0．01）。结论PTEN基因在0V2008细胞中的表达明显高于C13K细胞。转染野生型PTEN基因能有效提高C13K细胞内PTEN基因的表达,并通过降低C13K细胞中AKT磷酸化的水平恢复C13K细胞对顺铂的敏感性。     

米非司酮对卵巢上皮性癌耐药细胞DNA修复基因表达和顺铂敏感性的影响

目的 研究米非司酮对卵巢上皮性癌(卵巢癌)耐药细胞DNA修复基因表达的调控,及对顺铂的增敏作用.方法 应用四甲基偶氮唑蓝比色法检测2.5、5.0、10.0 μmol/L米非司酮作用后卵巢癌顺铂耐药细胞株COC1/DDP的顺铂半数抑制浓度(IC50);用RT-PCR技术、流式细胞仪检测米非司酮联合顺铂作用后COC1/DDP细胞ERCC1、BRCA1、hMLH1 mRNA的表达水平及细胞周期和凋亡率的变化;建立COC1/DDP细胞裸鼠皮下移植瘤模型,分为顺铂组、米非司酮组、联合组和对照组,观察米非司酮在裸鼠体内对顺铂的增敏作用.结果 2.5、5.0、10.0 μmol/L米非司酮分别使COC1/DDP细胞对顺铂的IC50下降为(3.18±0.46)、(1.95±0.14)和(0.64±0.18)μg/ml,2.5 μmol/L米非司酮联合顺铂作用后的IC50与单用顺铂者[(3.71±0.38)μg/ml]比较,差异无统计学意义(P=0.076),其他浓度之间两两比较,差异均有统计学意义(P＜0.01).米非司酮下调ERCC1、BRCA1、hMLH1 mRNA表达水平,3种基因mRNA的相对表达量随米非司酮浓度的升高均呈下降趋势.2.5、5.0、10.0 μmol/L米非司酮联合顺铂对COC1/DDP细胞作用后,G0/G1,期细胞比例升高(分别为51.68%、53.74%、55.08%).2.5、5.0、10.0 μmol/L米非司酮与10 μg/ml顺铂联合作用使细胞凋亡率分别增加为5.11%、9.13%和12.24%.米非司酮联合顺铂治疗裸鼠皮下移植瘤的生长抑制率为70.1%,与顺铂组、米非司酮组(分别为22.5%、6.5%)比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 米非司酮通过下调ERCC1、BRCA1、hMLH1基因的表达及阻滞G0/G1期细胞、增加细胞凋亡率来增强顺铂对卵巢癌细胞的抗肿瘤敏感性.     

顺铂和紫杉醇对人卵巢浆液性囊腺癌细胞系SKOV3ip 1多细胞团簇的耐药性实验研究

目的探讨人卵巢浆液性囊腺癌细胞系SKOV3ip1细胞形成的多细胞团簇(MCA)对顺铂和紫杉醇的敏感性及其可能机理.方法用液体重叠系统获得SKOV3ip1的MCA,以单层细胞为对照.分别加入浓度为0.8、8.0、40.0、80.0μmol/L的顺铂或浓度为0.2、2.0、10.0、20.0μmol/L的紫杉醇作用后,采用台盼蓝排除实验检测MCA细胞抑制率、体外耐药的克隆形成率实验检测MCA的克隆形成率、流式细胞仪分析检测MCA的细胞周期分布和细胞凋亡率.结果不同浓度的顺铂(0.8、8.0、40.0、80.0μmol/L)或紫杉醇(0.2、2.0、10.0、20.0μmol/L)作用后,MCA细胞抑制率明显低于单层细胞,差异有显著性(P顺铂=0.045,P紫杉醇＝0.003).顺铂(40μmol/L)作用12h后的MCA和单层细胞均无细胞克隆(≥50个活细胞组成的细胞团为1个细胞克隆)形成,紫杉醇(10μmol/L)作用12h后的MCA(n=100)的克隆形成率为7%,明显高于单层细胞的0%(P＜0.05).空白对照中,MCA的G0+G1期细胞较单层细胞明显增多(P=0.003);顺铂作用后MCA和单层细胞的细胞凋亡率分别为(1.898±0.562)%和(7.930±5.541)%,两者比较,差异无显著性(P＝0.100),细胞周期分布也无明显变化;紫杉醇作用后MCA的细胞凋亡率(5.510±2.517)%,与单层细胞的(10.098±2.416)%比较,差异有显著性(P＝0.012),紫杉醇在单层细胞中诱导的G2+M期细胞阻滞在MCA中出现缺失.结论SKOV3ipl的MCA对顺铂和紫杉醇化学治疗(化疗)呈现出不同程度的耐药性,尤其对紫杉醇耐药性更为明显.细胞周期分布的变化、G2+M期细胞阻滞的缺失及MCA的细胞凋亡率的降低,可能是引起MCA对紫杉醇化疗耐药的原因.     

Molecular mechanism of cisplatin resistance

Cisplatin is widely used in the treatment of many tumors,particularly in ovarian cancer,GST-π,metallothioein(MT),multidrug resistance associated proteins(MRPs),nucleotide excision repair(NER),mismatch repair(MMR)and oncogenes contribute to drug resistance of cisplatin.     

PTEN基因对卵巢癌耐药细胞系C13K顺铂耐药性的影响

目的:探讨第10号染色体上PTEN对人卵巢癌顺铂耐药细胞株C13K顺铂耐药性的逆转作用。方法:将野生型PTEN基因真核表达质粒在脂质体介导下转染人卵巢癌耐药细胞系C13K细胞,同时以转染空载体和未转染C13K细胞作为对照,分别应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)及蛋白印迹法(W estern blot)检测PTEN mRNA及蛋白表达水平,对转染细胞株进行四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)实验,观察PTEN基因对肿瘤细胞生长的抑制作用和C13K细胞对顺铂药物敏感性的影响,流式细胞仪(FACS)分析细胞的凋亡。结果:转染48 h后,与对照组相比,转染野生型PTEN基因能明显增加C13K细胞PTEN mRNA和蛋白的表达,差异有统计学意义(P<0.05);MTT法显示,转染野生型PTEN基因的C13K细胞生长明显慢于转染空载体和未转染的C13K细胞,转染PTEN的C13K细胞对顺铂的敏感性显著增加;FACS分析显示,顺铂作用24h后,转染PTEN基因能够显著提高C13K细胞凋亡率。结论:转染野生型PTEN质粒能有效地提高C13K细胞内PTEN的表达,恢复细胞对顺铂的敏感性。     

卵巢上皮性癌ERCC1表达与顺铂化疗耐药关系的研究

目的:探讨卵巢上皮性癌组织中ERCC1表达水平与顺铂化疗耐药的相关性。方法:应用免疫组化SP法检测42例卵巢癌组织中ERCC1的表达并分析其与顺铂化疗耐药的关系。结果:卵巢癌组织ERCC1表达水平与卵巢上皮性癌患者年龄、手术分期及组织学类型无关,而与卵巢上皮性癌患者以顺铂为基础联合化疗的耐药性有关。卵巢癌化疗耐药组ERCC1的阳性表达率为77.27%,明显高于敏感组35.00%,组间差异有统计学意义(P<0.05)。结论:ERCC1在卵巢上皮性癌组织中的表达水平与顺铂化疗耐药有关。     

促性腺激素释放激素类似物对耐药卵巢癌细胞血管形成的抑制作用

目的:研究促性腺激素释放激素(GnRH)类似物曲普瑞林(triptorelin)联合顺铂(c DDP)对卵巢癌顺铂耐药细胞血管生成的抑制效果,并探讨其作用机制。方法:体外筛建卵巢癌OVCAR-3细胞系的顺铂耐药模型OVCAR-3/c DDP,并建立其裸鼠皮下荷瘤模型。实验分为对照组(NS组)、曲普瑞林组、顺铂组、曲普瑞林+顺铂组。采用实时定量PCR(real-time PCR)和Western blot法分别检测VEGF mRNA和蛋白表达。采用鸡胚尿囊膜实验(CAM)检测用药后对荷瘤组织血管生成的影响。结果:曲普瑞林+顺铂组的VEGF mRNA和蛋白表达显著低于曲普瑞林组、顺铂组及NS组(P0.05)。鸡胚尿囊膜实验结果显示,曲普瑞林和顺铂单独用药均能抑制耐药荷瘤组织的血管形成,抑制率分别为20.76%和16.66%;两药联合作用后抑制作用更显著,抑制率达36.50%。结论:GnRH类似物曲普瑞林联合顺铂可明显抑制顺铂耐药卵巢癌细胞的血管生成,其机制可能与下调VEGF表达有关。     

微小RNA 27a在卵巢上皮性癌紫杉醇耐药细胞中的表达及其与耐药的关系

目的 研究微小RNA 27a(miR-27a)在卵巢上皮性癌(卵巢癌)紫杉醇耐药细胞中的表达及其与耐药的关系.方法 采用实时PCR技术检测卵巢癌A2780细胞及其紫杉醇耐药细胞A2780/Taxol中miR-27a的表达水平.利用脂质体lipofectamine 2000将成熟miR-27a的模拟物、阻遏物及阴性对照(NC)转染A2780和A2780/Taxol细胞,实时PCR技术检测转染细胞中MDRI基因mRNA的表达;蛋白印迹法检测转染细胞中P-糖蛋白(P-gp)和同源结构域相关的蛋白激酶2(HIPK2)蛋白的表达;采用四甲基偶氮唑蓝比色法、流式细胞仪分别检测紫杉醇作用于转染后细胞的增殖情况及细胞凋亡率.结果 (1)miR-27a在A2780/Taxol细胞中高表达,与A2780细胞相比表达水平增高2.2倍,差异有统计学意义(P<0.05).(2)转染miR-27a阻遏物后,A2780/Taxol细胞中MDR1 mRNA的表达水平为0.61±0.14,与转染NC细胞(表达水平为1.00)比较下降39%,差异有统计学意义(P<0.05);P-gp印蛋白的表达水平为(26±5)%,HIPK2蛋白的表达水平为(30±6)%,分别与转染NC细胞的P-gp蛋白[(43±7)%]和HIPK2蛋白[(19±4)%]的表达水平比较,差异均有统计学意义(P<0.05);A2780/Taxol细胞对紫杉醇的敏感性增加,半数抑制浓度(IC50)为0.5 μmol/L,与转染NC细胞(IC50为6.8 μmol/L)比较,差异有统计学意义(P<0.05);细胞凋亡率明显升高,达(32.5±3.6)%,与转染NC细胞的凋亡率(5.6±2.1)%比较,差异有统计学意义(P<0.05).(3)转染miR-27a模拟物后,A2780细胞中MDR1 mRNA的表达水平为2.21±0.11,与转染NC细胞(表达水平为1.00)比较升高121%,差异有统计学意义(P<0.05).结论 miR-27a在卵巢癌紫杉醇耐药细胞中高表达,其町能通过调控靶基因HIPK2,间接调节MDB1及P-gp的表达和功能而参与耐药.