小鼠MIF在大肠杆菌中的表达及纯化

目的：获得足够量的高纯度小鼠巨噬细胞移动抑制因子(MIF)重组蛋白。方法：酶切重组克隆质粒pMD18-MIF，将片段插入原核表达载体pQE31，构建相应的重组表达质粒pQE31-MIF，将此质粒转化大肠杆菌M15，得到转化子。经IPTG诱导表达后进行菌体蛋白的Western blotting免疫印迹分析，并用Ni—NTA凝胶进行纯化。结果：MIF基因重组体构建成功，克隆的目的基因片段在M15中产生的融合表达产物在Western blotting检测中具有与抗MIF单克隆抗体发生特异性结合反应的特性。得到了纯化的目的蛋白。结论：MIF基因片段可在大肠杆菌中有效表达，表达产物可以与抗MIF单克隆抗体发生特异性结合反应，并得到纯化的MIF。     

HPV 16L1基因的原核表达及表达条件的优化

目的:构建HPV 16L1基因的原核表达质粒,并优化其表达条件.方法:根据GeneBank中的HPV序列及pGEX-KG中的多克隆位点设计引物,以含有HPV全长基因片段重组质粒为模板,经PCR扩增出1 500 bp 的DNA片段.将所得片段与pGEX-KG 载体连接,转化JM109大肠杆菌,筛选阳性克隆.其扩增片段测序结果与原序列一致,表明原核表达载体pGEX-KG-HPV16L1已构建成功.提取pGEX-KG-HPV16L1质粒转化到BL21(DE3)表达菌株中,经IPTG 诱导后收集菌体,进行SDS-PAGE,Western Blot鉴定.结果:在大肠杆菌中获得HPV16L1基因融合表达,融合蛋白的相对分子量为83kDa;表达的蛋白能与抗HPV 16L1抗体发生特异性反应.结论:HPV 16L1基因在大肠杆菌中获得高效表达,为HPV16L1疫苗的研制奠定了基础.     

幽门螺杆菌融合基因vacA-hpaA的克隆及在大肠杆菌和双歧杆菌中的表达

目的 构建幽门螺杆菌融合基因vacA-hpaA的大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达质粒,并观察其在大肠杆菌(E.coli)和双歧杆菌(B.bifidium)中的表达情况.方法 通过PCR得到hpaA-vacA融合基因,将该融合基因定向克隆到大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-hpaA-vacA,电穿孔转化入大肠杆菌BL21和双歧杆菌.转化菌经IPTG诱导,然后用SDS-PAGE和Western blotting方法鉴定表达的重组蛋白.结果 构建了重组质粒pGEX-vacA-hpaA,vacA-hpaA融合基因的分子量约为1548bp;经SDS-PAGE分析,在大肠杆菌中表达出85kD的融合蛋白,表达的蛋白约占细菌总蛋白的20.5％;在双岐杆菌中也能得到正确表达,但表达量较大肠杆菌低,占细菌总蛋白约8.5％.Western blotting结果确认了该条带为hpaA-vacA融合基因的产物.结论 构建的重组质粒pGEX-hpaA-vacA能够在大肠杆菌及双歧杆菌中获得表达.     

人白细胞介素16的基因克隆及其表达载体的构建

目的通过从人外周血单个核细胞(PBMC)中克隆编码人IL-16的cDNA基因,构建人IL-16的原核高效表达系统。方法从组胺刺激的正常人外周血单个核细胞中分离总RNA,利用半巢式RT-PCR、T-A克隆等技术得到特异的cDNA片段;将含有IL-16 cDNA的质粒IL-16-PUC18和原核表达载体PMAL-C2经酶切、目的DNA片段的分离、重组连接、筛选、序列分析等系列操作,获得重组质粒PMAI-C2-IL-16,将重组质粒转化至大肠杆菌DH5α,用IPTG诱导表达工程菌,Westem blotting检测表达产物。结果经序列测定证实,所得片段为IL-16cDNA;Western blotting检测重组体中确有抗IL-16抗体的融合蛋白表达。结论成功克隆了中国人IL-16 cDNA,并表达了IL-16融合蛋白。     

HPV16L1-E7重组腺病毒rAd5HPV16L1-E7的构建及克隆表达

目的研制人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1-E7重组腺病毒,以期获得防治宫颈癌的重组腺病毒减毒活疫苗和嵌合病毒样颗粒疫苗。方法以HPV16型野毒株HPV16-114／K为模板,利用PCR克隆技术构建可表达HPV16主要衣壳蛋白L1(1-301aa)和转化蛋白E7(1-60aa)融合基因的重组质粒pUC19L1-E7,HPV16L1-E7DNA片段经质粒pBSLl-E7转入腺病毒Ad5穿梭质粒pCA14L1-E7,与腺病毒质粒pBHGl0共转染293细胞,制备重组腺病毒rAd5HPV16L1-E7,密度梯度超迷离心纯化HPV16嵌合L1-E7VLP。结果成功构建了HPV16L1-E7重组质粒pUC19L1-E7,制备HPV16L1-E7重组腺病毒rAd5HPV16L1-E7,HPV16L1-E7融合蛋白可在293细胞中高效表达,可达细胞总蛋白的10％以上,并装配成嵌合病毒样颗粒(cVLP)。结论成功制备了可高效表达IPV16L1-E7嵌合L1-E7VLP的重组腺病毒rAd5HPV16L1-E7载体疫苗,为HPV重组腺病毒疫苗用于宫颈癌的防治打下了基础。构建的pUC19L1载体可以比较方便的插入外源基因,用来构建多价疫苗,因此在制备HPV16多价疫苗方面具有广泛的应用价值。     

人细胞周期蛋白D1及细胞周期蛋白激酶CDK4的原核表达及鉴定

【目的】构建表达人细胞周期蛋白Dl及细胞周期蛋白激酶CDK4融合蛋白的重组体。【方法】用RT-PCR从HL-60细胞中扩增细胞周期蛋白D1及CDK4基因片段，克隆到pGEM-T easy载体上。测序鉴定后切下相应的片段，连接到表达载体pET-22b( )上，重组质粒转化大肠杆菌BL21(DL3)，使之高效表达融合蛋白细胞周期蛋白D1及CDK4。SDS-PAGE电泳及Western blotting鉴定表达蛋白。【结果】 用PCR扩增得到了正确的目的基因片段并构建成pET-cyclinD1和pET-CDK4两个原核表达载体。将其转化大肠杆菌，Western blot检测证实了转化的大肠杆菌能表达细胞周期蛋白D1及CDK4融合蛋白。【结论】 本研究成功构建了细胞周期蛋白D1及CDK4原核表达载体，后两在细胞内能正确表达细胞周期蛋白D1及CDK4融合蛋白．     

人釉原蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的 构建含人釉原蛋白(hAm)成熟肽基因的重组原核表达质粒,在大肠杆菌中表达重组人釉原蛋白,鉴定经纯化获得的融合蛋白.方法 利用限制性内切酶EcoR I和Sal I将hAm基因插入原核表达载体PGEX4T1,对重组表达质粒PGEX4T1-hAm进行双酶切和测序鉴定.选择测序正确的质粒转化E.coli.RosettaTM,用终浓度0.3 mmol/L的IPTG诱导表达带有亲和标记谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的重组hAm.经亲和层析纯化获得融合蛋白GST-hAm,并通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定原核表达的重组hAm.结果 重组质粒经双酶切和测序鉴定证实插入序列准确无误.在大肠杆菌RosettaTM中经IPTG诱导表达并纯化得到的融合蛋白GST-hAm,经SDS-PAGE鉴定分子量约为46 000,主要以包涵体形式存在,与预测一致;Western blotting证实该融合蛋白能被特异性抗hAm多克隆抗体识别.结论 成功构建含有hAm成熟肽基因的重组原核表达质粒,表达的融合蛋白GST-hAm可通过纯化获得,经鉴定为hAm.大量纯化的hAm成熟肽的获得为开展其功能研究奠定了基础.     

人釉原蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的构建含人釉原蛋白(hAm)成熟肽基因的重组原核表达质粒,在大肠杆菌中表达重组人釉原蛋白,鉴定经纯化获得的融合蛋白。方法利用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ将hAm基因插入原核表达载体PGEX4T1,对重组表达质粒PGEX4T1-hAm进行双酶切和测序鉴定。选择测序正确的质粒转化E.coli.RosettaTM,用终浓度0.3 mmol/L的IPTG诱导表达带有亲和标记谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的重组hAm。经亲和层析纯化获得融合蛋白GST-hAm,并通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定原核表达的重组hAm。结果重组质粒经双酶切和测序鉴定证实插入序列准确无误。在大肠杆菌RosettaTM中经IPTG诱导表达并纯化得到的融合蛋白GST-hAm,经SDS-PAGE鉴定分子量约为46000,主要以包涵体形式存在,与预测一致;Western blotting证实该融合蛋白能被特异性抗hAm多克隆抗体识别。结论成功构建含有hAm成熟肽基因的重组原核表达质粒,表达的融合蛋白GST-hAm可通过纯化获得,经鉴定为hAm。大量纯化的hAm成熟肽的获得为开展其功能研究奠定了基础。     

问号钩端螺旋体LipL32-LipL41融合基因的克隆与原核表达

目的构建钩端螺旋体融合基因lip L32-lip L41重组表达质粒,并获得重组表达的融合蛋白。方法设计引物,聚合酶链反应(PCR)从各参考标准株中扩增Lip L32、Lip L41基因,连接引物PCR法构建Lip L32-Lip L41融合基因,连接到大肠杆菌表达载体p ET28a上,构建p ET28a-Lip L32-Lip L41重组质粒,并转化到大肠杆菌DE3菌株中进行诱导表达,聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)及Western blot鉴定融合蛋白的表达。结果扩增获得的Lip L32-Lip L41融合基因为1 900 bp,原核表达重组质粒p ET28a-Lip L32-Lip L41经酶切鉴定含有融合基因片段,在大肠杆菌中表达出Mr 90 000左右的重组融合蛋白Lip L32-Lip L41。结论成功构建钩体Lip L32-Lip L41融合基因,并在大肠杆菌中成果表达融合蛋白,为进一步评价Lip L32-Lip L41作为候选抗原诊断钩端螺旋体病的价值奠定基础。     

NP9蛋白的原核表达及纯化

目的构建表达人NP9融合蛋白的重组体并进行融合蛋白的原核表达及NP9蛋白的分离和纯化。方法通过聚合酶链反应（PCR）得到NP9基因的编码区序列，克隆到原核表达载体pGEX-6P-3上构建重组NP9原核表达质粒。转化大肠杆菌后通过SDS-PAGE电泳和Western blotting鉴定融合蛋白表达。使用GSTFF层析柱分离纯化NP9蛋白。结果得到序列正确的NP9基因及重组原核表达质粒pGEX-6P-3-Np9，SDS-PAGE电泳和Western blotting证实重组质粒能够在大肠杆菌内受IPTG诱导表达，层析分离得到分子量为大约14kDa单一的NP9蛋白。结论成功构建了表达NP9融合蛋白的原核表达载体，该栽体能在细菌内表达出GST—NP9融合蛋白．有效分离得到NP9蛋白．     

pQE31-HPV16 L1重组质粒的构建及鉴定

目的 构建重组原核表达质粒以获得ＨＰＶ１６ Ｌ１活性蛋白。为进一步研制ＨＰＶ１６基因工程疫苗打下基础。方法 以克隆质粒pQE３１－ＨＰＶ１６Ｌ１重组质粒,用酶切电泳验证重组结果的正确性,测序检查质闰重组后序列情况。结果 ＰＣＲ结果显示扩增片断大小为１.5Kb,与预期相同。重组质粒酶切后显示其大小约５.0Kb。大小及酶切图谱与预期相同。经测序发现插入片段两端序列无改变。结论 pQE３１－ＨＰＶ１６Ｌ１质粒构建成功。     

人乳头瘤病毒16L1-E5表达质粒的构建及其蛋白表达

目的构建人乳头瘤病毒16L1-E5的原核表达质粒,并进行表达融合蛋白,为下一步探讨该蛋白是否能作为疫苗的研究作准备。方法以本室已构建好的阳性质粒pET32（＋）／HPV16E5为模板,PCR获得E5基因,经SalI和NotI双酶切插入已构建好的pGEX4T-1／HPV16L1,通过筛选获得正确的阳性克隆pGEX4T-1／HPV16L1-E5。pGEX4T-1／HPV16L1-E5转化入BL21感受态细胞,经IPTG诱导进行目的蛋白的表达,通过测定不同时间、不同IPTG浓度和不同温度时目的蛋白表达情况,获得蛋白表达的最佳条件,SDS-PAGE和Westernblot检测蛋白表达。结果成功构建了质粒pGEX4T-1／HPV16L1-E5,在1mmol／L IPTG、34℃、4h诱导获得最大量的目的蛋白表达。结论成功构建的pGEX4T-1／HPV16L1-E5质粒能表达出目的蛋白,为进一步研究目的蛋白功能打下了坚实的基础。     

HPV16 E5蛋白原核表达、鉴定及真核表达稳定株的筛选

目的研究HPV16 E5蛋白的生物学特性及其细胞转化机制,对HPV16 E5蛋白原核和真核表达质粒进行构建、表达和鉴定。方法以临床确诊的HPVl6感染患者子宫颈细胞DNA为模板,采用PCR方法扩增HPV16 E5基因,经BamHⅠ和HindIⅡ双酶切后插入相同酶切的pET32a（＋）载体,转染JMl09感受态细胞,并进行阳性克隆筛选。经IPTG对重组质粒进行蛋白诱导表达,SDS-PAGE和Wlescem blotting检测目标蛋白表达情况。将BamHⅠ和XhoⅠ双酶切pET32（＋）,E5质粒后取得的E5全基因片段转入pcDNA3．1（＋）空质粒,构建pcDNA3．1（＋）m5真核表达质粒并对NIH3T3细胞进行转染,最后用G418进行稳定表达株的筛选,并采用RT．PCR鉴定细胞内HPV16 E5基因表达情况。结果成功构建了原核表达质粒pET32/E5,在1mmol／LPTG、28℃诱导条件下BL21（DE3）菌体中HPVl6E5．TRX融合蛋白占菌体总蛋白的10％左右。真核表达质粒pcDNA3．1（＋）／E5在成功转染NIH3T3细胞后于250μg/mlG418浓度时筛选21d得到了E5基因稳定表达株,RT-PCR产物测序得到了HPV16 E5基因全序列。结论成功构建了pET32／E5原核和pcDNA3．1（＋）／E5真核表达质粒,HPV16 E5蛋白在大肠杆菌和NIH3T3细胞中的稳定表达．这些结果为进一步深入研究HPV16 E5蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用奠定了坚实基础。     

pQE32-HPV18L1重组质粒的构建及鉴定

目的 构建重组原核表达质粒获得HPV18 L1活性蛋白，为进一步研制HPV18基因工程疫苗打下基础。方法 以重组质粒pBR322-HPV18为模板，利用PCR方法扩增HPV18 L1DNA片段，将HPV18 L1DNA与pUC19质粒重组构建pUC19-HPV18 L1重组质粒。用酶切电泳验证重组结果的正确性；并通过测序检查质粒重组后序列有无变化。再利用pQE32质粒做表达载体构建pQE32-HPV18 L1重组质粒，并用酶切电泳验证。结果 PCR扩增DNA片段约为1.7Kb，与预期结果相同。pUC19-HPV18 L1克隆重组质粒酶切后显示4.39Kb，酶切图谱与预期相同。测序验证插入片段全序列无改变。pQE32-HPV18 L1表达重组质粒酶切后显示其大小约5.16Kb，酶切图谱亦与预期相同。结论 pQE32-HPV18 L1表达重组质粒构建成功。     

HPV16L2开放读码框编码表位的基因克隆和表达

利用质粒p16L2Ex6-3和pATH10,制备了含有HPV16L2ORF编码表位的基因克隆p16L2REx6-3。将此重组质粒转化大肠杆菌HB101,并诱导其有效表达,产生一分子量约为40KD的含有E.coli trpE的融合蛋白。Western blot分析结果表明,此蛋白可与感染HPV16的患者血清呈阳性免疫反应,提示该克隆的表达蛋白具有HPV16,的型抗原特异性。     

HPV16 E7蛋白编码基因原核表达与鉴定

目的研究HPV16E7蛋白的生物学特性及其细胞转化机制,对HPV16E7蛋白原核表达质粒进行构建、表达和鉴定。方法以临床确诊的HPV16感染患者子宫颈细胞DNA为模板,采用PCR方法扩增HPV16E7基因,经BamH Ⅰ和Hind Ⅱ双酶切后插入相同酶切pET32a（＋）载体,转化JM109感受态细胞,并进行阳性克隆筛选。经IPTG对重组质粒进行蛋白诱导表达,SDS—PAGE和Western blot检测目标蛋白表达情况。结果成功构建了原核表达质粒pET32／E7,HPV16E7-TRX融合蛋白在BL21（DE3）菌株中高效表达,在1mmol／L IPTG、30℃诱导条件下融合蛋白表达量占菌体总蛋白的30％左右。结论pET32／E7原核表达质粒的构建、HPV16E7融合蛋白的表达为进一步深入研究HPV16E7蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用机制奠定了基础。     

利用反义技术抑制大肠杆菌β-内酰胺酶基因表达的实验研究

目的探讨利用反义表达质粒抑制细菌耐药基因表达的可行性。方法根据GenBank中β-内酰胺酶TEM-1基因序列设计一对寡核苷酸引物，通过PCR扩增获取TEM—1基因，将其反向克隆入质粒pBK—CMV的多克隆位点构建反义表达质粒，将此反义表达质粒导入携带TEM-1型β-内酰胺酶的大肠杆菌，Western—blotting检测TEM-1表达情况。结果成功构建了TEM-1基因的反义表达质粒，将其导入携带TEM-1型β-内酰胺酶的大肠杆菌后，Western-blotting检测发现TEM-1表达显著下调。结论利用反义表达质粒可抑制大肠杆菌β-内酰胺酶TEM-1基因表达。     

GST-HPV16E7融合蛋白的原核表达与纯化

目的 构建HPV16地方株E7基因原核表达质粒,使其在原核细胞中高效表达并进行纯化.方法 将成都本地某宫颈癌患者所感染的HPV16 E7全长片段插入原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组子pGEX-4T-1-HPV16E7,转化宿主菌E.coli BL-21.经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE、Western blot分析证实蛋白表达的特异性.并用GST亲和层析法对融合蛋白进行纯化.结果 该患者所感染的HPV16为东亚株,成功构建了原核表达载体pGEX-4T-1-HPV16E7并表达出GST-HPV16E7融合蛋白,证实了蛋白表达的特异性,并获得了GST-HPV16E7融合蛋白的纯品.结论 成功表达、纯化了本地流行株GST-HPV16E7融合蛋白,为进一步研究HPV16E7蛋白的功能奠定了实验基础.     

人乳头瘤病毒16型E5蛋白真核载体的构建及表达

目的构建人乳头瘤病毒115型（HPV16）E5蛋白真核表达载体pcDNA3．1（＋）／HPV16E5,分析E5在HeLa细胞及BALB／c小鼠肌肉组织中的表达。方法设计HPV16E5基因引物,PCR扩增E5基因。经Bam-HI、EcoR1酶切后将其连接入pcDNA3．1（＋）,PCR及双酶切筛选阳性克隆并测序。将构建的pcDNA3．1（＋）／HPV16E5转染HeLa细胞,利用RT—PCR测定HPV16E5mRNA表达。将6只BALB／c小鼠分为3组,分别取100mgpcDNA3．1（＋）／HPV16E5、100mgpcDNA3．1（＋）、100mLPBS经肌肉注射小鼠,2周1次,共4次;末次接种后第14天取小鼠股四头肌制成石蜡切片,免疫组织化学法检测E5蛋白在小鼠肌肉组织中的表达。结果PCR扩增得到252bpHPV16E5基因片段,DNA测序结果显示E5基因片段正确地连入pcDNA3．1（＋）。构建的pcDNA3．1（＋）／HPV16E5在HeLa细胞表达大小为252bp的HPV16E5mRNA。小鼠股四头肌细胞膜被染成棕黄色。结论构建的真核表达载体pcDNA3．1（＋）／HPV16E5能在HeLa细胞及小鼠肌肉组织中表达HPV16E5蛋白。