豆豉AprE9912D血栓溶解酶的制备与活性评价

目的 通过基因工程技术生产的豆豉血栓溶解酶,研究其安全性及溶栓功效.方法 采用酪蛋白平板从豆豉中分离获得具有纤溶活性的候选菌株,利用基因工程技术将其AprE9912D基因在大肠杆菌BL21(DE3)-pDEl中过表达AprE9912D重组蛋白.经过Ni-NTA纯化柱和透析纯化AprE9912D重组蛋白,体外采用纤维蛋白...     

大肠杆菌DNA复制相关蛋白PriC的初步研究

目的：对大肠杆菌DNA复制相关蛋白PriC进行研究。方法：构建重组表达载体pET21a-PriC及pET21a-PriC1-101,并进一步诱导表达纯化。利用Pulldown手段将pET21a-PriC-notag与pET28at-plus-PriB分别转化到大肠杆菌BL21（DE3）中,诱导表达及共纯化后检测PriC与PriB的相互作用情况。结果：PriC经Ni柱亲和层析纯化获得的蛋白稳定性较差,易沉淀。根据二级结构和蛋白稳定性预测及限制性蛋白酶水解结果,构建了PriC的截短突变蛋白PriC1-101,经Ni亲和层析和superdex75纯化,获得了稳定性较好的蛋白,经Western blot鉴定为目的蛋白。PriC1-101的圆二色谱分析发现其具有较多的α-helix和无规卷曲,这为更好的了解其结构奠定了重要的基础。通过Pulldown手段发现PriC与PriB存在相互作用,并且PriC的稳定性有所提高。结论：PriC蛋白的C-端氨基酸序列是PriC蛋白与PriB蛋白相互作用的主要区域,并对PriC蛋白的稳定性有较大影响。     

重组人成骨蛋白-1在大肠杆菌中的高效表达及复性

 目的研究重组人成骨蛋白-1(rhOP-1)的发酵、纯化和复性。方法将构建好的重组质粒pBV221转化Escherichia coliBL21,迅速升温至42℃诱导rhOP-1以包涵体的形式高效表达。裂菌后利用6mol·L^-1尿素溶解目的蛋白,经SP-FastFlow离子交换色谱纯化后,利用cysteine/cystine对单体rhOP-1透析复性。结果rhOP-1的表达量占菌体总蛋白质量的33%,纯化后纯度可达98%,活性得到有效恢复。结论建立了rhOP-1发酵、纯化与复性的方法,获得高表达、高纯度、有活性的rhOP-1。     

呼吸道合胞病毒重组蛋白DsbA-G1F/M2的制备方法及免疫原性研究

 目的建立呼吸道合胞病毒(RSV)重组蛋白DsbA-G1F/M2的制备方法,并研究其免疫原性。方法PCR扩增G1和F/M2基因片段,经酶切后插入原核表达载体pET-DsbA中,构建重组质粒pET-DsbA-G1F/M2,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3),IPTG诱导表达,采用Ni⁺螯合亲和色谱法纯化尿素变性的包涵体溶液,梯度透析复性,Western-blot鉴定重组蛋白的RSV特异性,免疫BALB/c小鼠,用ELISA测定抗体滴度,MTT法测定细胞毒性T细胞活性(CTL)。结果构建的重组质粒在E.coli中表达了RSV特异性的重组蛋白,经变性、纯化并复性后获得了高纯度的DsbA-G1F/M2(>90%);该蛋白诱导了高滴度的RSV特异性抗体和CTL活性。结论建立了重组蛋白DsbA-G1F/M2的制备方法,该蛋白具有良好的免疫原性,为进一步研究开发RSV重组亚单位疫苗奠定了基础。     

广西眼镜蛇毒中Natrin的克隆及在E.coli中的表达

目的采用基因工程技术,在大肠杆菌中表达广西眼镜蛇毒中Natrin成熟蛋白。方法将来源于广西眼镜蛇毒的Natrin蛋白的基因克隆至融合表达载体pMAL-c2x中,以N端融合了麦芽糖结合蛋白的形式在大肠杆菌BL21(DE3)通过异丙基硫代半乳糖苷诱导表达Natrin蛋白。超声破菌后,将上清液经Amylose树脂柱上纯化后,收集并冻干Natrin融合蛋白,利用蛋白印迹分析其是否有Natrin抗原活性。结果经蛋白印迹分析可知在50 kD处的条带具有Natrin抗原活性。结论在大肠杆菌中可以表达出Natrin蛋白。     

重组人组织型纤溶酶原激活剂改构体的表达、复性与分离纯化

 目的 获得具有高纯度、高生物活性的重组人组织型纤溶酶原激活剂改构体(瑞替普酶,reteplase,r-PA)。方法 reteplase基因克隆到表达质粒pJZ"-100中,转化Escherkhia coli BL21(DE3),在0.05mmol·L^-1异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG)诱导下获得高效表达,表达产物通过脉沖稀释法复性,复性后的蛋白质用ETI-Sepharose4B亲和色谱纯化。结果 表达产物占菌体总蛋白质的20%,脉冲稀释法复性后复性收率为28%,经纯化后纯度达96%以上,比活为580 000 IU·mg^-1。结论 建立了reteplase表达、复性与纯化工艺,以此工艺可获得高活性高纯度的reteplase。     

建泽泻鲨烯合酶原核表达、功能验证及其免疫检测研究

泽泻鲨烯合酶(Ao SS)催化法呢基焦磷酸[(farnesyl diphosphate,FPP)]合成鲨烯,是碳源流向原萜烷型三萜生物合成的关键调节酶。为深入研究Ao SS基因的功能及表达,课题组将前期克隆获得的建泽泻鲨烯合酶基因(accession No.JX866770)的开放阅读框(ORF)构建到原核表达载体p Czn1上,并在大肠杆菌BL21(Roseta)中进行诱导表达,诱导表达出的融合蛋白主要以包涵体的形式存在,经纯化获得高纯度的目的蛋白;以此目的蛋白进行体外酶促反应验证其功能,其结果显示该目的蛋白具有催化法呢基焦磷酸生成鲨烯的活性;为进一步研究其表达规律,在此基础上,利用该蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体并纯化,ELISA检测抗体效价大于1∶51 200,Western blotting检测表明其具有较好的特异性;用制备得到的抗体免疫检测建泽泻Ao SS在不同组织中的表达情况,结果显示建泽泻块茎中Ao SS表达最高,其次为叶,根中表达甚微。原核表达载体的成功构建、基因功能的进一步验证及快速免疫检测方法的建立,为进一步开展Ao SS基因功能及其调控的研究奠定基础,为泽泻资源性成分原萜烷型三萜的合成生物学应用提供科学依据。     

人铜锌超氧化物歧化酶cDNA的克隆、表达、发酵及纯化工艺研究

 目的:用基因工程的方法获得人铜锌超氧化物歧化酶(hCu,Zn-SOD)的高产菌,通过发酵培养,最后纯化获得大量廉价的高纯度的hCu,Zn-SOD?方法:用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),扩增了人铜锌超氧化物歧化酶(hCu,Zn-SOD)的cDNA,将此正确测定的cDNA重组到分泌型表达载体pET-22b(+)中,重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中用5L全自动发酵罐表达hCu,Zn-SOD,表达产物用亲和层析一步法进行纯化?结果:hCu,Zn-SOD表达产物占菌体总蛋白的30%,发酵水平酶活力可达950u·ml^-1培基,比活为1400u·mg^-1,经亲和层析后纯度可达88%,活力回收率大于80%,比活大于5000u·mg^-1?结论:我们开展人重组SOD的研究不仅大大丰富了应用酶学的内容,而且积极开展应用研究,实现产业化,意义重大?     

重组人胰高血糖素样肽前药的表达、纯化及生物活性分析

 目的建立重组人胰高血糖素样肽前药(prodrug of recom binant human GLPs,Pro-rhGLPs)的表达、纯化方法,研究Pro-rhGLPs对体内血糖水平及血清胰岛素水平的影响。方法采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG,0.01mmol·L^-1)诱导原核表达系统E.coli BL21(DE3)/pET32a(+)-hGLPs表达Pro-rhGLPs,12%SDS-PAGE检测蛋白表达量,Ni-NTA亲和层析纯化Pro-rhGLPs,应用Westernblot在体外观察前体药物的活性分子释放过程。在C57BL/6小鼠上进行葡萄糖耐量实验检测其生物学活性,不同时间间隔取血测定血糖及血清胰岛素水平。在糖尿病db/db小鼠上观察其降糖作用。结果所构建的Pro-rhGLPs原核表达系统中,Pro-rhGLPs表达量约为细菌总蛋白的50%。纯化得到的蛋白纯度达到95.43%,并且可以在特异性酶作用下缓慢降解,释放出多个胰高血糖素样肽1(GLP-1)分子。纯化的Pro-rhGLPs呈剂量依赖性降低血糖浓度,同时升高血清胰岛素水平。等剂量Pro-rhGLPs的降糖作用较GLP-1作用更强。结论建立了Pro-rhGLPs高效表达、纯化方法,获得了高纯度Pro-rhGLPs,对糖尿病小鼠具有明显的降血糖作用。     

金黄色葡萄球菌肠毒素E的克隆表达及其生物活性研究

 目的克隆金黄色葡萄球菌肠毒素E(SEE)基因,获得重组SEE蛋白(rSEE),并对rSEE进行生物活性分析。方法通过PCR从金黄色葡萄球菌FR1326菌株基因中得到肠毒素SEE的成熟肽基因,将其克隆至融合表达载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌进行表达并对融合蛋白进行亲和色谱纯化,通过MTF法研究其生物活性。结果成功构建了SEE的表达载体,并得到高纯度的重组蛋白。MTY法结果表明,rSEE具有良好的促淋巴细胞增殖的能力以及肿瘤细胞的杀伤活性。结论具超抗原活性和高纯度的rSEE,为进一步研究该蛋白的抗肿瘤机制,构建靶向抗肿瘤融合蛋白奠定了基础。     

甲型H1N1流感病毒NA蛋白的原核表达及其单克隆抗体制备

目的:利用原核系统表达甲型H1N1流感病毒NA蛋白,制备NA特异性单克隆抗体。方法:采用RT-PCR技术扩增A/Shenzhen/71/09病毒株NA基因,通过原核表达系统表达含6×His标签NA重组蛋白,利用镍离子亲和柱进行纯化。使用NA蛋白以100g/只剂量免疫BALB/C小鼠,3次免疫后,利用杂交瘤技术筛选分泌NA特异性单克隆抗体的细胞株,采用Western-blot方法对单抗进一步验证。结果:成功克隆A/Shenzhen/71/09NA基因,长度约1400bp。将NA基因克隆入原核表达载体pET-21b(+),经IPTG诱导后在大肠杆菌包涵体中检测到目的蛋白,分子量约50kd。采用尿素变性处理后借助6×His标签对蛋白进行纯化。用纯化蛋白免疫小鼠,将脾细胞与SP2/0细胞融合,使用ELISA检测细胞上清NA抗体,共筛选1株持续分泌NA抗体的杂交瘤细胞株7C11。Western-blot验证该单克隆抗体可以特异性结合NA抗原。结论:成功表达甲型H1N1流感NA蛋白,获得1株分泌NA抗体的单克隆细胞株,从而为后续甲流诊断及疫苗研制奠定基础。     

以人表皮生长因子受体2为靶点的强化融合蛋白LDP-Hr-AE的构建及抗肿瘤活性研究

 目的 制备一种以人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2, HER2）为靶点的由抗体重链超变区多肽与力达霉素组成的强化融合蛋白LDP-Hr-AE,并初步探讨其抗肿瘤活性。方法 通过聚合酶链式反应扩增出抗人表皮生长因子受体2抗体C6.5重链CDR3区的20个氨基酸残基基因,将其与力达霉素辅基蛋白基因连接构建出融合蛋白基因ldp-Hr,转化至大肠杆菌中进行诱导表达。融合蛋白LDP-Hr采用HisTrap Ni²⁺亲和色谱柱进行分离纯化,高效液相色谱法检测其纯度。细胞免疫荧光法和基于流式细胞术的亲和实验分析融合蛋白与肿瘤细胞的结合活性。纯化的LDP-Hr蛋白与力达霉素发色团在体外进行组装,构建出强化融合蛋白LDP-Hr-AE。采用MTT法检测强化融合蛋白对肿瘤细胞的杀伤活性,Annexin V-FITC/PI双染结合流式细胞术的方法检测LDP-Hr-AE蛋白对细胞凋亡的影响。结果 成功构建并表达了融合蛋白LDP-Hr,目的蛋白以可溶形式分泌至大肠杆菌培养液和周质腔中,产量可达每升发酵液40 mg活性蛋白,纯化后的蛋白经高效液相色谱法检测纯度为97.4%。细胞免疫荧光实验和基于流式细胞术的亲和实验检测结果均显示LDP-Hr蛋白与HER2高表达的肿瘤细胞系（如SK-BR-3和SK-OV-3细胞）都有很强的结合活性。LDP-Hr蛋白与力达霉素发色团在体外组装后经高效液相色谱法检测350 nm处出现特定吸收峰,表明强化融合蛋白LDP-Hr-AE构建成功。采用MTT法检测了强化融合蛋白的体外杀伤活性,结果显示,LDP-Hr-AE对肿瘤细胞有强烈的杀伤作用,且其杀伤活性要高于力达霉素。细胞凋亡检测结果也表明LDP-Hr-AE在极低的浓度下（如0.1 nmol·L^-1）即可强烈的诱导细胞发生凋亡,且凋亡的比率随着蛋白浓度的升高而增加。结论 本实验制备的强化融合蛋白LDP-Hr-AE可以特异的与人表皮生长因子受体2结合,对肿瘤细胞具有强烈的杀伤活性和诱导凋亡能力,具有发展为抗肿瘤靶向药物的潜能。     

海胆壳蛋白的分离纯化及抗肿瘤活性

目的：从光棘球海胆（Strongylocentrotus nudus）中分离纯化具有生物活性的海胆壳蛋白。方法：海胆壳先经丙酮脱脂，然后生理盐水提取、超滤、离心得海胆壳蛋白粗品。粗品经超滤、DEAE—Sepharose Fast Flow及Sephacryl S-400柱层析纯化得海胆壳蛋白SUP-1A。经聚丙烯酰胺凝胶电泳和高效液相色谱鉴定其纯度达90％以上。通过MTT法测定了SUP-1A的体外抗肿瘤活性。结果：从海胆壳中分离纯化得到单一蛋白组分的SUP-1A，MTT法表明SUP-1A对多种肿瘤细胞的增殖都有较强的抑制作用。结论：从海胆壳中分离纯化到一种蛋白组分SUP-1A，其具有较强的体外抗肿瘤活性。     

抗人表皮生长因子受体2人源化单克隆抗体在中国仓鼠卵巢细胞中的表达、纯化及活性测定

 目的 筛选得到稳定表达重组人源化抗 HER2 单克隆抗体（rhHER2-mAb）的中国仓鼠卵巢细胞（CHO）最优表达株,采用旋转振荡式培养及小规模放大,测定纯化后抗体蛋白的活性和亲和力。方法 使用一次性旋转振荡生物反应器——Tubespin 对细胞株进行高通量筛选,然后使用摇瓶进行规模放大培养,利用 Protein A 亲和层析柱纯化融合蛋白,SDS-PAGE、HPLC 检测产物的纯度,夹心ELISA 检测产物的表达量,MTT检测产物的活性。结果 通过比较,确定产量最高的 # 38 细胞克隆株,经过规模放大培养得到足量细胞上清液,摇瓶表达量达到（152±20） mg·L^-1。纯化后经检测目的蛋白的相对分子质量约为 150×10³,纯度在 96% 以上,与商品化的赫赛汀一致;活性检测和亲和力检测也显示其活性和亲和力与赫赛汀相当。结论 通过细胞株筛选得到高表达细胞株,经旋转振荡式放大培养,成功纯化获得抗体蛋白,与商品化药物性质一致,为大规模旋转振荡培养发酵奠定基础。     

重组人Cu,Zn-SOD包含体的复性、纯化及复性蛋白稳定性研究

 目的通过体外复性和纯化技术获得具有高纯度、高生物活性的重组人铜锌超氧化物歧化酶(rhCu,Zn-SOD),并研究复性蛋白的稳定性。方法以透析法对在大肠杆菌中以包含体形式表达的rhCu,Zn-SOD进行复性,采用金属螯合亲和层析对复性样品进行纯化,通过酶活性测定考查复性和纯化的rhCu,Zn-SOD的热稳定性、pH稳定性和对变性剂的稳定性。结果建立了体外透析复性的基本条件,其比活可达2 380 U·mg^-1。该复性样品经金属螯合亲和层析纯化后,结果得到纯度大于95%、比活5 000 U·mg^-1、活性回收率大于100%的目的蛋白。复性和纯化蛋白在温度25～70℃和pH 5.0～10.5内活性稳定,并可耐受2～10 mol·L^-1的尿素和2%～8%的十二烷基硫酸钠(SDS),对更强烈的变性剂盐酸胍稳定性较弱。结论确定了重组人Cu,Zn-SOD包含体的体外复性条件和复性蛋白纯化方法,且复性蛋白表现出很好的稳定性,为重组人Cu,Zn-SOD的生产奠定了良好基础。