实时荧光定量PCR方法检测乙型肝炎病毒基因型

目的建立一种快速准确的实时荧光PCR方法检测乙型肝炎病毒基因型。用此方法对安徽地区乙肝患者进行检测,了解该地区HBV基因型分布情况。方法首先用实时荧光定量PCR方法对150例安徽地区乙肝患者进行HBVDNA定量检测和分型检测,然后对其中载毒量大于5000IU/mL的113例标本和1例1000IU/mL≤载毒量<5000IU/mL进行测序分型检测,验证所建立方法的准确性,了解安徽地区HBV基因型分布情况。结果150例HBV样本中HBVDNA含量<1000IU/mL30例,分型检测结果均为阴性,对载毒量≥5000IU/mL的样本检出率为97.35%(110/113);对1000IU/mL≤载毒量<5000IU/mL的样本检出率为14.29%(1/7);对全部DNA阳性样本的检出率为92.5%(111/120)。HBV分型检测与HBVDNA测序检测的114例样本中,只要是HBVB基因型、C基因型或B/C混合型,乙型肝炎病毒基因分型检测都能检出来(共111例),其中部分样本经分型检测属于B/C混合基因型,测序结果都是混合基因型中占优势的基因型结果,总体符合率为100%。未能被本法检出的样本共3例,3例样本经测序分型均为D型。120例病毒载毒量≥1000IU/mL乙肝患者中B型病例占51.67%(62/120);C型占29.17%(35/120);B/C混合型占11.67%(14/120)。PCR测序检出为D型3例,占2.5%(3/120)。结论应用TaqMan探针的实时荧光定量PCR方法能快速对我国HBV主要基因型B基因型、C基因型进行检测,结果准确可靠,特异性高。安徽地区的HBV基因型以B型为主,C型次之,亦存在着D型的少数感染病例和B/C的混合感染。     

荧光探针定量PCR检测HBV-DNA

本文采用荧光探针定量(FQ-PCR)法准确定量检测HBV-M阳性标本中的HBV-DNA数量.结果显示:HBeAg(+)组(32份)的阳性率为100%,HBV-DNA拷贝数范围在105～109/ml之间.HBeAb(+)组(47份)的阳性率为23.4%,HBV-DNA拷贝数范围在103～105.7/ml之间;HBsAb(+)组(37份)的阳性率为2.7%,HBV-DNA拷贝数为105/ml.以上44例HBV-DNA阳性拷贝数范围在103～109/ml之间.HBeAg(+)组血清中HBV-DNA含量(107.09±1显著高于HBeAb(+)组(104.7±1)和HBsAb(+)组(105).结果表明:HBV-DNA的FQ-PCR检测较常规PCR更具有较高的灵敏度和特异性,且定量准确,结果可靠,能避免PCR后处理污染导致的假阳性,可反映HBV真实感染和低复制状态.结合HBV-DNA含量测定判断HBV病毒复制状态,对临床诊断、治疗及判断预后具有重要的指导意义.     

终点法荧光定量PCR检测HBV-DNA的临床应用

目的运用终点法荧光定量PCR检测HBV-DNA,探讨其临床应用价值。方法运用本研究组制备的引物和荧光探针分别将HBV-DNA质粒及临床标本进行普通PCR和实时荧光定量PCR反应,再将普通PCR产物在荧光测定仪上测定荧光强度,与实时荧光定量PCR结果相比较,观察其符合程度。另外,运用相同方法比对本研究制备的PCR体系与市售荧光定量PCR试剂检测HBV-DNA的符合程度。结果终点法荧光定量PCR与实时荧光定量PCR检测HBV-DNA质粒及临床标本结果一致(P>0.05),与市售荧光定量PCR试剂比较,其符合程度较高(P>0.05)。结论终点法荧光定量PCR检测临床HBV-DNA标本稳定可靠,可作为荧光定量PCR的应用方法之一在基层医院推广应用。     

荧光定量PCR检测HBV-DNA假阴性原因分析

PCR假阴性问题因涉及面广,成因复杂,越来越受到临床重视,结合实践分析如下。     

HBV-DNA荧光定量PCR检测的临床意义

目的实时荧光定量聚合酶反应(FQ-PCR)检测血清中乙型肝炎病毒(HBV)-DNA的临床意义。方法用荧光探针技术相结合所产生的实时荧光定量聚合酶反应。结果 240例疑似乙型肝炎标本中,有91例大三阳(HBsAg阳性、HBeAg阳性、抗-HBc阳性)患者血清HBV-DNA阳性率100%,平均浓度2.8×106copy/mL;有19例小二阳(HBsAg阳性、抗-HBc阳性)患者血清HBV-DNA阳性94.7%,平均浓度4.3×105copy/mL;有40例小三阳(HBsAg阳性、抗-HBe阳性、抗-HBc阳性)患者血清HBV-DNA阳性率77.5%,平均浓度1.2×104copy/mL。10例HBsAg、HBeAg阳性患者血清HBV-DNA阳性率100%,平均浓度5.6×107copy/mL;有30例抗-HBs、抗-HBs阳性患者血清中HBV-DNA阳性有1例,检出阳性率3.3%,平均浓度2.6×103copy/mL;乙肝两对半全阴50例有1例检出HBV-DNA,阳性率2.0%,平均浓度5.9×102copy/mL。结论 FQ-PCR是了解HBV-DNA在体内复制和判断疗效的有利手段,并具有快速、特异、灵敏等优点,可真实反应HBV-DNA复制情况及病情变化,对乙肝临床诊断及治疗有较大的指导意义。     

荧光定量PCR检测HBV-DNA室内质控物的制备及初步应用

目的：制备HBV-DNA荧光定量PCR检测的室内质控物,并对其应用价值进行初步评价。方法：留取单-乙肝模式的混合血清样本,并用正常人血清将收集的血清稀释至所需的浓度,用与待检血清相同的仪器、同一品牌的HBV-DNA定量试剂盒进行检测,确定其靶值,计算x^-、s、CV,绘制质控图。结果：自制的室内质控物高低值的变异范围分别为1.10%、1.01%（CV〈5%）,稳定性好。结论：临床实验室可以用单-乙肝模式的混合血清制备HBV-DNA定量检测的质控物,其制备容易,测定结果稳定,有一定的临床实用价值。     

荧光定量聚合酶链反应检测库存血浆HBV-DNA及HCV-RNA

目的 调查库存血中HBV-DNA及HCV-RNA的阳性率。方法 采用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)法,对合格库存血浆进行微量汇集池标本(10份×50μl汇集)中的HBV-DNA和HCV-RNA测定,再对阳性汇集池中的标本进行单份检测。结果 250份(分25个汇集池)受检血浆中HCV-RNA阳性1份(0.4％),HBV-DNA阳性2份(0.8％)。结论 荧光定量PCR检测微量血浆汇集池标本法筛查血液病毒核酸是提高输血安全性的一种先进方法。     

荧光探针定量PCR检测HBV—DNA

本文采用荧光探针定量（ＦＱ－ＰＯＣＲ）法准确定量检测ＨＢＶ－Ｍ阳性标志中的ＨＢＶ－ＤＮＡ数量。结果显示：ＨＢｅＡｇ（＋组（３２份）的阳性率为１００％,ＨＢＶ－ＤＮＡ拷贝数范围在１０＾５－１０＾９／ｍｌ之间。ＨＢｅＡｂ（＋）组（４７份）的阳性率为２３．４％,ＨＢＶ－ＤＮＡ拷贝范围在１０＾３－１０＾５．７／ｍｌ之间;ＨＢｓＡｂ（＋）组（３７份）的阳性率为２．７％,ＨＢＶ－ＤＮＡ拷贝数为１０＾５／ｍｌ。     

溶血因素对荧光定量PCR检测HBV-DNA结果的影响

HBV-DNA的定量检测对临床诊断乙型肝炎,评价抗病毒药物疗效,研究乙型肝炎自然病史具有重要意义[1].荧光定量PCR(FQ-PCR)技术在保持巢氏PCR高度敏感性的同时,又因其能在电脑控制1～2 h全自动同步完成96个样品的扩增及定量,因此又具有高效率[2].而杂交法检测具有较高的特异性,但敏感性低,临床应用受到限制.目前国内较多的医院采用荧光定量的方法对血清中的HBV-DNA进行定量检测.而血液在采集过程中因多种因素的影响,因此常会遇到溶血的标本.本文旨在评价标本溶血对荧光定量PCR检测HBV-DNA结果的影响.     

荧光定量 PCR 法检测乙肝病毒 DNA 和乙肝病毒标志物检测的临床价值分析

目的：探讨荧光定量 PCR 法（FQ-PCR）检测乙肝病毒 DNA（HBV-DNA）和乙肝病毒标志物（HBV-M）ELISA 法检测的临床价值。方法选取2013年4～12月在该院检测的653例乙肝患者,先采用 ELISA 法对其血液标本进行 HBV-M 模式定性检测,检测顺序为乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、乙肝表面抗体（HbsAb）、乙型肝炎 e 抗原（HbeAg）、乙型肝炎 E 抗体（Hbe-Ab）、乙肝表面核心抗体（HbcAb）;再采用 FQ-PCR 法进行 HBV-DNA 定量检测,观察不同 HBV-M 模式检测结果。结果 HB-sAg、HbeAg、HbcAb 检测同时阳性简称“大三阳”。大三阳[1（＋）、3（＋）、5（＋）模式]和[1（＋）、3（＋）模式]的 HBV-DNA 阳性率分别为97．97％、94．74％,显著高于其他模式的 HBV-DNA 阳性率（P ＜0．05）。大三阳的 HBV-DNA 表达水平（5．59×10^6±2．42×10^5）copies/mL,明显高于其他模式（P ＜0．05）。结论联合 HBV-M 定性及 HBV-DNA 定量检测,对临床早期诊断及用药具有重要指导价值。     

乙型肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立一种采用Lightcycler系统进行HBVDNA实时荧光定量PCR的方法,并探讨其临床应用价值。方法针对HBV基因组S区设计一对扩增引物,并通过预实验严格优化反应体系的组成和条件;将T载体与HBVRT区扩增后纯化的产物进行连接反应,然后转染大肠杆菌（DH5a）,经蓝、白斑筛选后挑取阳性菌落,提取质粒,制备外标准品。结果用于制成外标准品的质粒经1：10的缓冲液倍比稀释,制作标准曲线,线性方程为：Y=-3．344X＋37（r2=0．9999）;通过检测已知浓度并经倍比稀释的HBVDNA,表明其最低检测限为5×10^2 IU／mL;拷贝数介于5×10^2～5×10^8 IU／mI。之间的HBVDNA浓度与ct值具有良好的线性关系。结论外标法实时荧光定量PCR是一种定量相对准确、灵敏度高、特异性强、操作相对简便的方法;该方法可用于乙型肝炎患者病情监测,有效指导临床用药;联合该法与血清标志物检测,可更准确评价HBV感染者病情。     

荧光定量PCR法检测乙肝病毒DNA和乙肝病毒标志物检测的临床价值分析

目的 探讨荧光定量PCR法(FQ-PCR)检测乙肝病毒DNA(HBV-DNA)和乙肝病毒标志物(HBV-M) ELISA法检测的临床价值.方法 选取本院收洽的乙肝患者653例,先采用ELISA法对其血液标本进行HBV-M模式定性检测,再采用FQ-PCR法进行HBV-DNA定量检测,观察不同HBV-M模式检测结果.结果 大三阳(1、3、5模式)和1、3模式的HBV-DNA阳性率分别为97.97％和94.74％,显著高于其他模式(P＜0.05).大三阳(1、3、5模式)的HBV-DNA表达水平为(5.59×106±2.42×105),显著高于其他模式(P＜0.05).结论 不同HBV-M模式的HBV-DNA表达水平及阳性率存在显著差异,联合HBV-M定性及HBV-DNA定量检测对临床早期诊断及用药具有重要指导价值.     

多对型特异性引物巢式PCR检测乙型肝炎病毒基因型分析

目的采用多对型特异性引物通过巢式PCR法检测HBeAg阳性患者血清中乙肝病毒(HBV)基因型的分布情况。方法根据从前S1基因到S基因中的保守序列设计出10条内外引物,并将其中8条内引物分成A、B两组分别扩增A、B、C和D、E、F型HBV,然后将第2轮PCR的两组产物分别用3%琼脂糖进行电泳,根据PCR产物片段大小直接判定HBV基因型。用该法检测15例慢性乙肝患者血清中HBV基因型,了解HBV基因型分布情况。结果 HBV基因分型结果为B型7例(46.7%)、C型4例(26.7%)、B+C型2例(13.3%),另有2例未能分型。结论人群HBV优势基因型以B型为主,C型次之。     

实时荧光定量 PCR 检测 HBV DNA 的线性范围与最低检出限的验证

目的：试用实时荧光定量 PCR 定量检测乙型肝炎病毒核酸（HBV DNA）,求出其线性范围与最低检出限,从而对本实验室检测 HBV DNA 的主要性能进行验证。方法参照相关的文件,通过系列稀释高浓度标本得到超过厂家申明线性范围的系列浓度标本,进行线性范围的验证;通过系列稀释低浓度标本得到超过厂家申明最低检出限的系列浓度标本,进行最低检出限的验证。结果 HBV DNA 检测的线性范围为8．58＆#215;102～8．41＆#215;107 IU/mL,最低检出限为4．07＆#215;102 IU/mL。结论实时荧光定量 PCR 检测 HBV DNA 的线性范围与最低检出限达到预期要求,检测方法和验证方案简便、可行。     

荧光定量PCR在乙型肝炎患者检测中的临床应用

目的　探讨荧光定量 PCR( fluorescence quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)定量检测血清HBV-DNA的临床应用价值。方法　采用 FQ-PCR和 ELISA法检测 1 76例乙型肝炎患者血清 HBV DNA含量和 HBV血清学标志物 ,并进行比较分析。结果　 HBs Ag、HBe Ag和抗 -HBc三项阳性 ,HBs Ag、抗 -HBe、抗 -HBc三项阳性 ,HBs Ag、HBe Ag两项阳性 ,HBs Ag、抗 -HBc阳性的样品中 ,HBV DNA阳性率分别为 95 .1 %、83 .3 %、1 0 0 .0 %、81 .8% ,DNA拷贝数/ml分别为 2 .2 9× 1 0 7、1 .2 3× 1 0 6 、8.5 1× 1 0 6 、6.61× 1 0 5,其中以抗 -HBc-Ig M阳性组 DNA拷贝数为最高。结论　 FQ-PCR法检测 HBV DNA具有灵敏度高、结果可靠的优点 ,可检测 HBV感染和复制状态 ,对于乙肝的早期诊断、传染性判断和疗效考核具有重要的指导意义。     

乙型肝炎病毒血清DNA定量检测的临床意义

目的　探讨乙型肝炎病毒 (HBV)感染者乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸 (HBV DNA)定量检测的临床意义 ,以及与乙型肝炎血清学e系统 (HBe)标志、丙氨酸转氨酶 (ALT)和天冬氨酸转氨酶 (AST)水平的相关性。方法　采用荧光标记探针定量聚合酶链反应 (PCR)技术、酶联免疫吸附测定法及速率法 ,对 14 0例乙型肝炎病毒感染者乙型肝炎病毒血清DNA含量、血清学标志、ALT和AST进行检测 ;同时动态检测了 2 0例乙肝患者 2 4周拉米夫定治疗期间的血清HBe标记系统和HBV DNA含量变化。结果　e抗原 (HBeAg)阳性组的HBV DNA含量 (M =6 .4 8)显著高于e抗体 (HBeAb)阳性组的HBV DNA含量 (M =4 .2 8) ,差异有统计学意义 (H =2 8.4 8,P <0 .0 0 1) ;不同临床类型乙肝患者的HBV DNA含量检测结果之间的比较 ,差异无统计学意义 (H =2 .181,P >0 .0 5 ) ;在拉米夫定治疗期间 ,血清HBV DNA含量的下降和转阴明显先于血清学标志系统的转换。结论　HBeAg是反映HBV DNA复制的重要指标 ,HBeAg阳性表示乙型肝炎病毒复制活跃 ,但在抗病毒治疗期间 ,血清学标志指标反映HBV复制状态存在局限性 ,HBV DNA定量检测是反映HBV复制和判断药物疗效的最直接、可靠的指标 ;乙型肝炎患者病程的变化、ALT和AST水平与HBV复制是否活跃没有直接相关关系     

PCR-反向点杂交法检测 HBV 耐药变异与基因型的探讨

目的：探讨 PCR-反向点杂交法检测 HBV 耐药变异与基因型的相关性及 HBV 变异位点与肝功能指标、HBVDNA病毒载量的关系。方法筛选符合条件的462例服用核苷类药物治疗的慢性乙型肝炎患者血清标本,用 PCR-反向点杂交法检测 HBV 的耐药突变位点以及基因型,并对 HBV 耐药变异与基因型、肝功能检测指标、HBV DNA 病毒载量等指标进行相关性分析。结果在462例服用核苷类药物治疗的慢性乙型肝炎患者血清中检测耐药变异株45例,变异率约为9．74％;其中180M 和204I/V 突变株16例,35．5％;204V 突变株6例,13．3％;204I 突变株13例,28．9％;180V 突变株3例,6．7％;181V 突变株3例,6．7％;207I 突变株1例,2．2％,236T 突变株3例,6．7％。HBV 基因型中 B 基因型105例,C 基因型337例,B 基因型和 C 基因型联合感染4例,D 基因型0例,其他基因型2例。将检测结果与临床资料进行相关性分析：乙肝患者的耐药变异位点与基因型、肝功能指标 ALT 无相关性（P ＞0．05）,与 HBVDNA 病毒载量有一定相关性（P ＜0．05）。结论1．茂名地区的 HBV 基因型可能与其他南方地区的基因型有差异,以 HBV-C 基因型为主;2．PCR-反向点杂交法是一种快速、准确发现核苷类药物治疗后耐药位点的检测方法;3．通过临床资料分析显示乙肝患者的耐药变异位点与肝功能指标 ALT 间差异无统计学意义（P ＞0．05）,即无相关性,HBV-DNA 病毒载量间差异有统计学意义（P ＜0．05）,即有一定相关性。     

双带PCR提高检测血清HBV-DNA质量的意义

应用双带ＰＣＲ方法（ＤＢ－ＰＣＲ）检测了２４０份血清中ＨＢＶ－ＤＮＡ，该方法能直接观察和判断假阴性和假阳性结果，提高了检测的准确性。与国内其它ＰＣＲ试剂比较，符合率分别为９４．０５％（ＤＢ－ＰＣＲ／华美产品），和９５．２８％（ＤＢ－ＰＣＲ／长城产品）。ＨＢｅＡｇ阳性的血清，经ＤＢ－ＰＣＲ检测ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性者达９３．５５％（２９／３１）。ＰＣＲ产物Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ后能与ＨＢＶ－ＤＮＡ探针杂交，证明了该方法的特异性。     

乙型肝炎病毒e抗原S/CO值与HBV-DNA浓度的关系

目的探讨乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）S/CO值与乙型肝炎病毒（HBV）-DNA浓度的关系。方法采集306例乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）阳性患者的血清样本。采用雅培i2000化学发光免疫分析仪进行HBeAg定量检测,采用ABI7300实时荧光定量PCR仪进行HBV-DNA定量检测。结果 306例HBsAg阳性的血清标本中,HBeAg阳性177例（57.84%）;HBeAg阴性而HBV-DNA阳性24例（7.84%）;HBV-DNA阴性而HBeAg阳性56例（18.30%）。HBV-DNA浓度为103-107 IU/mL,HBeAg与HBV-DNA浓度呈正相关（r〉0.3,P〈0.05）。结论 HBV-DNA与HBeAg联合检测可更好地为临床提供诊疗依据。