骨形态发生蛋白-2基因转染骨髓基质干细胞复合壳聚糖体外构建组织工程软骨的实验研究

目的观察转人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因的骨髓基质干细胞(BMSCs)向软骨细胞方向分化的能力,并种植于壳聚糖体外构建组织工程软骨。方法应用慢病毒介导把人BMP-2基因和增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因转入大鼠BMSCs,通过荧光观察、反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Westernblot、免疫组织化学等方法检测BMP-2、Ⅱ型胶原表达及软骨基质分泌情况;噻唑蓝(MTT)检测转基因后细胞的增殖活力。结果BMP-2基因和eGFP基因成功转染BMSCs,Ⅱ型胶原及蛋白聚糖的表达均显著增强,细胞种植壳聚糖支架后生长、粘附良好。结论BMP-2可在BMSCs内表达,并诱导其向软骨方向分化;与壳聚糖复合培养可构建组织工程骨。     

瘦素对体外三维培养大鼠关节软骨细胞的作用及对软骨修复相关基因IGF-I表达的影响

目的 研究瘦素对体外三维培养大鼠关节软骨细胞的活性、增殖及功能的影响,并探讨其对软骨修复基因IGF-I的影响.方法 将体外培养扩增的大鼠软骨细胞与海藻酸钙结合,制成软骨细胞/海藻酸钙复合物.诱导培养液中添加不同浓度瘦素,24 h后MTT检测法检测细胞活性.Realtime PCR定量研究IGF-I mRNA表达,分析评价软骨细胞分泌的功能.结果 通过对提取的细胞形态学观察及染色证实为软骨细胞在不同浓度瘦素诱导下,三维培养的大鼠软骨细胞增殖活性及修复基因IGF-I与A组(空白组)对比均有上调(P<0.05),同时瘦素浓度为10 ng/ml时上调幅度明显高于其他组(P<0.01).结论 在三维培养下,低浓度瘦素更有利于大鼠软骨细胞生长.瘦素结合三维培养能有效维持大鼠关节软骨细胞的表型,并促进细胞ICF-I合成分泌.     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离增殖及分化潜能活性

目的：建立大鼠骨髓间充质干细胞（MSC）体外分离、纯化、增殖的方法，并观察其体外分化为成骨细胞及软骨细胞的潜能活性。方法：取SD大鼠的股骨及胫骨，冲取骨髓液，采用贴壁培养法分离纯化MSC，增殖，并测定其生长曲线。对第三代大鼠MSC进行成骨矿化诱导，测定其碱性磷酸酶（ALP）活性及成骨矿化情况。对第三代大鼠MSC进行诱软骨细胞的诱导分化，测定诱导后的细胞表型情况。结果：大鼠MSC为均一的梭形的成纤维细胞样生长，贴壁及增殖能力强。生长曲线呈S型。在成骨诱导剂作用下，MSC具有成骨能力，诱导后AIP活性显著提高。并出现矿化结节沉积。在成软骨诱导剂作用下，可见细胞由成纤维细胞样的梭形变为椭圆形及肾形，并分泌异染基质，甲苯胺蓝染色呈阳性，表现为软骨细胞分化特点。结论：获得的SD大鼠MSC生长旺盛，增殖能力强。在特定诱导条件下。大鼠MSC体外可定向分化为成骨细胞及软骨细胞。具有成骨及成软骨分化潜能。     

补肾方剂对大鼠骨髓基质干细胞增殖与分化的影响

目的观察补肾方剂对体外培养SD大鼠骨髓基质干细胞细胞增殖、分化及矿化的影响。方法应用四甲基偶氮唑盐法、硝基苯磷酸盐法及茜素红染色方法观察不同浓度补肾方剂对体外培养骨髓基质干细胞在1、2、3、4、5d时的增殖、碱性磷酸酶(ALP)活性及矿化结节形成的影响。结果不同浓度的补肾方均可促进骨髓基质干细胞增殖率提高,以中、高浓度组的作用较为明显(P<0.01);不同浓度补肾方剂可使ALP活性增强(P<0.01);中、高浓度组补肾活血方矿化结节数量显著多于对照组(P<0.01)。结论补肾方剂具有促进骨髓基质干细胞的增殖、分化及矿化的作用。     

大黄素对体外大鼠骨髓基质细胞向脂肪细胞方向分化的影响

目的观察大黄素对骨髓基质细胞向脂肪细胞方向分化的影响,以探讨大黄素对骨质疏松发生时伴随的脂肪增多现象中所起的作用。方法16只3mon龄SD大鼠随机分成4组:对照组、激素组、复方碳酸钙治疗组、大黄素治疗组。给药90d后收集骨髓基质细胞。应用油红O染色法及RTPCR的方法判断是否成功诱导骨髓基质细胞向脂肪细胞方向分化,同时观察大黄素对骨髓基质细胞成脂分化后脂肪细胞的数目和脂蛋白脂酶mRNA表达的影响。结果体内灌胃给予泼尼松的激素组大鼠的骨髓基质细胞体外培养时分化为脂肪细胞的能力明显增强。复方碳酸钙组和大黄素组大鼠骨髓基质细胞分化为脂肪细胞的能力较激素组明显下降,其中大黄素下调脂蛋白脂酶mRNA表达的作用强于复方碳酸钙。结论体内给予糖皮质激素后,骨髓基质细胞体外培养时自发向脂肪细胞方向分化的能力和经体外诱导后向脂肪细胞方向分化的能力都明显增强,大黄素可能有对抗糖皮质激素成脂诱导的作用。     

蒙药蓝刺头对兔骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的影响

目的:探讨蒙药蓝刺头对兔骨髓间充质干细胞的体外增殖和成骨分化的影响。方法:制备蓝刺头冻干粉。传代培养符合实验要求的兔骨髓间充质干细胞BMSCs。设置含1,0.1,0.01,0.001,0.000 1 mg·mL^-1蓝刺头的兔BMSCs完全培养基,采用CCK-8法检测不同浓度蓝刺头对兔BMSCs增殖及活力的影响。设置对照组为完全培养基培养、模型组为成骨诱导分化培养基培养、给药组为含0.01 mg·mL^-1蓝刺头冻干粉的成骨诱导分化培养基培养。不同处理组连续干预兔BMSCs 7,14 d后,检测其碱性磷酸酶ALP活性并观察ALP染色情况;连续干预14,21 d后,采用茜素红染色法观察基质矿化情况并进行定量检测,RT-qPCR法检测成骨分化相关指标RUNX-2、OPN、BGLAP、COL-I及ALP mRNA的表达水平。结果:CCK-8实验结果显示,与其余各组相比,0.01 mg·mL^-1蓝刺头组OD值明显升高(P<0.05)。与对照组比较,模型组及给药组均能够提高ALP表达及活性水平(P<0.05),促进细胞外基...     

淫羊藿苷对体外在无地塞米松培养基中诱导培养大鼠骨髓基质细胞成骨性分化的影响

目的：探讨在无地塞米松（dexamethasone）时淫羊藿苷（icariin,ICA）对体外培养大鼠骨髓基质细胞成骨性分化的影响,并试图寻找一种新的或更强的促体外培养骨髓基质细胞成骨性分化的诱导剂。方法用1×10－5 mol·L －1淫羊藿苷或1×10－8 mol·L －1的地塞米松对大鼠骨髓基质细胞分别进行药物干预,细胞计数试剂盒（Cell Counting Kit-8,CCK-8）检测细胞增殖,碱性磷酸酶检测试剂盒检测碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性,茜素红染色检测钙化结节数量,实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测骨保护素（osteoprotegerin,OPG）、核因子-κB 受体活化因子配体（receptor activator of NF-κB ligand, RANKL）、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）的信使 RNA（mRNA）表达情况。结果1×10－5 mol·L －1淫羊藿苷在无地塞米松的培养基中能显著提高大鼠骨髓基质细胞 ALP 活性;明显增加大鼠骨髓基质细胞钙化结节数目;显著上调BMP、OPG mRNA 水平以及 OPG／RANKL mRNA 比值。结论淫羊藿苷可能是一种潜在的促体外培养大鼠骨髓基质细胞成骨性分化的新诱导剂。     

瘦素对体外三维培养大鼠关节软骨细胞的作用及对软骨修复相关基因IGF-I表达的影响

目的 研究瘦素对体外三维培养大鼠关节软骨细胞的活性、增殖及功能的影响,并探讨其对软骨修复基因IGF-I的影响.方法 将体外培养扩增的大鼠软骨细胞与海藻酸钙结合,制成软骨细胞/海藻酸钙复合物.诱导培养液中添加不同浓度瘦素,24 h后MTT检测法检测细胞活性.Realtime PCR定量研究IGF-I mRNA表达,分析评...     

诱导兔骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞和软骨细胞的研究

目的：探讨兔骨髓间充质干细胞(MSC)体外分离培养、增殖，以及向成骨细胞和软骨细胞定向诱导分化的条件，为骨、软骨缺损的修复和重建提供种子细胞。方法：抽取兔髂骨及胫骨的骨髓液，经密度梯度离心法及塑料板贴壁培养法分离纯化出MSC，并增殖。对第二代MSC进行成骨矿化诱导，测定其碱性磷酸酶(ALP)活性及成骨矿化情况。并对第二代MSC进行诱软骨特定培养液诱导，对诱导细胞进行甲苯胺蓝染色，测定诱导后的软骨细胞表型。结果：MSC为梭型的成纤维细胞样贴壁生长，增殖能力强。在成骨诱导剂作用下，MSC具有成骨能力，诱导后ALP活性明显提高，并且出现矿化结节沉积。在成软骨诱导剂作用下，可见细胞由成纤维样的梭形变为椭圆形及肾形，并分泌基质，甲苯胺蓝染色呈阳性，表现为软骨细胞分化特点。结论：在特定诱导条件下，兔骨髓MSC体外可定向诱导分化为成骨细胞和软骨细胞，可用于组织工程骨和软骨组织的修复和重建。     

胰高血糖素样肽-1及其类似物EX-4促进大鼠骨髓间充质干细胞的增殖与成骨分化

目的:观察胰高血糖素样肽-1(GLP-1)及其受体激动剂exendin-4(EX-4)对体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖与成骨分化的影响。方法:取大鼠股骨和胫骨全骨髓,采用贴壁法分离BMSCs并传代至第三代,培养2d后分成4组:BMSC组、诱导成骨组(osteoblast induced medium,OIM组)和诱导加药组,诱导加药组细分为GLP-1(10-9~10-7 mol/L)或EX-4(10-9~10-7 mol/L)的不同浓度组,MTT法检测细胞增殖能力;测定碱性磷酸酶(ALP)活性;通过ALP染色及茜素红染色观察药物诱导BMSCs向成骨细胞分化、矿化的效果;采用RT-PCR方法检测ALP和Runx2成骨相关基因的表达情况。结果:与诱导对照组相比,GLP-1及EX-4各浓度处理组呈剂量依赖性显著促进细胞增殖(P<0.05);ALP染色与茜素红染色结果显示,对照组无显色或显色不明显,而GLP-1及EX-4组均有阳性显色。GLP-1及EX-4可以显著提高ALP活性,并提高Runx2、ALP的表达水平。结论:GLP-1及EX-4不仅能够直接促进BMSCs增殖,并促进其向成骨细胞分化,GLP-1及EX-4可能在骨重建中发挥重要的作用。     

PDGF-B 基因转染骨髓间充质干细胞的实验研究

目的:探讨血小板源性生长因子-B(PDGF-B)基因转染修饰大鼠骨髓间充质干细胞(bone m arrow m esenchym alstem cell,M SC)的可行性。方法:应用FAM标记重组真核表达载体系统(pcDNA3-PDGF-B),以脂质体法转染原代骨髓间充质干细胞,观察转染结果、表达情况及对靶细胞活力的影响。结果:经荧光显微镜下观察证实:成功地对骨髓间充质干细胞实现了基因转染,持续表达时间超过了8周,没有发现明显的细胞毒作用及对细胞活力的显著影响。结论:采用真核转染技术可以介导外源基因转染骨髓间充质干细胞,M SC是一种理想的基因载体细胞,可用于PDGF-B的基因治疗。     

Complex effect of continuous curcumin exposure on human bone marrow‐derived mesenchymal stem cell regenerative properties through matrix metalloproteinase regulation

Curcumin has been reported to be beneficial for cancers, cardiovascular and neurodegenerative diseases, based on its anti‐oxidative, anti‐inflammation, anti‐tumorigenic and neuroprotective properties. With its high‐dose application, curcumin toxicity to systemic tissues is a reasonable concern. Here, we report the responses of human bone marrow‐derived mesenchymal stem cells (hBM‐MSCs) to continuous curcumin exposure. hBM‐MSCs were treated with 0.01‐100 μmol/L curcumin continuously in vitro for 7 days. 25 μmol/L curcumin or above significantly attenuated hBM‐MSC maintenance, whereas 10 μmol/L curcumin reduced hBM‐MSC proliferation and hindered their migration with increasing cell apoptosis. Besides, 5 μmol/L curcumin treatment inhibited hBM‐MSC adipogenic differentiation, but enhanced osteogenic differentiation, which depended on matrix metalloproteinase (MMP)‐13 expression and activity. Furthermore, curcumin treatment reduced MMP1 expression but up‐regulated the immunomodulatory gene IDO1 expression. In summary, this study revealed the complex effects of continuous curcumin exposure on hBM‐MSC maintenance and regenerative properties through MMP regulation. Given the complex effects of curcumin, its use for biomedical purposes should be carefully considered in treatment length and dosage.     

间质干细胞对系统性红斑狼疮患者外周血T细胞亚群的影响

目的 观察间质干细胞（MSC）对系统性红斑狼疮（SLE）患者外周血T细胞亚群的影响。方法 从健康志愿者骨髓中分离培养MSC,从SLE患者外周血中分离单个核细胞（PBMC）,将MSC与混合淋巴细胞反应体系共培养。二乙酰羧基荧光素一琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记反应细胞群结合流式细胞术特异性分析反应细胞各细胞亚群。结果 与MSC共培养后,SLE患者外周血T细胞增殖受抑制,各T细胞亚群比例降低,其中Th2亚群明显降低（P〈0．05）。结论 MSC对SLE患者体内Th1／Th2失衡状态有一定的纠正作用。     

仿刺参糖胺聚糖对骨髓抑制贫血小鼠外周血及骨髓细胞周期的影响△

目的：观察仿刺参糖胺聚糖(HGAG)对环磷酰胺诱导的骨髓抑制贫血小鼠外周血及骨髓细胞周期的影响。方法：将40只雄性昆明种小鼠随机分为正常组、模型组、HGAG治疗组(1,5,15mg.kg_-1),每组8只。除正常组外其余各组腹腔注射环磷酰胺100mg.kg_-1制备贫血小鼠模型,每天1次连续3天,并于造模当日起,HGAG给药组腹腔注射不同浓度的HGAG,正常组和模型组腹腔注射生理盐水,每天1次连续7天。用全自动血细胞分析仪、白细胞计数法、流式细胞术分别检测HGAG对贫血小鼠外周血、骨髓有核细胞数和骨髓细胞周期的影响。结果：HGAG低、中、高剂量组能显著升高外周血WBC和HGB,且高剂量组还能明显升高外周血RBC和PLT。HGAG三个剂量组能显著增加小鼠骨髓有核细胞数和脾脏指数,而且能够促进骨髓G₀/G₁期细胞向S期及S期细胞向G₂/M期细胞的转化,显著升高增殖指数。结论：HGAG能够解除细胞周期阻滞,促进骨髓造血细胞的增殖,增加外周血细胞、骨髓有核细胞的数量和升高脾脏指数,从而促进骨髓抑制贫血小鼠造血功能的恢复     

肝细胞生长因子对兔骨髓基质细胞生物学特性的影响

目的　观察腺病毒携带肝细胞生长因子cDNA(adHGF)转染兔骨髓基质细胞 (MSC)后的主要生物学特性。方法　抽取成年雄性新西兰白兔骨髓 ,密度梯度离心获得MSC。取兔膝关节软骨 ,体外培养软骨细胞至第 3代。adHGF转染第 5代MSC ,噻唑蓝 (MTT)法检测细胞增生活力 ,阿尔新蓝法检测细胞培养上清液中氨基己糖多糖 (GAG)含量。酶联免疫吸附实验 (ELISA)检测adHGF转染MSC后HGF的表达。免疫组织化学染色及反转录 聚合酶链反应 (RT PCR)检测Ⅰ、Ⅱ型胶原表达。结果　原代MSC为短梭形、簇状生长 ,传代细胞呈长梭形、旋涡样生长。adHGF转染前后细胞增生状态差异无显著性。MSC转染后GAG含量增加。免疫组织化学染色MSC转染前后I型胶原阳性 ,转染后Ⅱ型胶原弱阳性。转染后HGF表达量在转染 1周内最高 ,达 12 0 5ng/ml,并可持续至 6周。RT PCR表明MSC在adHGF转染前后均表达I型胶原 ,转染后微量表达Ⅱ型胶原。结论　MSC在体外培养过程中的自然转归是趋向于成骨。MSC不仅是HGF的源细胞 ,而且可作为靶细胞接受外源目的基因的转染并有效表达     

人骨髓间充质干细胞对再生障碍性贫血患者T细胞活化的影响

目的探讨人骨髓间充质千细胞在体外对再生障碍性贫血患者T细胞活化的影响。方法从人骨髓分离培养间充质干细胞，用尼龙棉柱分离T淋巴细胞，分别以不同数量间充质干细胞加入到植物血凝素刺激的再生障碍性贫血患者T淋巴细胞活化体系中，通过流式细胞仪获取数据，计算CD3^＋CD25^＋和CD3^＋CD38^＋T细胞的表达率。结果当间充质干细胞为1×10^4／孔时，与单独培养的再生障碍性贫血患者T淋巴细胞（对照组）相比，间充质干细胞对再生障碍性贫血患者T淋巴细胞CD25及CD38的表达呈明显抑制作用，差异有统计学意义（P〈0．01）。当间充质干细胞为1×10^3／孔时，与对照组相比无统计学意义。结论间充质干细胞在体外抑制再生障碍性贫血患者T细胞的活化，且这种抑制作用具有数量依赖性。     

Evaluation of chitosan salts as non-viral gene vectors in CHO-K1 cells

The aim of this study was to investigate chitosan/DNA complexes formulated with various chitosan salts (CS) including chitosan hydrochloride (CHy), chitosan lactate (CLa), chitosan acetate (CAc), chitosan aspartate (CAs) and chitosan glutamate (CGl). They were assesed for their DNA complexing ability, transfection efficiency in CHO-K1 (Chinese hamster ovary) cells and their effect on cell viability. CHy, CLa, CAc, CAs and CGl, MW 45kDa formed a complex with pcDNA3-CMV-Luc at various N/P ratios. CGl/DNA complexes were formulated with various chitosan molecular weights (20, 45, 200 and 460kDa). The CS/DNA complexes were characterized by agarose gel electrophoresis and investigated for their transfection efficiency in CHO-K1 cells. The cytotoxicity of the complexes was determined by the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) assay in CHO-K1 cells. Gel electrophoresis illustrated that complete complexes formed at N/P ratios above 2 in all CS of MW 45kDa. The transfection efficiency of CS/DNA complexes was dependent on the salt form and MW of chitosan, and the N/P ratio of CS/DNA complexes. Of different CS, the maximum transfection efficiency was found in different N/P ratios. CHy/DNA, CLa/DNA, CAc/DNA, CAs/DNA and CGl/DNA complexes showed maximum transfection efficiencies at N/P ratios of 12, 12, 8, 6 and 6, respectively. Cytotoxicity results showed that all CS/DNA complexes had low cytotoxicity. This study suggests CS have the potential to be used as safe gene delivery vectors.     

壳聚糖-明胶-磷酸三钙组织工程支架用于兔颅骨缺损的修复

目的探索壳聚糖-明胶-磷酸三钙作为骨组织工程支架用于骨缺损修复的可行性。方法采用二次冻干技术制备孔径200-400μmCS-Gel/TCP三维立体支架材料;新西兰兔12只随机分为两组,将兔骨髓基质细胞(MSC)进行体外培养、扩增、诱导为骨髓基质成骨细胞(MSO),并制备直径为15mm的颅骨全层圆形骨缺损。实验组与颅骨缺损处植入等大的MSO-支架复合体,对照组植入单纯支架,分别4、8周取材,组织切片与X线观察骨形成情况。结果MSO-支架复合体植入骨缺损区后,具有良好的骨修复效果,明显优于对照组。结论壳聚糖-明胶-磷酸三钙海绵状复合体是一种具有潜在临床应用价值的骨组织工程的支架材料组织工程。     

Nitric oxide enhances Oct-4 expression in bone marrow stem cells and promotes endothelial differentiation

This study was designed to investigate the role of nitric oxide (NO) in bone marrow stem cells and their differentiation into endothelial cells in vitro. Adult mouse bone marrow multipotent progenitor cells (MAPCs) were used as the source of stem cells. Oct-4 expression (both mRNA and protein) was significantly increased by up to 68.0% in MAPCs when incubated with NO donors DETA-NONOate or sodium nitroprusside (SNP) in a concentration-dependant manner (n=3, P<0.05). However, the cell proliferation was dramatically decreased by over 3-folds when treated with DETA-NONOate or SNP for 48 h (n=3, P<0.05). When MAPCs were exposed to DETA-NONOate (100 microM) for the first 48 h during differentiation, the expression (both mRNA and protein) of vWF was significantly increased at day 14 in the differentiating cells. The effects of DETA-NONOate or SNP on cell proliferation, Oct-4 expression and endothelial differentiation of MAPCs were not affected by the guanylyl cyclase inhibitor 1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-one or cGMP analog 8-Br-cGMP. These data indicate that NO may regulate both the pluripotency and differentiation of MAPCs via a cGMP-independent mechanism.