弓形虫致密颗粒蛋白GRA8真核重组表达质粒的体外表达分析

目的:分析弓形虫致密颗粒蛋白GRA8真核表达质粒的体外表达。方法:大量提取纯化重组真核表达质粒pVAX1-GRA8,瞬时转染培养的vero E-6细胞,RT-PCR和免疫印迹法检测GRA8在细胞中的表达。结果:从转染pVAX1-GRA8后的vero E-6细胞的RNA中扩增出GRA8的特异条带,转染细胞存在弓形虫感染血清识别的特异蛋白质条带。结论:真核表达质粒pVAX1-GRA8在vero E6细胞中获得表达。     

弓形虫P30-P22 DNA疫苗免疫小鼠诱导的细胞免疫应答

目的观察弓形虫P30-P22 DNA疫苗免疫小鼠后所诱导的细胞免疫应答。方法大量制备重组真核表达质粒pcDNA3.1-P30-P22,经肌内注射免疫BALB/C小鼠,初次免疫后,第2周和第4周各加强免疫1次。用MTT法测定免疫鼠脾脏T淋巴细胞转化率和NK细胞杀伤率,用免疫荧光法对CD4 、CD8 T细胞亚群进行测定。结果NK细胞杀伤率:实验组为(72.3±4.15)%,空质粒对照组和PBS对照组分别为(51.3±4.67)%和(47.4±5.10)%,实验组与两对照组之间比较差异有统计学意义(P<0.05),两对照组之间无统计学意义(P>0.05);ConA刺激淋巴细胞转化实验,实验组与对照组差异无显著性(P>0.05);对T淋巴细胞亚群进行分析,可见CD8 的数量上升,CD4 /CD8 的比率下降,实验组与对照组有明显差异(P<0.05)。结论弓形虫表面抗原P30-P22 DNA疫苗免疫BALB/c小鼠可诱导一定的细胞免疫应答。     

双亚型(H5/H7)流感病毒DNA疫苗的构建及其免疫原性检测

目的：构建双亚型（H5/H7）流感病毒DNA疫苗,并检测其免疫原性。方法： 构建共表达流感病毒H5亚型血凝素(HA)和H7亚型HA的DNA疫苗,采用间接免疫荧光法(IFA)检测目的蛋白在幼仓鼠肾细胞(BHK cell)中的表达。分为pVAX1-H5-H7、pVAX1-H5、pVAX1-H7和pVAX1空质粒对照组4组（每组15只）进行小鼠免疫实验,并应用ELISA法检测小鼠血清抗体,流式细胞术检测小鼠脾T淋巴细胞亚群数量。结果：所构建的双亚型（H5/H7）流感病毒DNA疫苗在BHK细胞中的表达产物可激发荧光抗体产生绿色免疫荧光,且对照pVAX1空载体转染BHK细胞无免疫荧光产生。使用双亚型（H5/H7）流感病毒DNA疫苗免疫小鼠后,小鼠产生了针对H5和H7抗原的血清特异性抗体,流式细胞术检测免疫组小鼠脾T淋巴细胞亚群CD4+和CD8+的数量显著高于对照组（P<0.05）。结论： 成功构建的双亚型（H5/H7）流感病毒 DNA疫苗可以诱导小鼠产生特异性的细胞免疫和体液免疫应答。     

SAGl和R0P1混合基因真核表达质粒接种小鼠诱导产生拮抗致死性弓形虫感染的保护性免疫

目的 检测混合SAGl和ROP1编码基因真核表达质粒疫苗诱导小鼠的免疫应答，评价其抗弓形虫感染的保护性免疫效果。方法 将SAGl和ROP1编码基因片段克隆入pEGEP—N3表达载体，构建重组质粒；RT—PCR体外验证重组质粒在N1H3T3细胞中的表达；通过检测抗体、抗体分型及细胞因子来评价体液免疫和细胞免疫；流式细胞仪测定脾脏淋巴细胞亚群；腹腔内注射毒性株弓性虫速殖子攻击免疫小鼠。结果 RT-PCR结果显示重组质粒能在哺乳动物细胞内表达；SAGl和ROP1混合重组质粒疫苗诱导小鼠产生很强体液免疫和细胞免疫，对于毒性株弓形虫感染攻击具有免疫保护作用。结论 不同候选抗原编码基因混合重组质粒能够诱导小鼠产生抗弓形虫感染保护性免疫，提示含有多种成份的混合DNA疫苗的研制可作为核酸免疫研究的策略之一。     

抗原特异性CD4+CD25+ T细胞的制备及功能鉴定

目的: 制备供体抗原特异性CD4+CD25+调节性T细胞,并对诱导的细胞进行免疫生物学功能鉴定?方法:分离供体ICR小鼠的脾细胞经尾静脉免疫BALB/cByJ小鼠,每周1次,连续3周?第4周,体外免疫磁珠分离技术(MACS)分选被免疫小鼠CD4+CD25+ T细胞和CD4+CD25-T细胞?混合淋巴细胞反应和ELISA检测细胞的功能?结果:体外共培养实验显示,被免疫BALB/cByJ小鼠的脾细胞呈低增殖反应?CD4+CD25+T细胞能够抑制同种异体抗原刺激的天然(na?觙ve)BALB/cByJ小鼠CD4+CD25-T细胞的增殖反应和γ干扰素(IFN-γ)的分泌?结论:供体特异性脾细胞输注后分选的CD4+CD25+调节性T细胞是抗原特异性的,在体外具有免疫无能性和免疫抑制性?     

新型基因佐剂SPreS2真核表达载体的构建及其瞬时表达

目的 构建重组真核表达载体pVAX1-SPreS2作为基因佐剂,用以增强或调节弓形虫DNA疫苗的体液及细胞免疫效果。方法 采用重叠延伸PCR技术,扩增乙肝病毒表面抗原S和PreS2基因,引入编码GSGSGS柔性多肽序列作为接头拼接S和PreS2基因,构建重组克隆载体pMD18T-SPreS2和重组真核表达载体pVAX1-SPreS2,分别进行PCR、酶切和测序鉴定;脂质体法将重组载体pVAX1 SPreS2转染人成纤维细胞,建立体外真核细胞瞬时表达系统,SDS-PAGE和Western blot检测重组载体转染HFF细胞瞬时表达状况及其表达产物的免疫活性。结果 PCR、酶切、测序结果表明,重组克隆载体pMD18T SPreS2和重组真核表达载体pVAX1 SPreS2正确构建,融合基因SPreS2在真核细胞中可以瞬时表达,其表达产物具有一定的免疫活性。结论 成功构建重组真核表达载体pVAX1-SPreS2,为增强或调节弓形虫DNA疫苗免疫效果提供一种新型基因佐剂。     

弓形虫MIC8基因对弓形虫病的免疫保护性研究

目的观察弓形虫MIC8基因对弓形虫病免疫保护性的效果。方法用PCR方法扩增弓形虫MIC8基因,定向克隆到真核表达质粒pEGFP-N1中,构建重组表达载体pEGFP-MIC8;MIC8-EGFP转染293T细胞,荧光显微镜观察表达情况;然后分别用质粒pEGFP-MIC8、pEGFP-N1空载体及生理盐水肌肉注射免疫BALB/c小鼠,共免疫3次,末次免疫3周后用弓形虫RH株速殖子感染免疫小鼠。结果 PCR扩增弓形虫MIC基因序列正确,构建的重组表达载体pEGFP-MIC8鉴定正确,荧光显微镜下观察到重组质粒能够在293T细胞中表达。弓形虫攻击感染后,质粒pEGFP-MIC8免疫小鼠与对照组相比,小鼠的存活时间有一定的延长。结论构建的真核表达重组质粒pEGFP-MIC8对抗击弓形虫攻击感染能够激发一定的免疫保护性。     

弓形虫复合黏膜疫苗滴鼻免疫小鼠诱导的脾淋巴细胞持续性免疫应答

目的观察弓形虫复合黏膜疫苗滴鼻免疫BALB/c小鼠后诱导的脾淋巴细胞的免疫应答及持续时间。方法96只BALB/c小鼠随机分为免疫组和对照组,免疫组以弓形虫复合黏膜疫苗20μl/只(20μg可溶性速殖子抗原 1μg霍乱毒素)滴鼻免疫2次(间隔2周),对照组以PBS滴鼻。分别于末次滴鼻后第1,2,3,4,6,8,10,12周处死小鼠,脾淋巴细胞计数,免疫细胞化学法检测CD4 、CD8 T细胞亚群水平。结果免疫组小鼠于第1,2周脾淋巴细胞明显高于对照组(P<0.01),其中以CD4 T细胞增生为主,第1,2,3,4,6周增生显著(P<0.01),CD8 T细胞水平在第2,3周也有增生(P<0.05),CD4 /CD8 比值第6周高于对照组(P<0.01)。结论弓形虫复合黏膜疫苗滴鼻免疫BALB/c小鼠可有效诱导脾淋巴细胞增殖性免疫应答,且可持续较长时间。     

大鼠间充质干细胞对BALB/c小鼠体外淋巴细胞实验的影响

目的 研究大鼠间充质干细胞(MSC)对BALB/c小鼠淋巴细胞增殖和CD4+CD25+调节性T细胞亚群的变化。方法 分离、扩增SD大鼠MSCs,流式细胞术检测表面标志以鉴定。取第5代MSC与分离的小鼠淋巴细胞在刀豆蛋白(ConA)刺激下共培养5天 ,流式细胞仪测定细胞增殖,CD4+CD25+调节性T细胞亚群比例的变化。结果 当淋巴细胞: MSCs在1:10及1:50时均可抑制ConA刺激下可抑制小鼠淋巴细胞增殖,淋巴细胞: MSCs在1:10 时CD4+CD25+调节性T细胞亚群比例明显升高。结论 大鼠MSC具有异种基因免疫抑制作用     

CD137L在HBsAg DNA疫苗诱导小鼠细胞免疫应答中的佐剂效应

目的:研究共刺激分子CD137L重组质粒对HBsAg DNA疫苗诱导小鼠细胞免疫应答和回忆反应的佐剂作用.方法:将小鼠CD137L真核表达载体(pcD137L)体外转染NIH3T3细胞,RT-PCR、流式细胞仪和免疫荧光法分别检测CD137L mRNA和蛋白的表达;pcD137L与HBsAg DNA疫苗(pcDS)通过肌肉注射联合免疫BALB/c小鼠,LDH释放法测定体外脾细胞特异性CTL杀伤活性;流式细胞仪分析小鼠脾脏CD8+记忆T细胞数量;流式细胞仪检测CD8+T细胞及淋巴细胞中IFN-γ和IL-4的表达水平.结果:重组质粒pcD137L在NIH3T3细胞中获得有效表达.与pcDS单独免疫组比较:免疫后1周,pcDS+pcD137L免疫组能诱导更强的HBsAg特异性CTL杀伤活性(P<0.05);免疫后1周和12周,pcDS+pcD137L免疫组CD8+T细胞CD44high和CD127表达水平均显著增高(P<0.05或P<0.01);免疫后1周、12周和13周(即再次给予pcDS刺激后1周),pcDS+pcD137L免疫组分别明显上调CD8+T细胞和淋巴细胞中IFN-γ产生细胞的百分比,差异有显著意义(均P<0.05).结论:共刺激分子CD137L能显著增强HBsAg DNA疫苗诱导的Tc1(I型)细胞免疫、特异性CTL应答及回忆反应,是诱导HBV特异性T细胞应答的有效佐剂.     

Construction of a recombinant plasmid harbouring the rhoptry protein 1 gene of Toxoplasma gondii and preliminary observations on DNA immunity

Objective To observe the immune responses elicited in BALB/c mice by a DNA vaccine. A ge ne encoding rhoptry protein 1 (ROP1) from Toxoplasma gondii (T. gondii) was cloned into vector pcDNA3.Methods Amplifyied gene fragments coding for ROP1 from the genomic DNA of T.gondii ZS2 were inserted into cloning vector, pUC18, and sub-cloned into pcDNA3. Mice wer e injected at a dosage of 100 μg recombinant plasmid DNA by intramuscular inje ction and boosted after 2 weeks. pcDNA3 and normal saline were used as control . 30, 50 and 70 days after the second immunization, NK cell activity, T lympho cyte proliferation and sub-clusters and serum IgG antibody were assayed.Results The specific gene fragment coding for ROP1 was amplified and a pcROP1 recombinan t was constructed. At 30 days after immunization, the spleens of the mice were obviously enlarged evidently. NKC activity and the proliferation of spleen T ly mphocytes seen on MTT assay were higher in pcROP1 group than in the controls. T he number of CD4(+) T cells exhibited no obvious increase compared with that of the control, but CD8(+) T cells were obviously increased (P&lt;0.05). At 90 d ays after vaccination, the titer of IgG antibody in the serum of vaccinated mice was positive (1∶100).Conclusion pcROP1 was constructed and it could elicit both cellular and humoral immune r esponses in immunized mice.     

弓形虫GRA7真核表达质粒的构建

目的:构建弓形虫致密颗粒抗原GRA7的真核重组表达质粒。方法:设计GRA7的特异引物,采用多聚酶链反应(PCR)技术从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码GRA7的基因片段,经克隆至pMD18-T载体后,亚克隆至真核表达载体pVAX1而构建真核重组表达质粒pVAX1-GRA7。结果:PCR扩增出GRA7基因的特异片段,所获克隆的序列正确,并被亚克隆到真核表达载体pVAX1,构建了真核重组表达质粒pVAX1-GRA8。结论:成功构建了GRA7的真核重组表达质粒pVAX1-GRA7。     

弓形虫棒状体蛋白7真核表达载体的构建及其免疫保护作用

目的 构建弓形虫棒状体蛋白7(ROP7)基因的真核重组表达载体,观察其对小鼠的免疫保护作用.方法 根据GenBank发表的弓形虫ROP7序列设计合成一对引物,通过PCR扩增ROP7基因,将其插入真核表达载体pEGFP-C1中构建重组质粒pEGFP-C1/ROP7(pROP7).用重组质粒转染HEK293T细胞并验证其在细胞内的表达.将36只雌性BALB/c小鼠随机分为3组:磷酸缓冲盐溶液(PBS)对照组、pEGFP-C1对照组和pROP7实验组.然后用PBS、pEGFP-C1和pROP7分别免疫相应组别的小鼠.采用ELISA检测小鼠血清特异IgG水平,观察弓形虫感染小鼠后的存活时间并评价其免疫保护力.结果 PCR扩增出1 728 bp的目的基因片段,真核表达载体构建成功,且能在HEK293T细胞中表达.目的基因的相应蛋白可被羊抗弓形虫多克隆抗体识别.重组质粒免疫的小鼠产生了较高水平的血清抗体.虫体攻击试验中,pROP7实验组小鼠的生存时间较对照组小鼠延长(P< 0.05).结论 本研究构建的真核表达质粒在对抗弓形虫感染时具有一定的免疫保护作用,为弓形虫基因疫苗的研制提供了参考.     

几种化学合成免疫调节剂免疫小鼠诱导的抗弓形虫感染研究

目的观察不同剂量的几种化学免疫调节剂免疫小鼠诱导抗弓形虫感染作用。方法不同剂量匹多莫德、沙利度胺、匹多莫德加沙利度胺分别灌胃小鼠,共免疫14次,对照组用PBS灌胃,检测其免疫效果,并观察其受到弓形虫攻击感染后的生存情况。结果匹多莫德、匹多莫德加沙利度胺使小鼠IFN—r、CD4^＋细胞数量升高（P〈0．01）,CD4^＋与CD8^＋比值增加,各组均未检测到IL-4;沙利度胺使小鼠CD8^＋细胞数量明显增加（P〈0．01）,CD4^＋与CD8^＋比值减少,各组T细胞增殖活性与PBS对照组比较明显增强（P〈0．05）,且匹多莫德20mg加沙利度胺1．0mg组T细胞增殖活性最明显。小鼠攻击试验表明,20mg匹多莫德加1．0mg沙利度胺组小鼠存活时间明显长于匹多莫德、沙利度胺以及PBS对照组。结论匹多莫德20mg加沙利度胺1．0mg可诱导更有效的抗弓形虫感染保护作用。     

弓形虫SAG1、SAG3基因的克隆和复合基因SAG1/SAG3真核表达重组质粒的构建

目的构建弓形虫表面抗原SAG1、SAG3复合基因的真核表达重组质粒,为弓形虫疫苗的研制作准备。方法提取弓形虫基因组DNA;用PCR技术扩增出表面抗原SAG1、SAG3的基因,再分别重组入pGEM-T克隆载体;将pGEM-SAG1和pGEM-SAG3重组质粒分别经酶切、纯化后定向亚克隆入pcDNA3.1(+)真核表达载体,经PCR、酶切及测序等方法对重组子进行鉴定。结果从弓形虫基因组DNA中扩增出SAG1、SAG3基因;构建了pGEM-SAG1、pGEM-SAG3克隆质粒;成功构建pcDNA3.1(+)-SAG1-SAG3真核表达复合基因质粒,测序表明目的基因定向正确连接。结论构建了pcDNA3.1(+)-SAG1-SAG3复合基因表达质粒,为今后研制弓形虫复合多价疫苗提供候选抗原奠定了实验基础。     

三种表达形式的SAG1基因对小鼠的免疫效果观察

目的 构建了三种表达形式的弓形虫主要表面抗原（SAG1）基因-表膜型,分泌型和细胞内型,并分别用于免疫BALB/C小鼠。结果 SAG1基因免疫小鼠后,表膜型和分泌型较细胞内型体液免疫出现早且反应强;细胞因子水平测试显示免疫后小鼠免疫后应趋向Th1型。攻击感染结果证实;表膜型和分泌型免疫小鼠较细胞内型免疫小鼠所获保护力强。结论 三种表达形式的SAG1基因的小鼠模型中免疫效果不同。     

Immune responses to the expressed products of the CSP antige n gene of Plasmodium falciparum southern China isolate FCC1/HN in Hela cell

Objective To construct a eukaryotic expression system with pcDNA3-PfCSP/Hela for the Circ umsporozoite protein (CSP) gene of Plasmodium falciparum (P.falciparum), t o observe the immune responses in BALB/c mice induced by the expressed proteins .Methods The recombinant plasmid pcDNA3-PfCSP was transformed into the Hela cell line. The expressed protein was isolated and analyzed by using SDS-PAGE and used for immunization of BALB/c mice by subcutaneous, intravenous, and intraperitone al adminstration.Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), Dot-ELISA, Wester n blot, T lymphocyte proliferation test, natural killer cell(NKC) activity assay , and CD4(+) and CD8(+) T cell detection were used for observation of humoral an d cellular immune responses.Results Immune sera strongly reacted with the expressed protein, antibody titer was up to 1∶6400 as detected by ELISA.Western blot analysis revealed a specific b and at 38.3 Kda.When the spleen cells of normal and immunized BALB/c mice we re specifically stimulated with expressed protein, the optical densities were 0 .12±0.03 and 0.34±0.04, respectively.The latter were significantly highe r than the former (P&lt;0.01).We used the MTT colorimetric assay to measure NKC activity of mice spleen.The results showed that the NKC activity of immuni zed BALB/c mice was remarkably higher than that of the controls (P&lt;0.05). CD4(+) and CD8(+) T cells were detected by using monoclonal antibody immunofluor escence methods.The results showed that the percentage of CD4(+) and CD8(+) T cells of immunized group were significantly higher than that of control group ( P&lt;0.05).Conclusions The humoral and cell-mediated immune responses and elevated NKC activity to pr oducts made with a eukaryotic expression system could be specifically detected i n BALB/c mice.These findings indicate that the expressed protein could enhance the immune function in mice.