A型流感病毒核蛋白全套单链抗体库的构建

目的　构建A型流感病毒核蛋白全套单链抗体库。　方法　利用全套噬菌体抗体表面展示技术 ,从A型流感病毒核蛋白免疫的BALB/c小鼠脾淋巴细胞中提取总RNA ,利用抗体可变区PCR混合引物进行全套抗体重、轻链基因的扩增。经重叠延伸反应 ,在体外随机装配成单链抗体。将其克隆到噬菌粒载体PCANTAB5E中 ,电转化TG1细菌 ,以辅助噬菌体M13 K0 7超感染噬菌体文库 ,构建全套ScFv抗体库。　结果　成功利用噬菌体表面展示技术 ,构建了A型流感病毒核蛋白全套单链抗体库 ,库容量达到 8 2× 10 7。　结论　构建全套A型流感病毒核蛋白全套单链抗体库 ,为利用亲和富集筛选技术 ,获得具有A型流感病毒核蛋白结合活性的完整重组噬菌体克隆奠定了基础。     

抗表皮生长因子受体Ⅲ型突变体噬菌体单链抗体库的构建与初步筛选

目的构建抗表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)特异性单链抗体库,从中筛选抗EGFRvⅢ特异性单链抗体。方法用pep-3偶联载体蛋白OVA,然后免疫BALB/c小鼠从脾淋巴细胞中提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增重链(VH)和轻链(VL)的可变区基因片段。将两基因片段由编码(Gly4Ser)3的linker连在一起,并克隆入噬菌体展示表达载体pCANTAB5E中,电转化至E.coliTG1,经辅助噬菌体超感染,构建噬菌体单链抗体库。以pep-3-BSA为抗原对所建抗体库进行4轮亲和筛选,用ELISA鉴定抗体与EGFRvⅢ结合的特异性。结果经琼脂糖凝胶电泳分析,RT-PCR方法扩增的抗体VH和VL基因片段大小约350和320bp,与预期理论值相符。经重组PCR得到大小约780bp的ScFv基因片段。ScFv基因片段经双酶切后成功定向克隆到噬菌粒载体,回收后构建成库容量为5.0×106的噬菌体抗体库,噬菌体滴度为3.0×104pfu/ml。通过亲和筛选使抗EGFRvⅢ噬菌体单链抗体得到富集,第4轮为第1轮的56倍。在E.coliHB2151中实现了单链抗体的可溶性表达。SDS-PAGE结果显示抗体相对分子...     

噬菌体展示技术构建重组人TNF-α单链抗体库

目的 应用噬菌体展示技术构建抗重组人肿瘤坏死因子-α(rhTNF-α)的单链抗体库.方法 利用噬菌体表面展示技术、绕过杂交瘤技术,提取经免疫BALB/c小鼠淋巴细胞总RNA,用相应引物扩增小鼠免疫球蛋白VH基因和VL基因,构建VH、VL抗体库.由Linker-primer mix经重叠延伸反应将重链可变区基因与轻链可变区基因拼接成单链抗体.再用RS primer mix以单链抗体为模板进行第二次聚合酶链反应,从而获得全套抗rhTNF-α的单链抗体基因.以SfiⅠ/NotⅠ,位点定向插入pCANTAB-5E噬菌粒载体,转化大肠杆菌TG1后,经M13KO7辅助噬菌体拯救,构建成全套抗rhTNF-α单链抗体表面展示文库.结果 成功构建了rhTNF-α全套单链抗体噬菌体表面展示文库.经M13KO7超感染后,噬斑计数滴度为2.1×1011 pfu.结论 rhTNF-α全套单链抗体噬菌体表面展示文库的构建,为研究rhTNF-α抗体结合位点,了解其结构与功能的关系以及研究用于临床免疫治疗的新型抗体打下了基础.     

前列腺癌患者噬菌体抗体库的构建

[目的]构建前列腺癌患者的噬菌体抗体库,为前列腺癌特异性的人源性抗体 Fab片段的筛选及其应用奠定基础.[方法]由前列腺癌患者外周血分离得淋巴细胞,完整提取其总 RNA,经 RT PCR及半套式扩增得到免疫球蛋白全部轻链和重链 Fd段基因,然后经酶切、纯化、连接等步骤克隆进载体 pComb3,并电转化大肠杆菌 XL1 Blue,从而构建前列腺癌患者噬菌体抗体库.[结果] 成功构建噬菌体抗体 Fab片段库,其轻链及重链 Fd段与载体 DNA的重组率分别为 87%、 79%,库容为 23.2× 107,滴度为 87× 1012 mL- 1.[结论]本研究成功构建了前列腺癌患者噬菌体抗体库.     

鼠抗脂多糖单链噬菌体抗体库的构建

目的　构建一个鼠源性的抗脂多糖 (Lipopolysaccharide ,LPS)单链噬菌体抗体库 ,以供进一步生物医学应用。方法　用纯LPS免疫BALB/c小鼠 4个星期后 ,从脾细胞中提取总RNA ,用RT PCR技术扩增出小鼠抗体重链、轻链可变区基因 (VH ,VL) ,然后用Linker将VH ,VL交联形成单链抗体可变区片段 (ScFv)。经NotI、SfiI双酶切后与经同样双酶切的pCANTAB5E噬菌粒载体相连 ,转化入感受态大肠杆菌TG1,构建鼠抗LPS单链噬菌体抗体库 ,并随机抽取转化后的 4个大肠杆菌TG1菌落 ,以检测外源DNA的转入情况。结果　ELISA法检测小鼠血清中抗LPS的效价为 1∶12 80 0。提取的总RNA浓度为 12 .3 813 μg/ml ,纯度较好。扩增出的VH长约 3 4 0bp ,VL长约 3 2 0bp ,ScFv长约 80 0bp。转化入TG1后有约 1.9× 10 7个菌落 ,抽提 4个菌落后经SfiⅠ、NotⅠ双酶切的结果显示有 1个菌落的质粒转化进了外源DNA片段。结论　成功地构建出了一个有效库容量为 4.75× 10 6的鼠抗LPS单链噬菌体抗体库。     

抗人β-淀粉样肽特异性单链抗体的噬菌体抗体库的构建与初步鉴定

目的:运用噬菌体展示技术构建抗人β-淀粉样肽(Aβ)特异性单链抗体的抗体库并进行初步鉴定.方法:从Aβ免疫的BALB/c小鼠脾淋巴细胞中提取总RNA,分离纯化mRNA,经逆转录合成其总cDNA.以PCR方法分别扩增出抗体的重链(VH)和轻链(VL)可变区基因片段,再经重组PCR将两基因片段由编码十五肽(Gly4Ser)3的接头连在一起,克隆到噬菌粒载体pCANTAB 5E中,转化至大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体M13K07超感染后回收全部重组噬菌体,构建噬菌体抗体库,SDS-PAGE鉴定纯度.结果:经琼脂糖凝胶电泳分析,RT-PCR方法扩增的抗体VH和VL基因片段大小约350bp和325 bp,与预期VH,VL基因片段理论值相符.经重组PCR得到大小约750 bp的ScFv基因片段.ScFv基因片段经双酶切后成功定向克隆到噬菌粒载体,回收后构建成库容量为1.1×10<'8>的噬菌体抗体库,经SDS-PAGE鉴定,得到M,约为30000 ku,纯度较好的scFv抗体.结论:成功构建了库容量大的特异性噬菌体抗体库,为抗人Aβ特异性抗体的筛选、生物活性鉴定、临床实验诊断方法建立和治疗应用打下基础.     

用Cre-Loxp系统构建人胶质瘤单链抗体噬菌体抗体库

目的　构建人源性胶质瘤噬菌体抗体库 .方法　从胶质瘤患者外周血淋巴细胞中提取细胞总 RNA,经逆转录后用套式 PCR分别扩增抗体轻链 Vκ 和重链 VH 基因 .分别构建 Vκ5 .5× 10 6,VH3.5× 10 6基因库 ,连接 Vκ和 VH构建单链抗体 (Sc Fv)基因库 ,并克隆入表达载体 p DNA5内进行重组 ,得到 Sc Fv噬菌体抗体库 .结果　表明经 Cre- L oxp5 11系统重组后 ,噬菌体抗体库库容量达到 6 .0× 10 8,测序证实抗体基因与人源性抗体基因数据库同源 .结论　利用 Cre- L oxp5 11胞内重组系统成功地构建了较大容量的人源性脑胶质瘤噬菌体抗体库 ,为进一步筛选特异性人源性胶质瘤 Sc Fv奠定了基础 .     

人源抗Rh(D)单链抗体基因的克隆和表达

目的:构建人源抗红细胞Rh(D)抗原单链噬菌体抗体库。方法:应用噬菌体展示技术,从分泌抗Rh(D)抗体的细胞中提取总RNA,逆转录合成cDNA第一条链,多次PCR扩增和克隆抗体可变区基因(VH/VLcDNA),经重叠延伸拼接(SOE)用编码连接肽(Gly4Ser)3的互补序列组成scFv基因,经酶切克隆入载体pCANTAB5E,使之呈现于噬菌体表面。使用完整Rh+型红细胞进行四轮淘汰筛选,ELISA对所获抗体进行初步鉴定。结果:构建的噬菌体抗体库库容为1.2×107,噬菌体DNA中全长scFv基因的插入率为0.80,用辅助噬菌体援救后,得到滴度为3×108pfu/ml的初级噬菌体抗体库。以完整Rh+型红细胞进行四轮淘汰筛选,出现特异性富集。经DotELISA实验鉴定,得到1株与Rh+型红细胞特异结合的scFv噬菌体抗体。结论:运用噬菌体抗体库技术构建了人源抗红细胞Rh(D)抗原的噬菌体抗体库,为进一步对所获克隆株进行序列分析、可溶性抗体表达和纯化奠定了基础。     

人源抗狂犬病毒免疫型抗体库的构建及特异性抗体筛选与鉴定

目的:利用噬菌体展示技术,构建人源抗狂犬病毒单链抗体库,筛选特异性的抗狂犬病毒糖蛋白人源单链抗体(scFv)并对其进行初步鉴定。方法:从接种狂犬疫苗的志愿者外周血中提取总RNA,RT-PCR扩增VH和VL基因,并利用重叠扩增PCR将VH和VL拼接为scFv。将纯化后的scFv克隆至噬菌体载体pComb3XSS构建人源抗狂犬病毒单链抗体库,以狂犬病毒糖蛋白(RABVG)为抗原,从抗体库中筛选抗RABVG的scFv。通过phage-ELISA验证噬菌体单链抗体的结合特异性,将阳性克隆转化E.coliTOP10F′进行表达。结果:构建了人源抗狂犬病毒抗体库,抗体库的库容为3.29×109。经过5轮筛选,获得43株与RABVG特异结合的噬菌体单链抗体,其中15个A450值较高的克隆序列分析结果显示,有3个正确的单链抗体基因。单链抗体基因转化TOP10F′构建工程菌,表达纯化后的单链抗体,经ELISA检测能够与RABVG特异性结合。结论:从构建的人源免疫型抗狂犬病毒单链抗体库筛选出的能与RABVG特异性结合的scFv,为进一步制备抗RABVG的治疗性人源化抗体奠定了基础。     

抗HCMV人源化噬菌体抗体库的构建

目的构建抗巨细胞病毒噬菌体抗体库,为制备巨细胞病毒感染治疗用单克隆抗体奠定基础.方法以巨细胞病毒感染患者外周血淋巴细胞为材料,建立噬菌体抗体库,并对其进行鉴定.结果构建完成了一个库容为6.5 ×106cfu/ml的噬菌体抗体库.结论人源化抗巨细胞病毒噬菌体抗体库的建立为下一步抗体的筛选和表达奠定了基础.     

人源抗HBsAg噬菌体抗体的筛选及其重链基因结构分析

筛选出结合乙型肝炎病毒表面抗原的人噬菌体抗体并对其重链和轻链基因序列进行分析。方法：应用噬菌体抗体库技术筛选出人源抗ＨＢｓＡｇ噬菌体抗体，并用ＥＬＩＳＡ及竞争抑制试验测定其活性及特异性，利用全自动测序仪测定其重链基因序列。     

Phage therapy—constraints and possibilities

The rise of antibiotic-resistant bacterial strains, causing intractable infections, has resulted in an increased interest in phage therapy. Phage therapy preceded antibiotic treatment against bacterial infections and involves the use of bacteriophages, bacterial viruses, to fight bacteria. Virulent phages are abundant and have proven to be very effective in vitro, where they in most cases lyse any bacteria within the hour. Clinical trials on animals and humans show promising results but also that the treatments are not completely effective. This is partly due to the studies being carried out with few phages, and with limited experimental groups, but also the fact that phage therapy has limitations in vivo. Phages are large compared with small antibiotic molecules, and each phage can only infect one or a few bacterial strains. A very large number of different phages are needed to treat infections as these are caused by genetically different strains of bacteria. Phages are effective only if enough of them can reach the bacteria and increase in number in situ. Taken together, this entails high demands on resources for the construction of phage libraries and the testing of individual phages. The effectiveness and host range must be characterized, and immunological risks must be assessed for every single phage.     

Selection of humanized antibody against HBsAg and analysis of gene encoding its heavy chain

Themethod'combinatorlalimmunoglobulinlibraries'forthegenerationofmAbhasbeendevelopedsinceitwasreportedfirstlyin19891'.Asthe'phagedisplaytechnology'2comingout,'phageantibodylibrary'waswidelyusedtoisolatespecificantibodyfragmentsfromlargeantibodygenepoolsbyphagedisplay.Comparingwithconventionalhybridomatechnology,humanphageantibodytechnologyhasmoreadvantages:1.Theprocessisefficient,andarelativelylargenumberofantibodiesareproduced.2.Ithasprovenpossibletomimicthekeyfeaturesofthehumoralimmunesyste…     

用pIII及pVIII噬菌体展示系统展示抗原和抗原表位的免疫原性的研究

目的:探索用pIII和pVIII噬菌体展示系统展示抗原和抗原表位的免疫源性以及用噬菌体展示颗粒为免疫原制备抗体的可能性.方法:从人心肌组织中获得cTnI基因,突变后克隆入pMDT-18载体及pFD5 pIII型噬菌体展示载体.合成两条互补寡聚核苷酸单链,退火后变成编码cTnI 95～108位氨基酸的双链,与 PC89 pVIII型噬菌体展示载体连接.含有cTnI及其抗原表位基因的重组质粒转化辅助噬菌体敏感的XL1-Blue细胞,用VCSM13超感染获得展示有cTnI及其抗原表位的噬菌体颗粒,测定其表达量.并以此为免疫源免疫新西兰白兔获得抗体,用ELISA方法测定抗体滴度.结果:cTnI及其抗原表位在噬菌体颗粒表面得到成功展示,展示量分别为5 ng/ml和96 ng/ml.免疫后得到的抗体滴度为1∶300和1∶1?800.结论:制备具有一定空间结构的大分子蛋白的抗体时,可用pIII噬菌体展示系统,制备小分子肽线性表位的抗体时,pVIII展示系统具有独特的优势.     

螺旋霉素产生菌抗噬菌体菌株的选育

用Ｃｏ＾６０处理螺旋霉素产生菌ＰＳ，获得了一株抗噬菌体且摇瓶发酵单位比原菌株稍高的突变株Ｒ１０，继而对Ｒ１０进行理性化筛选，在加有２－脱氧葡萄糖的分离培养基上分离到一株抗噬菌体稳定、摇瓶发酵单位又比Ｒ１０高２０％的新突变株，且其摇瓶发酵周期缩短１２ｈ、能耐受更高浓度的自身代谢产物－螺旋霉素。     

噬菌体展示技术筛选卵巢癌细胞表面转移相关分子结合肽

目的：利用噬茵体7肽库筛选高转移潜能卵巢癌细胞株HO-8910PM表面转移相关分子结合肽。方法：利用噬茵体展示技术体外快速差减筛选（biopanning and rapid analysis of selective inter-activeligands,BRASIL）卵巢癌细胞株HO-8910和HO-8910PM,经过连续5轮生物淘洗,随机挑选14个噬茵体单克隆进行DNA测序,并进行ELISA、噬茵体竞争结合实验验证阳性噬茵体的亲和性。结果：噬菌体克隆Z3（短肽LRLRNTR）对高转移潜能卵巢癌细胞株HO-8910PM有较高的亲和性。结论：噬茵体展示技术筛选的短肽LRLRNTR可望为卵巢肿瘤早期诊断、转移复发及治疗提供新的方向。     

噬菌体表面展示人干扰素-α 2b

目的:建立一种研究人干扰素-α结构与功能的新平台.方法:利用噬菌体表面展示(phage display)技术表达人干扰素-α 2b(hIFN-α 2b)基因.结果:生物活性测定表明,3×108 TU重组噬菌体干扰素的抗病毒活性与5 IU基因工程IFN-α 2a的活性相当,并能被IFN-α单抗中和.结论:hIFN-α 2b在噬菌体表面能正确折叠和功能性表达,即成功地建立了噬菌体展示外源肽(hIFN-α)的技术平台.     

钠泵抑制物噬菌体单链抗体库的构建

目的　应用噬菌体展示技术构建钠泵抑制物单链抗体库 .方法　用 OUA- OVA(ouabain- ovalbumin)免疫小鼠 ,取脾脏 ,分离淋巴细胞 ,提取 m RNA,逆转录成 c DNA第一链 ,用简并引物经 PCR分别扩增轻、重链抗体库 ,经重叠延伸PCR由 L inker将轻、重链拼接成 Sc Fv(单链抗体 ) ,用 RS引物以 Sc Fv为模板进行第 2次 PCR,同时在 5 及 3 端分别加上 Sfi I,N ot I酶切位点 .经 Sfi I,N ot I酶切后 ,在 T4连接酶的作用下将 Sc Fv与 p CANTAB 5 E噬菌粒连接 ,电转化进入TG1大肠杆菌 ,挑取 12个单菌落提取质粒用 Eco R 和 H ind 进行酶切鉴定 ,后经 M13KO7辅助噬菌体拯救 ,离心收集上清即为全套 Sc Fv基因的噬菌体表面展示文库 .结果　以OU A- OVA免疫小鼠 ,检测血清中抗体效价可达 (1∶ 2×10 6 ) ,用通用引物分别扩增出轻、重链片段的大小为 32 5 bp和 34 0 bp,将两者拼接得到约 72 0 bp大小的单链抗体库 ,以8× 10 1 1 的转化效率转染 TG1细胞 ,Eco R 和 H ind 酶切后 ,12个单菌落所提噬菌粒 DNA中有 10个切出了约为 2 .1kb的目的条带 ,所构建的噬菌体抗体库库容量约为 1.2× 10 8.经 M13KO7超感染后 ,测噬斑滴度为 9× 10 1 4 pfu· L- 1 .结论　成功地构建了钠泵抑制物噬菌体单链抗体库 .     

噬菌体呈现技术研制特异性人抗骨肉瘤干扰素

目的利用噬菌体表面呈现技术研制高活性、特异性抗骨肉瘤干扰素。方法将干扰素IFNαlc／86DDNA插入噬菌体质粒载体pCANTAB5E,并构建噬菌体IFNαlc／86DAB环突变文库;通过在OS732细胞上竞争性亲合洗脱、MTT法对比检测抗肿瘤活性,筛选针对OS732细胞的高活性噬菌体-IFN突变体。结果获得2个噬菌体-IFN突变体,其抗OS732细胞增殖活性较突变母体分别提高4和16倍。结论αl型干扰素可在噬菌体表面正确折叠表达。这一技术可用于研制高活性特异性IFN。