新生大鼠心肌细胞内Ca2+的空间分布及调控的离体研究

目的 观察心肌细胞胞浆和核Ca^2 的空间分布和钙变化的形式。方法 以Fluo-4/AM荧乐指示剂负载培养的心肌细胞，应用激光共聚焦扫描显微镜观察心肌细胞的钙信号形式及胞浆和核内[Ca^2 ]i的变化。结果 心肌细胞核的荧光强度明显高于细胞浆，并存在小幅度的钙震荡，AngⅡ使钙震荡幅度增大，其作用可被NO所完全抑制。Ca^2 -ATPase抑制剂Thapsigargin(10^-6mol/L)、钙释放通道Ryanodine受体2激动剂咖啡因（5mmol/L）和大剂量L－型Ca^2 通道阻滞剂Vreapamil(500μmol/L）使心肌细胞胞浆内和核膜上出现钙闪烁现象。EGTA道德螯合心肌细胞内的游离Ca^2 ，继之螯合钙库Ca^2 ，最后仅显示心肌细胞核膜腔Ca^2 库影。L－型Ca^2 通道阻滞剂Verapamil引起心肌细胞自发的钙波传递消失，核和胞浆内荧光强度一过性升高后下降。结论 心肌细胞内存在钙闪烁、钙波以及钙震荡等多种钙信号形式，胞浆和核Ca^2 库对Ca^2 的摄取和释放在细胞功能的调节中起重要作用。     

新生大鼠心肌细胞内Ca2+的空间分布及调控的离体研究

采用激光扫描共聚焦显微镜、荧光分光光度计和荧光显微镜,观察培养的大鼠心肌细胞和离体细胞核的Ca2+信号变化.结果:培养的心肌细胞内Ca2+荧光分布不均匀,即核的荧光强度显著高于胞浆;β-受体激动剂异丙肾上腺素(10-6mol/L)使核钙浓度[(Ca2+)n]增加程度显著大于胞浆钙浓度[(Ca2+)c],β-受体阻滞剂心得安(10-3mol/L)浓度显著降低细胞核/胞浆游离钙梯度;P物质(10-6mol/L)作用下,[(Ca2+)n]增加2.17倍,而[(Ca2+)c]仅增加91.45%(P<0.05),[(Ca2+)n]/[(Ca2+)c]大幅度上升.心肌细胞经钙泵抑制剂thapsigargin和EGTA刺激后,可见核膜腔存在钙库.正常心肌细胞存在小幅度的钙震荡,分别加入去甲肾上腺素(10-5mol/L)、AngⅡ(10-6mol/L)和ATP(3×10-3mol/L),均使心肌细胞胞浆Ca2+和核Ca2+震荡幅度明显升高(P<0.01),NO-供体硝普钠(10-5mol/L)和KCI(20mmol/L)使钙的周期性震荡消失.IP3和Ryanodine分别使核Ca2+短暂升高1.68倍和1.93倍(P<0.001),而Thapsigargin预处理心肌细胞核,均能显著的阻断IP3和Ryanodine的致核Ca2+升高作用(P<0.05),荧光染色观察可见IP3受体染色主要位于核内膜,而钙泵和ryanodine受体染色主要位于核外膜.结论:心肌细胞核是细胞内的钙库之一,心肌细胞核也存在Ca2+震荡,并受多种因素影响.心肌细胞核膜上存在Ca2+-ATPase、RyR和IP3受体等核Ca2+摄取和释放系统.核Ca2+释放的前提条件是首先存在核Ca2+摄取.     

虎杖甙对内毒素刺激的单个巨噬细胞内游离钙动态变化的影响

用荧光染料Indo-1标记小鼠腹腔巨噬细胞内游离钙,在粘附式细胞仪检测下观察细胞内游离钙的动态变化，在大肠杆菌O55：B5内毒素刺激下细胞内游离钙迅速升高，于第400s达峰值．经虎杖甙处理的巨噬细胞加入内毒素后，胞质游离钙无明显增高．因细胞浴于无钙环境，故胞内游离钙升高不是由于细胞外的Ca2+进入细胞，而是由于内毒素影响胞内钙库调节功能．虎杖甙可能保护胞内钙库中胞质钙的某种调节机制，从而避免胞质游离钙升高．     

辣椒素通过钙信号抑制感觉神经元的电压门控性钙离子通道

目的 研究辣椒素对大鼠背根神经节神经元的电压门控性钙离子通道的抑制效应及其信号机制.方法 在急性分离的大鼠背根神经节(DRG)神经元上,应用全细胞膜片钳技术记录电压激活性钙离子通道电流以及辣椒素诱导的电流,应用钙离子成像技术检测Ca2+浓度的变化.结果 辣椒素能够抑制大鼠DRG神经元的电压激活性钙离子通道电流.细胞外钾离子浓度显著升高引起细胞去极化并打开膜上电压门控性钙离子通道引起胞外Ca2+内流,辣椒素只在引起胞内Ca2+浓度显著升高的情况下才能抑制高钾诱导的电压门控性Ca2+内流.用咖啡因耗竭细胞内Ryanodine敏感性钙库以后,辣椒素引发的胞内钙浓度升高的效应被显著抑制,说明辣椒素可诱导胞内Ryanodine敏感性钙库释放Ca2+.结论 在辣椒素敏感性的大鼠DRG神经元中,辣椒索通过胞内钙信号抑制电压门控性钙离子通道.Ca2+信号部分来源于Ryanodine敏感性钙库.     

核钙信号调控的研究进展

细胞核内游离钙在调控核内功能上起重要作用,如调控蛋白跨核膜转运、基因转录、DNA合成、DNA修复以及有丝分裂等一系列细胞生理过程[1].近期随着生物学技术的发展,人们认识到,细胞核具有独立的钙运输转导系统,而不依赖于胞浆钙离子浓度的改变对其发挥调控作用,并且发现核钙运输系统动力学稳态失衡可诱发多种心血管疾病,如(如心肌细胞肥大、凋亡、坏死、心肌电生理的紊乱)[2].因此,核钙信号的研究将逐渐成为心血管疾病医学领域的研究热点.     

神经肽Y诱导大鼠心肌细胞肥大的钙信号机制

目的探讨钙依赖的信号途径在神经肽Y (NPY)诱导心肌肥大中的作用.方法NPY刺激乳鼠心肌细胞,加入钙调神经磷酸酶(CaN)抑制剂环胞素A(CsA)进行干预(5 μg/mL),观察心肌细胞蛋白合成速率(3H-Leu掺入量)、早期肥大反应基因(c-jun mRNA)表达以及胞浆和核内[Ca2+]i的变化.结果经100 nmol/L NPY刺激24 h后,心肌细胞3H-Leu掺入量、c-jun mRNA表达以及胞浆和核内[Ca2+]i均明显高于不加药对照组(P<0.05,P<0.01);而CsA干预后的心肌细胞3H-Leu掺入量和c-jun mRNA表达与对照组比较则无显著差别.结论Ca2+/CaM依赖的CaN信号途径在NPY诱导心肌细胞肥大中起重要作用;NPY刺激细胞内[Ca2+]i增加,可能是活化CaN信号途径的始动环节.     

神经肽Y经Ca2+/CaM依赖的钙调神经磷酸酶途径诱导心肌细胞肥大

目的 观察神经肽Y(NPY)诱导心肌细胞肥大效应,及Ca2+/CaM依赖的钙调神经磷酸酶(CaN)途径在其中起的作用.方法 用NPY(10、100nmol)刺激心肌细胞,用环胞索A(CsA)特异性抑制CaN活性.测定心肌细胞蛋白合成速率(3H-Leu掺入量)、CaN-蛋白表达、c-jun mRNA表达、CaN酶活性、细胞内游离钙含量.结果 (1)在100nmol NPY作用下,心肌细胞3H-Leu掺入量及c-jun mRNA表达量均较对照组显著增高(P<0.05,P<0.001).NPY+CsA组和对照组相比无显著差别.(2)在100 nmol NPY作用下,NPY组心肌细胞内CaN酶比活力、CaN-α表达、胞浆及核内钙含量较对照组显著增高(P<0.05,P<0.05,P<0.001,P<0.001).结论 NPY可刺激心肌细胞肥大,CaN信号途径在其中起重要作用.     

卡托普利对肾血管性高血压大鼠血小板及心肌细胞内游离钙含量的影响

钙离子（Ca2+）是细胞内兴奋-收缩／分泌偶联的关键因子，血管平滑肌细胞内Ca2+是决定血管平滑肌反应性和血管张力的主要因素，也是高血压形成的最后共同途径［’］。有高血压家族遗传史的正常血压者及高血压前期大鼠的淋巴细胞和血小板以及平滑肌细胞胞浆游离钙高于对照组，且与血压呈正相关。ACEI降压机制较复杂，是否影响心肌细胞内钙未见报道，本文观察卡托普利（C地叫d）对二肾一夹型肾血管性高血压大鼠（ZKIC－RHR）基础状态下血小板胞浆游离钙浓度（［CaZ”」i）及心肌内钙含量的影响。1材料和方法1．12KIC．RHR的建立选用…     

大鼠心肌缺血再灌注损伤时细胞核游离钙浓度的变化

目的探讨大鼠心肌缺血再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury, IRI)时细胞核游离钙浓度的改变.方法健康雄性Wistar大鼠随机分为IRI组和假手术组,结扎冠状动脉左主干制备IRI模型,双波长荧光分光光度法测定分离的心肌细胞核游离钙浓度[Ca2 ]n.结果核外ATP为10 mmol/L时,假手术组和IRI心肌[Ca2 ]n均随核外钙浓度增加而增加;当核外游离钙为0.1 μmol/L时,两组心肌[Ca2 ]n无差别(P>0.05);当核外游离钙为1 μmol/L和10 μmol/L时,IRI组[Ca2 ]n明显高于假手术组(P<0.01).在核外无ATP时,两组心肌[Ca2 ]n在核外无钙时无差别(P>0.05),核外游离钙在0.4～1.6 μmol/L时两组心肌[Ca2 ]n均较在不含钙缓冲液中增加,但假手术组心肌[Ca2 ]n在此范围内相对稳定,而IRI组心肌[Ca2 ]n在核外游离钙浓度为1.6 μmol/L时则明显增加(P<0.05).结论在核外有或无ATP时过高的核外钙浓度均引起IRI组心肌细胞核游离钙的急剧增加.     

K物质对大鼠心肌细胞收缩的影响及其信号传导通路的探讨

目的　研究K物质引起大鼠心肌细胞收缩的信号传导通路。方法　应用钙离子荧光指示剂Fluo 3AM负载原代培养的大鼠心肌细胞 ,通过流式细胞仪检测心肌细胞内游离钙离子浓度 ( [Ca2 + ]i)变化 ;分别应用磷脂酶C抑制剂 新霉素 ,三磷酸肌醇受体拮抗剂 肝素阻断肌醇磷脂 钙信号系统 ,观察二者对K物质诱导的 [Ca2 + ]i变化的影响。结果　SK( 1.78× 10 -5mol/L)能升高 [Ca2 + ]i,新霉素、肝素均可阻断SK诱导的 [Ca2 + ]i升高的效应。结论　SK可升高心肌细胞[Ca2 + ]i,其作用与肌醇磷脂 钙信号系统有关     

缺氧对心肌细胞内游离钙浓度和细胞膜Ca2+-ATPase表达的影响及薯蓣皂甙的干预作用

目的探讨缺氧对心肌细胞内游离钙离子浓度和细胞质膜Ca2 -ATPase表达的影响及薯蓣皂甙的干预作用.方法原代培养大鼠心肌细胞,制备心肌细胞缺氧模型,随机分为正常对照组、缺氧损伤组、左旋氨氯地平组、薯蓣皂甙组.分别测定各组心肌细胞内游离钙离子的浓度(FURA2/AM荧光探针法)和细胞质膜上Ca2 -ATPase 表达水平(RT-PCR法).结果缺氧损伤组较对照组心肌细胞内游离钙离子浓度显著上升(P<0.01),细胞质膜上的钙泵的表达明显减弱(P<0.05),经薯蓣皂甙及左旋氨氯地平干预后细胞内游离钙浓度均降低(P均<0.01),细胞膜上钙泵的表达均明显增强(P均<0.01).结论细胞内钙超负荷是缺氧损伤心肌细胞的主要机制之一,薯蓣皂甙通过增加细胞膜上钙泵的表达有效减轻心肌细胞内的钙超载,对缺氧心肌具有保护作用.     

5-羟色胺对心肌细胞内游离钙浓度的影响

目的　观察 5 -羟色胺 (5 - HT)对新生大鼠心肌细胞内游离 Ca2 + 浓度的影响 ,并探讨其作用机制 .方法　培养 SD大鼠 (1～ 3d)心肌细胞 ,应用特异性 Ca2 +荧光指示剂 Fluo- 3/AM负载细胞 ,激光共聚焦显微镜检测游离 Ca2 + 浓度 .结果　 5 - HT在 10 - 6 ,10 - 5,10 - 4 m ol· L- 1 时均可升高心肌游离Ca2 + 浓度 ,且随剂量增加而加强 ;二氢吡啶类钙通道阻断剂lacidipine可部分拮抗 5 - HT的作用 ;心肌肌浆网内钙释放通道 ryanodine受体调节剂 ryanodine,在 10 - 5mol· L- 1 时也可部分拮抗 5 - HT的作用 ;用 EGTA络合细胞外液中游离Ca2 + ,5 - HT升高心肌游离 Ca2 + 作用明显减弱 ;此外 ,5 - HT二型受体 (5 - HT2 R)阻断剂赛庚定具有显著抑制 5 - HT升高心肌游离 Ca2 + 的作用 .结论　 5 - HT具有升高心肌游离 Ca2 + 的作用 ,其机制可能与细胞外 Ca2 +经 5 - HT2 R或二氢吡啶类钙通道进入细胞以及肌浆网内钙释放有关     

KCl和Iso对培养乳鼠单个心肌细胞游离钙浓度影响的研究

目的　测定培养大鼠乳鼠心肌细胞内游离钙离子浓度 ([Ca2 + ]i) ,观察KCl、异丙肾上腺素 (Iso)对心肌细胞 [Ca2 + ]i的影响 ,初步探讨其作用机制。方法　采用Fura - 2作为细胞内钙离子的荧光探针负载培养的心肌细胞 ,结合阳离子测定系统检测心肌细胞 [Ca2 + ]i。结果　静息时 ,心肌细胞 [Ca2 + ]i为 83 3±11 6 7nmol/L ,30mmol/L、 5 0mmol/L、 70mmol/LKCl使心肌细胞 [Ca2 + ]i升高 ,且呈剂量依赖性 ;同时10 μmol/L异丙肾上腺素使心肌细胞 [Ca2 + ]i升高。结论　Fura - 2 /AM结合阳离子测定系统可以精确的反映细胞内游离钙离子浓度 ,KCl、异丙肾上腺素升高心肌细胞 [Ca2 + ]i的作用机制不同。     

虎杖甙对内毒素刺激的单个巨噬细胞内游离钙动态变化的影响

用荧光染料Ｉｎｄｏ－１标记小鼠腹腔巨噬细胞内游离钙，在粘附式细胞仪检测下观察细胞内游离钙的动态变化。在大肠杆菌Ｏ５５：Ｂ５内毒素刺激下细胞内游离钙迅速升高，于第４００ｓ达峰值。经虎杖甙 处理的巨噬细胞加入内毒素后，胞质游离钱无明显增高。因细胞浴于无钙环境，故胞内游离钙升高不是由于细胞外的Ｃａ＾２＋进入细胞，而是由于内毒素影响胞内钱库调节功能。虎杖甙可能保护钙库中细胞质钙的某种调节机制，从而避免胞质     

人参皂甙Rg1对缺氧豚鼠心肌细胞游离钙浓度降低作用的研究

目的探讨人参皂甙(ginsentosides,Gin)单体Rgl及维拉帕米(verapamil,Ver)对豚鼠心肌细胞内游离钙浓度([Ca2+]i)变化的影响.方法采用离体豚鼠心脏Langendorff法灌注,胶原酶Ⅰ型分离心肌细胞,用荧光指示剂方法(Fura-2/AM)标记心肌([Ca2+]i)变化.将心肌细胞悬液分为3组对照组、Rgl组和Ver组.观察缺氧后心肌[Ca2+]i的变化.结果(1)正常氧状态心肌[Ca2+]i均值为(125.4±10.3)nmol/L(n=20).(2)缺氧状态下,心肌[Ca2+]i增加与缺氧时间(程度)直线相关,相关系数r为0.98左右.(3)Rgl对缺氧后心肌[Ca2+]i增加明显延缓.结论Rgl在缺氧条件下,使心肌[Ca2+]i明显下降,从而阻止心肌细胞内钙超载,其作用与Ver相似,我们认为Rgl具有心肌细胞的保护作用.     

神经肽Y对大鼠心肌细胞胞浆及核内游离钙浓度的影响

目的:观察不同时限内神经肽Y(NPY)对心肌细胞胞浆及核内游离钙浓度的作用。方法:用Fluo3AM荧光标记细胞内游离钙离子,用NPY(100nmol/L)刺激WISTAR乳鼠心肌细胞,检测0min、5min、10min及24h内心肌细胞胞浆及核内钙离子浓度变化。结果:加入100nmol/LNPY即刻至10min内,心肌细胞胞浆及核内钙含量差异均无显著性。经100nmol/LNPY刺激24h后,心肌细胞胞浆钙含量(16.81±2.1)明显高于对照组(7.45±1.96)(P<0.01),核内钙含量(30.65±4.06)也显著高于对照组(15.64±2.16)(P<0.01)。结论:较长时间的NPY刺激可导致心肌细胞胞浆及核内钙浓度增加。     

胞内游离钙浓度测定平台的建立

目的：建立一种简单有效的细胞内游离钙浓度测定平台。方法：用Fura-2作为荧光指示剂标记细胞内Ca2＋,在倒置荧光显微镜下交替检测340nm和380nm激发的荧光强度,计算F340/F380代表的Ca2＋相对浓度,再校正为标准浓度。结果：给予细胞刺激（如10mM咖啡因）,F340/F380迅速增高,表明细胞内游离钙浓度迅速升高。对于快速变化的胞内Ca2＋信号,系统反应灵敏、迅速,能很好地捕捉相关钙浓度变化。结论：由此建立起了一种简单有效的细胞内游离钙浓度测定平台,并应用于实际工作。这一平台在平滑肌细胞及心肌细胞游离钙浓度测定中都得到了充分的应用,平台建设中的第一手资料具有重要参考价值。     

L-型钙通道拮抗剂治疗早产机制的研究

目的L-钙拮抗剂心痛定治疗早产机制的初探.方法原代培养孕妇子宫平滑肌细胞.Furo-3-AM钙荧光探针孵育.根据加入催产素和心痛定的时间的不同,细胞分为6组.激光共聚焦仪测钙.结果加入催产素后胞浆钙荧光强度上升,出现明显的钙波.和对照组进行t检验,两组有非常显著差异.在钙波形成前后分别加入心痛定,前者可抑制部分细胞的钙波形成,使部分细胞的钙波幅度降低,而后者不影响钙波.对两组的钙荧光强度进行t检验,P＜0.05,两组有显著差异.结论平滑肌收缩和胞浆钙量呈正相关;钙波可能是编码孕妇子宫平滑肌收缩信号的一种方式;心痛定可部分降低钙量,但不能完全阻断钙信号,该药治疗早产有局限性.     

慢性心衰大鼠心肌细胞内异常的钙通道研究

目的研究慢性心衰大鼠心肌细胞内异常的钙通道。方法将雄性SD大鼠被随机分为手术组和假手术组,运用激光扫描共聚焦显微镜、Western-blot等方法研究胞浆内咖啡因诱导钙瞬变及钙释放通道RyR2和其调节蛋白FKBP12.6表达的变化。结果慢性心衰大鼠心肌细胞内钙瞬变（ΔF/F0=11.9±0.9）显著低于对照组大鼠心肌细胞内钙瞬变（ΔF/F0=33.2±1.6,P〈0.05）;慢性心衰大鼠心肌细胞内FKBP12.6的表达较对照组下调。结论 FKBP12.6表达下调所致Ca2＋泄漏是导致心衰的原因之一。     

激活心肌细胞内钙对心肌细胞c-fos蛋白表达的影响

目的　探讨钙内流及钙释放对心肌细胞 c- fos蛋白表达有何影响 ,为深入了解心肌细胞重塑的分子机制提供实验依据。方法　应用血管紧张素 ( Ang ,10 - 7m ol/ L )刺激原代培养的大鼠心肌细胞钙内流 ,雷尼丁 ( RY,10 - 7m ol/ L)刺激心肌细胞内钙释放。免疫组织化学方法检测不同刺激时相的心肌细胞 c- fos蛋白表达部位。免疫印迹杂交检测不同刺激时相的心肌细胞 c- fos蛋白半定量。结果　 Ang 与 RY均可刺激心肌细胞〔 Ca2 +〕i 的增加。免疫组化结果显示 ,Ang 刺激 10分钟时 c- fos蛋白主要表达于胞浆 ,30分钟后主要表达于胞核 ;RY刺激心肌细胞 5分钟时 c- fos蛋白主要在胞浆表达 ,2 0分钟时主要表达于胞核 ,分别完成核转位。免疫印迹杂交结果显示 ,Ang 及 RY刺激 2小时时 c- fos蛋白明显表达 ,2 4小时时下降 ,2、3、5天呈逐渐增加趋势 ,各时相点与 2 4小时时比较差异显著 ( P<0 .0 5或 <0 .0 1)。结论　 Ang 和 RY刺激心肌细胞均可引起 c- fos蛋白表达 ,其方式基本一致 ,但 RY引起核转位早于 Ang ;同时 Ang 与 RY均可引起心肌细胞〔 Ca2 +〕i 浓度的增加。提示 c- fos蛋白表达与细胞内钙的变化有关 ,而与钙的来源无关