新生大鼠心肌细胞内Ca2+的空间分布及调控的离体研究

采用激光扫描共聚焦显微镜、荧光分光光度计和荧光显微镜,观察培养的大鼠心肌细胞和离体细胞核的Ca2+信号变化.结果:培养的心肌细胞内Ca2+荧光分布不均匀,即核的荧光强度显著高于胞浆;β-受体激动剂异丙肾上腺素(10-6mol/L)使核钙浓度[(Ca2+)n]增加程度显著大于胞浆钙浓度[(Ca2+)c],β-受体阻滞剂心得安(10-3mol/L)浓度显著降低细胞核/胞浆游离钙梯度;P物质(10-6mol/L)作用下,[(Ca2+)n]增加2.17倍,而[(Ca2+)c]仅增加91.45%(P<0.05),[(Ca2+)n]/[(Ca2+)c]大幅度上升.心肌细胞经钙泵抑制剂thapsigargin和EGTA刺激后,可见核膜腔存在钙库.正常心肌细胞存在小幅度的钙震荡,分别加入去甲肾上腺素(10-5mol/L)、AngⅡ(10-6mol/L)和ATP(3×10-3mol/L),均使心肌细胞胞浆Ca2+和核Ca2+震荡幅度明显升高(P<0.01),NO-供体硝普钠(10-5mol/L)和KCI(20mmol/L)使钙的周期性震荡消失.IP3和Ryanodine分别使核Ca2+短暂升高1.68倍和1.93倍(P<0.001),而Thapsigargin预处理心肌细胞核,均能显著的阻断IP3和Ryanodine的致核Ca2+升高作用(P<0.05),荧光染色观察可见IP3受体染色主要位于核内膜,而钙泵和ryanodine受体染色主要位于核外膜.结论:心肌细胞核是细胞内的钙库之一,心肌细胞核也存在Ca2+震荡,并受多种因素影响.心肌细胞核膜上存在Ca2+-ATPase、RyR和IP3受体等核Ca2+摄取和释放系统.核Ca2+释放的前提条件是首先存在核Ca2+摄取.     

新生大鼠心肌细胞内Ca2+的空间分布及调控的离体研究

目的 观察心肌细胞胞浆和核Ca^2 的空间分布和钙变化的形式。方法 以Fluo-4/AM荧乐指示剂负载培养的心肌细胞，应用激光共聚焦扫描显微镜观察心肌细胞的钙信号形式及胞浆和核内[Ca^2 ]i的变化。结果 心肌细胞核的荧光强度明显高于细胞浆，并存在小幅度的钙震荡，AngⅡ使钙震荡幅度增大，其作用可被NO所完全抑制。Ca^2 -ATPase抑制剂Thapsigargin(10^-6mol/L)、钙释放通道Ryanodine受体2激动剂咖啡因（5mmol/L）和大剂量L－型Ca^2 通道阻滞剂Vreapamil(500μmol/L）使心肌细胞胞浆内和核膜上出现钙闪烁现象。EGTA道德螯合心肌细胞内的游离Ca^2 ，继之螯合钙库Ca^2 ，最后仅显示心肌细胞核膜腔Ca^2 库影。L－型Ca^2 通道阻滞剂Verapamil引起心肌细胞自发的钙波传递消失，核和胞浆内荧光强度一过性升高后下降。结论 心肌细胞内存在钙闪烁、钙波以及钙震荡等多种钙信号形式，胞浆和核Ca^2 库对Ca^2 的摄取和释放在细胞功能的调节中起重要作用。     

慢性冬眠心肌细胞内Ca2+及Mg2+含量测定

目的探讨慢性冬眠心肌细胞内Ca2+、Mg2+含量的变化。方法使22只犬冠状动脉左前降支缩窄50％,继续喂养1个月,利用三电极直流等离子体原子发射光电直读光谱仪测量慢性冬眠心肌细胞内Ca2+、Mg2+含量。结果①成功地建立了慢性心肌冬眠的动物模型;②10只犬完成所有实验步骤,存活(45.2±9.59)d,左前降支内径缩窄平均48％;③缺血心肌细胞内Ca2+含量明显高于正常心肌[(13.48±4.26)vs(9.47±2.32),P＜0.05],而Mg2+则明显低于正常[(19.37±5.62)vs(27.18±8.77),P＜0.05]。结论慢性冬眠心肌存在细胞内Ca2+超载,提示细胞内Ca2+超载可能是慢性心肌冬眠的发生机制之一。     

急性分离大鼠心室肌细胞的Ca2+电流和细胞内Ca2+浓度

目的 在急性分离SD大鼠心室肌细胞上,检测Ca2 电流(Ica)和Ca2 浓度[Ca2 ].的变化.方法 改良Langendroff法,用含胶原酶Ⅰ(1750 U/mL)和蛋白酶XⅣ(0.28 mg/mL)的无Ca2 台氏液经大鼠主动脉循环灌流法,急性分离大鼠心室肌细胞;采用全细胞膜片钳技术记录心室肌细胞的Ica,动态细胞荧光成像技术检测心室肌细胞[Ca2 ]i的变化.结果 在20 rmin内新鲜分离大鼠心室肌细胞,全细胞膜片钳技术可记录电刺激引起心室肌细胞Ica,1μmol/L异丙肾上腺素可显著增加Ica;并观察到心室肌细胞[Caa2 ]i以及电刺激增强[Ca2 ]i的效应.结论 大鼠心室肌细胞急性分离方法简便实用,所分离的心室肌细胞形态和功能正常,适用全细胞膜片钳和动态细胞荧光成像技术检测实验.     

血管紧张素Ⅱ对离体人胰岛细胞内游离Ca2+及cAMP的影响

目的 探讨血管紧张素Ⅱ对离体人胰岛细胞内游离Ca2 及cAMP的影响,通过体外实验了解血管紧张素Ⅱ影响胰岛细胞分泌功能的相关分子机制.方法 以血管紧张素Ⅱ作用于分离纯化的人胰岛细胞,检测细胞内游离Ca2 及cAMP的波动情况,以胰岛灌流实验,绘制胰岛素动态分泌曲线.结果 血管紧张素Ⅱ时胰岛β细胞分泌功能的影响呈先升后降双向性,血管紧张素Ⅱ使细胞内游离Ca2 浓度升高,细胞内cAMP的浓度随着血管紧张素Ⅱ浓度的升高而下降.以上作用可被血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂Losartan所逆转.结论 血管紧张素Ⅱ通过与胰岛β细胞表面血管紧张素Ⅱ受体结合,导致细胞内游离Ca2 及cAMP变化,从而影响胰岛素分泌.     

心肌细胞肌浆网Ca2+-ATPase与心肌功能的调控

心肌的损伤及心功能的异常都伴随着Ca2+代谢的严重障碍,而心肌细胞肌浆网(Sarcoplasmic reticulum,SR)及其Ca2+-ATP酶(Ca2+-ATPaSe)是调节钙代谢最重要的物质,了解SR、Ca2+-ATPase的结构、功能及其编码基因的表达与心肌功能的关系,对调控心功能具有重要意义.     

乙醇对大鼠大脑皮层和纹状体细胞内Ca2+的影响

目的 观察乙醇对大鼠大脑皮层和纹状体细胞内Ca2+的影响.方法 雄性Wistar大鼠30只,随机分为对照组,乙醇灌胃后0.5h组,1.5h组,3h组和5h组(各6只).实验组用60%(V/V)白酒一次性灌胃(灌胃体积为10ml/kg),对照组用等体积生理盐水灌胃.在各时间点急性分离大脑皮层和纹状体细胞,用Ca2+敏感荧光指示剂Fluo-3/AM 负载,共聚焦显微镜测定细胞内游离Ca2+浓度.结果 染毒后大鼠大脑皮层和纹状体细胞内游离Ca2+荧光强度均降低(与对照组比较),其中,1.5h组降低有显著差异(P<0.01,P<0.05).结论 乙醇产生神经行为毒性可能与大脑皮层和纹状体细胞内Ca2+浓度降低有关.     

缺血预处理及复合浅低温晶体停搏液保护下未成熟心肌细胞内Ca2+的分布

目的观察缺血预处理(IP)复合32℃浅低温及晶体停搏液保护对缺血再灌注损伤未成熟心肌细胞内Ca2+分布的影响.方法应用Langendorff离体心脏灌注模型,IP采用2次5 min缺血、5 min再灌注,实验分为IP+32℃浅低温组和单纯32℃浅低温组.心脏灌注St.ThomasⅡ停搏液,缺血30 min,37℃再灌注30 min.进行血流动力学测定、焦锑酸钾沉淀Ca2+染色及心肌细胞体积密度(Vvi)测定.结果再灌注30min,IP组左心室发展压(LVDP)、左心室压力最大上升及下降速率(+dp/dtmax、-dp/dtmax)恢复率明显高于单纯32℃浅低温组(P＜0.05),IP组受损严重心肌细胞Vvi显著小于对照组(P＜0.05)再灌注后,细胞核Ca2+沉积随细胞损伤程度加重而增加,其中32℃浅低温组细胞核Ca2+沉积较为明显.结论缺血再灌注期间,未成熟心肌细胞内Ca2+分布异常与超微结构的改变有密切关系.IP+32℃浅低温复合晶体停搏液对未成熟心肌有较好的心肌保护作用.     

兔心肌挫伤心功能障碍与心肌细胞内Ca2+和线粒体ATP酶的变化

目的：探讨心肌细胞内游离钙([Ca^2 ]i)和心肌ATP酶变化在心肌挫伤（MC）后心功能障碍发生机制中的意义。方法：随机选取兔36只，分为6组：正常对照、伤后2、4、8、12、24h，每组6只。经右颈总动脉插管至左心室测左室压力。采用BIM-II型生物撞击机致成MC模型。在上述时相点测定左室压力，并测定心肌细胞内[Ca^2 ]i和心肌匀浆组织及线粒体ATP酶活力。结果：心脏收缩/舒张功能受到损害，心肌细胞内[Ca^2 ]i升高，心肌匀浆组织及线粒体ATP酶下降，相关分析表明心功能障碍与心肌细胞内[Ca^2 ]i含量升高呈明显负相关，与ATP酶活性降低呈明显正相关。结论：MC后心脏功能下降，心肌细胞内[Ca^2 ]i含量升高和ATP酶活性下降可能是其原因之一。     

丙泊酚对心肌肥厚大鼠心肌肌浆网Ca2+-ATPase活性的影响

目的 观察丙泊酚对心肌肥厚大鼠心肌肌浆网Ca2+-ATPase活性的影响.方法 50只雄性SD大鼠采用SAS统计软件随机分为正常对照组(n=10)和心肌肥厚模型组(n=40).心肌肥厚组再随机均分四个亚组(n=10):模型组、丙泊酚30mg组、丙泊酚60mg组和脂肪乳剂组.采用腹腔注射去甲肾上腺素(NE)方法制备大鼠心肌肥厚模型,NE 1.5mg·kg-1腹腔注射,每天2次,连续15d得到心肌肥厚模型.次日麻醉后分别静脉输注生理盐水、不同剂量丙泊酚及脂肪乳,输注30mins后处死大鼠,测量心肌组织Ca2浓度及肌浆网Ca2+-ATPase活性.结果 与正常对照组比较肥厚模型组各亚组心肌组织Ca2+浓度增高(P＜0.05),而肥厚模型组各亚组比较Ca2浓度差异无统计学意义(P＞0.05).与正常对照组比较肥厚模型组各亚组心肌肌浆网Ca2+-ATPase活性降低(P＜0.05),肥厚模型组各亚组比较:模型组、脂肪乳剂组高于丙泊酚30mg组、丙泊酚60mg组,丙泊酚30mg组高于丙泊酚60mg组(P＜0.05),余差异无统计学意义(P＞0.05).结论 心肌肥厚大鼠心肌肌浆网Ca2+-ATPase活性与丙泊酚的剂量有关,随着剂量增大活性降低.     

芍药醇通过抑制细胞外Ca2+流入及细胞内Ca2+流出对大鼠肠系膜动脉产生血管舒张

Objective: To investigate the vasodilative effect of paeonol in rat mesenteric artery and the mechanisms responsible for it. Methods: Rats were anaesthetized and sacrificed. The superior mesenteric artery was removed, dissected free of adherent tissue and cut into 2.0 mm long cylindrical segments. Isometric tension of artery rings was recorded by a myograph system in vitro. Concentration-relaxation curves of paeonol (17.8 μmol/L to 3.16 mmol/L) were recorded on artery rings precontracted by potassium chloride (KCl) and concentration-contraction curves of KCl, 5-hydroxytryptamine (5-HT), noradrenaline (NA) or calcium chloride (CaCl2) were recorded in the presence of paeonol (10-4.5, 10-3.8, 10-3.5 mol/L) respectively. And also, concentration-relaxation curves of paeonol were recorded in the presence of different potassium channel inhibitors and propranolol on rings precontracted with KCl respectively. To investigate the role of intracellular Ca2+ release from Ca2+ store, the contraction induced by NA (100 μmol/L) and CaCl2 (2 mmol/L) in Ca2+ free medium was observed in the presence of paeonol respectively. Results: Paeonol relaxed artery rings precontracted by KCl in a concentration-dependent manner and the vasodilatation effect was not affected by endothelium denudation. Paeonol significant decreased the maximum contractions (Emax) induced by KCl, CaCl2, NA and 5-HT, as well as Emax induced by NA and CaCl2 in Ca2+ -free medium, suggesting that paeonol dilated the artery via inhibiting the extracellular Ca2+ influx mediated by voltage-dependent calcium channel, and receptor-mediated Ca2+-influx and release. Moreover, none of glibenclamide, tetraethylammonium, barium chlorded and propranolol affected the paeonol-induced vasodilatation, indicating that the vasodilatation was not contributed to ATP sensitive potassium channel, calcium-activated potassium channel, inwardly rectifying potassium channel, and β-adrenoceptor. Conclusions: Paeonol induces non-endothelium dependent-vasodilatation in rat mesenteric artery via inhibiting voltage-dependent calcium channel-mediated extracellular Ca2+ influx and receptor-mediated Ca2+ influx and release.     

P物质对大鼠垂体前叶细胞内Ca2+浓度的影响

目的研究P物质（SP）对大鼠垂体前叶（AP）培养细胞内Ca^2＋的影响,进而阐述SP的作用机制。方法原代培养成年雌性S-D大鼠的AP细胞48h后,加入不同浓度的SP孵育30min,采用Fura-2/AM作为细胞内钙离子的荧光探针负载培养的AP细胞,结合阳离子测定系统检测AP细胞[Ca^2＋]i。结果孵育时间为30min时,SP使AP细胞内Ca^2＋的水平增加,且呈剂量依赖性。结论Fura-2/AM结合阳离子测定系统可以精确的反映细胞内游离钙离子浓度,SP通过SPR产生的生物学效应可通过第二信使Ca^2＋来完成,在SP对生殖轴（下丘脑-垂体前叶-卵巢/睾丸）调控的理论中进一步证明了第二信使转导途径的作用。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化的心肌样细胞内Ca2+和CaMKⅡ的变化

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞(rat bone marrow mesenchymal stem cells,MSCs)体外诱导分化为心肌样细胞内游离钙浓度([Ca2 ]i)及钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)的表达变化.方法取健康SD大鼠骨髓,用5-氮杂胞苷体外诱导培养.取诱导培养2、3、4周的MSCs为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组,另取急性分离的心肌细胞为对照组,分别用激光共聚焦技术和Western blot技术检测[Ca2 ]i及CaMKⅡ表达水平.结果经荧光探针结合Ca2 后,用激光共聚焦技术检测发现,随诱导培养时间的延长,[Ca2 ]i逐渐增加;诱导培养4周的MSCs内[Ca2 ]i与对照组比较无显著差异[(100.81±17.64),(100.32±17.10),P＞0.05].各组细胞CaMKⅡ的变化趋势与[Ca2 ]i定量分析结果相似,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组及对照组分别为(322.45±19.43)、(434.43±16.77)、(680.91±20.61)、(682.69±21.03),Ⅲ组与对照组比较P＞0.05.结论大鼠MSCs在体外诱导培养4周后已分化为心肌样细胞,其细胞内游离钙浓度和CaMKⅡ蛋白表达水平与正常心肌细胞相似.     

一种新的同时测定大鼠心肌细胞内Ca2＋和pH的方法

目的 建立一种同时测定单细胞内Ｃａ＾２＋和ｐＨ的方法。方法 大鼠单个心室肌细胞内同时负载Ｃａ＾２＋和ｐＨ敏感性荧光指示剂ｉｎｄｏ－１和ＳＮＡＲＦ－１,用荧光显微镜法测定细胞内Ｃａ＾２＋和ｐＨ的变化,并建立了测定条件和两种指示剂的细胞内标准曲线。结果 室温下将１０μｍｏｌ／Ｌ的ｉｎｄｏ－１－ＡＭ和５μｍｏｌ／Ｌ的ＳＮＡＲＦ－１－ＡＭ载入细胞内,两种指示剂单负载和以负载时荧光强度和荧光比没有明显不同,     

离体新生大鼠运动神经元的电学特性

在新生大鼠脊髓切片,对经逆行激活鉴定的运动神经元进行常规细胞内记录,测得静息电位-67±3mV,膜电阻91±50MΩ,时间常数4.7±1.6ms,I-V曲线显示轻度正常整流性质。直接动作电位幅值74±4mV,阈电位-52±6mV,I-F曲线表明紧张型放电频率随去极化电流增大而升高。在4个细胞记录到自发的锋电位发放,其频率随膜超极化而降低,是否节律性活动有待进一步研究。     

大鼠严重烧伤早期心肌线粒体Ca2+转运变化及其机制研究

目的 探讨严重烧伤早期心肌线粒体Ca^2 转运变化及其发生机制。方法 复制30%Ⅲ度烫伤大鼠模型,测定伤后1、3、6、12、24h大鼠心肌线粒体Ca^2 转运速率,同时检测影响Ca^2 转运的相关指标--心肌细胞胞浆Ca^2 浓度（[Ca^2 ]c）、线粒体膜电位及ATP含量。结果 伤后1h心肌线粒体Ca^2 摄取速率明显升高,而Ca^2 释放速率无明显改变,但3、6、12、24h心肌线粒体Ca^2 摄取与释放速率、线粒体膜电位、ATP含量均显著降低,且烧伤后线粒体Ca^2 摄取速率与膜电位呈明显正相关,Ca^2 释放速率与线粒体ATP含量呈显著正相关。而伤后3、6、12、24h[Ca^2 ]c均明显高于正常对照组。结论 ①烧伤初始心肌线粒体Ca^2 摄取加强,伤后续阶段线粒体Ca^2 转运紊乱;②线粒体膜电位下降、ATP含量降低是烧伤后续阶段心肌线粒体Ca^2 转运紊乱的主要原因,伤后[Ca^2 ]c升高或有升高趋势也参与严重烧伤早期心肌线粒体Ca^2 转运变化的发生。     

慢性非细菌性前列腺炎SD大鼠前列腺平滑肌细胞内Ca2+浓度变化及意义

目的 建立自身免疫性慢性非细菌性前列腺炎大鼠模型,研究其前列腺平滑肌细胞内游离Ca2+浓度的变化及意义.方法 将SD大鼠分为正常对照组和炎症组,采用正常SD大鼠前列腺蛋白提纯液及弗氏完全佐剂(FCA)诱导大鼠自身免疫性炎症,两组分别进行体外培养前列腺平滑肌细胞(PSMCs)并纯化,用Fluo 3-AM Ca2+探针结合...     

酮替芬对新生大鼠心肌细胞内游离钙的影响

观察了酮替芬（Ｋｅｔ）对新生鼠心肌细胞内游离钙的影响,以酶法制备新生大鼠心肌细胞悬液,用荧光探针Ｆｕｒａ－２／ＡＭ检测心肌细胞内游离钙浓度的变化。结果表明：Ｋｅｔ对静息状态下「Ｃａ＾２＋」ｉ无影响,Ｋｅｔ（１０￣５００μｍｏｌ／Ｌ）剂量依赖性抑制高钾去经及ＮＥ所致的「Ｃａ＾２＋」ｉ升高。提示：Ｋｅｔ对心肌细胞膜下坟依赖性钙通道有抑制作用,也可能抑制受体操纵型钙通道。     

阿霉素对实验兔心肌细胞内游离钙和肌浆网Ca2+-ATP酶活性的影响

目的：探讨治疗剂量阿霉素（ADR）对心脏血流动力学及心肌肌浆网Ca^2 －ATP酶活性的影响。方法：实验兔每周静脉注射ADR（2mg/kg）1次，共8周，以健康同龄兔静脉注射等量生理盐水为对照组。这药3周后多普勒测定降主动脉血流量，以代表心输出量（CO），左颈总动脉和左心室插管测定血压（BP），平均动脉压（MAP），左心室收缩压（LVSP），左心室舒张末压（LVEDP）。应用荧光分光光度计测定心肌细胞内游离钙（MyoCa^2 ）浓度，无机磷酸根法测定心肌肌浆网（SR）Ca^2 －ATP酶活性。结果：阿霉素组CO、BP、MAP、LVSP均较对照组低，而VEDP则明显增高。阿霉素组使MyoCa^2 浓度显著增高，同时SR Ca^2 -ATP酶活性明显低于对照组。结论：治疗剂量阿霉素可使心脏功能下降，心肌细胞内钙超载及SR Ca^2 －ATP酶活性降低。     

IGF-1对痴呆模型大鼠学习记忆能力及脑细胞内Ca2+的影响

目的 探讨胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对痴呆模型大鼠学习记忆能力及脑细胞内Ca2+的影响.方法 本研究采用切断成年Wistar大鼠双侧穹窿海马伞,建立隔-海马胆碱能系统损害的痴呆模型.分为正常对照组、假手术组、痴呆组、小剂量IGF-1组、大剂量IGF-1组.痴呆模型制备1d后开始侧脑室给药,连续21d.正常对照组不给予任何处置.利用水迷宫观察其行为学改变,应用激光共聚焦显微镜观察各组大鼠脑细胞内Ca2+的荧光强度.结果 (1)小剂量IGF-1组和大剂量IGF-1组与痴呆组相比,逃避潜伏期明显减少,跨越平台次数明显增多(P＜0.01);(2)IGF-1治疗小剂量组与大剂量组相比,逃避潜伏期明显减少,跨越平台次数明显增多(P＜0.01或P＜0.05).激光共聚焦显微镜检测结果:(1)小剂量IGF-1组、大剂量IGF-1组脑细胞内Ca2+荧光像素值与痴呆组比较均明显降低,具有统计学差异(P＜0.01);(2)小剂量IGF-1组与大剂量IGF-1组相比,荧光像素值差异有统计学意义(P＜0.01或＜0.05).结论 IGF-1通过调节痴呆模型大鼠Ca2+水平来改善其学习记忆能力.