前脂肪细胞增殖分化在高脂膳食诱导大鼠肥胖及运动预防肥胖中的作用

目的:探讨前脂肪细胞增殖分化在高脂膳食诱导大鼠肥胖及运动预防肥胖过程中的作用。方法:40只雄性SD大鼠分为普通膳食安静组(C组,n=8)、普通膳食运动组(E组,n=8)、高脂膳食安静组(H组,n=14)和高脂膳食运动组(HE组,n=10)。C组和H组不运动,E组和HE组大鼠进行跑台运动,运动强度约为75%VO2max水平。12周干预后,记录各组大鼠体重,取附睾、肾周和腹后壁的脂肪垫分别称重,并计算总脂肪量;体视学方法检测脂肪细胞数目及平均直径;Western Blot检测脂肪组织过氧化物酶增殖物受体γ(PPARγ)和CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)的蛋白表达水平。结果:(1)H组大鼠体重及腹腔内总脂重均显著高于C组(P<0.01),E组和HE组大鼠肾周、腹后壁脂肪垫重及腹腔内总脂肪量均分别显著低于C组和和H组的相应部位(P<0.01)。(2)H组大鼠腹腔内脂肪总数目显著高于C组(P<0.01)。E组大鼠肾周及腹后壁脂肪细胞平均直径均分别显著低于C组的相应部位(P<0.05,P<0.01),HE组大鼠附睾、肾周及腹壁脂肪细胞平均直径均分别显著低于H组的相应部位(P<0.01)。(3)与C组相比,E组及H组大鼠附睾、肾周及腹壁脂肪组织PPARγ蛋白表达显著升高(P<0.01);H组大鼠附睾及肾周脂肪组织C/EBPα蛋白表达显著高于C组的相应部位(P<0.01),E组大鼠肾周及腹后壁脂肪组织C/EBPα蛋白表达显著高于C组的相应部位(P<0.01),但HE组大鼠肾周脂肪组织C/EBPα蛋白表达显著低于H组(P<0.01)。结论:前脂肪细胞增殖分化能力在高脂膳食诱导肥胖及运动预防肥胖过程中均增强,但其作用及机制皆不同。高脂膳食诱导肥胖过程中前脂肪细胞增殖分化能力的增强可使脂肪细胞数目增多,是机体为适应体脂增多的代偿机制;运动预防肥胖过程中前脂肪细胞增殖分化能力的增强可促进脂肪细胞更新,并使脂肪细胞平均体积缩小,是脂肪细胞贮脂能力改善的适应机制。     

糖皮质激素对DKK1基因调控骨髓间充质干细胞增殖分化的影响

目的 观察不同浓度糖皮质激素刺激下骨髓间充质干细胞(BMSCs)中DKK1基因表达的变化及其对BMSCs增殖分化能力的影响.方法 分离培养人BMSCs,分为对照组[不含地塞米松(Dex)]、Dex8组(含10-8mol/L Dex)及Dex6组(含10-6mol/L Dex).分别用含0、10-8、10-6mol/L Dex培养液刺激BMSCs,采用Real-time PCR检测DKK1基因的表达量,并通过克隆形成实验检测其对BMSCs增殖能力的影响.分别用含0、10-8、10-6mol/L Dex的成骨诱导液及成脂诱导液刺激BMSCs,于3d后提取RNA,采用Real-time PCR检测DKK1基因、成骨基因(Runx2、OCN)及成脂基因(C/EBP、PPARγ)的表达量,并于3周后通过茜素红染色及油红O染色检测其对成骨、成脂分化能力的影响.结果 与对照组及Dex8组比较,Dex6组DKK1基因的表达最高,而对应的克隆形成能力最低.成骨诱导环境下,Dex8组Runx2、OCN的表达最高,而DKK1的表达最低,茜素红染色只有Dex8组出现钙化结节.成脂诱导环境下,Dex6组C/EBP、PPARγ及DKK1的表达最高,油红O染色Dex6组出现大量的脂滴.结论 高浓度糖皮质激素刺激下,DKK1表达上调,BMSCs增殖受抑.DKK1对BMSCs的骨向分化具有抑制作用,而对其脂向分化具有促进作用.糖皮质激素导致骨质疏松可能与其调控DKK1的表达、影响BMSCs的增殖和分化有关.     

低能量激光照射对脂肪源性干细胞临床治疗潜能影响的实验研究

目的 观察镓铝砷(GaAlAs)激光对脂肪源性干细胞(ADSCs)增殖、细胞因子分泌及成脂分化能力的影响,探讨临床治疗过程中提高ADSCs治疗效果的有效方法.方法 取来自腹部脂肪抽吸术女性患者的脂肪组织,分离ADSCs,建立人脂肪源性干细胞(hADSCs)培养体系;用650nm波长GaAlAs激光以不同能量(2、4、8J/cm2)对hADSCs进行照射.采用MTT法检测hADSCs的增殖能力,ELISA法检测hADSCs的分泌功能,实时定量PCR法检测细胞表型的变化,油红O染色检测激光照射对hADSCs成脂分化能力的影响.结果 MTT法检测结果显示:照射后第4、6天时2J/cm2照射组吸光度值与对照组无明显差异(P＞0.05),4、8J/cm2照射组吸光度值与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05),其中4J/cm2照射组吸光度差异最为明显.ELISA法检测结果显示:4J/cm2照射组上清液中血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子β(TGF-β)的蛋白含量分别为287.5±15.2pg/ml、36.0±0.7ng/ml、292.6±10.5pg/ml,明显高于对照组(分别为145.3±21.6pg/ml、26.7±0.6ng/ml、130.6±6.0pg/ml),差异有统计学意义(P＜0.05).荧光定量PCR检测结果显示:经4J/cm2 GaAlAs激光照射后hADSCs中细胞表面标记物CD13、CD29、CD44、CD90 mRNA的相对表达量分别为对照组的1.19、22.05、4.38、7.22倍,两组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).油红O染色显示,经GaAlAs激光照射后hADSCs的成脂分化能力明显高于对照组.结论 低能量激光照射可增强ADSCs的增殖、分泌及成脂分化能力,可能有助于提高其临床治疗效果,是一种简便、安全、有效的方法.     

普通饮食诱导的肥胖倾向和肥胖抵抗倾向大鼠胃组织和血浆ghrelin的研究

目的:探讨大鼠胃组织和血浆ghrelin表达水平对普通饲料诱导的肥胖倾向(obesity-prone,OP)与肥胖抵抗倾向(obesity-resistance-prone,ORP)形成的作用。方法:16只健康雄性Wistar大鼠,普通饲料(脂肪供能比为14.8%)喂养10周后,根据其腹脂/体重比值大小选入OP组与ORP组,每组7只。记录体重和摄食量,测定内脏脂肪含量和空腹血糖、血脂、血胰岛素和血浆ghrelin水平,以及胃组织ghrelin蛋白表达水平。结果:OP组大鼠体重增量、能量利用率、内脏脂肪含量明显高于ORP组(P<0.01);与ORP组大鼠相比,OP组血糖、甘油三酯、胰岛素水平显著升高(P<0.05),血浆ghrelin水平有降低趋势(P=0.14);OP组大鼠胃组织ghrelin表达显著高于ORP组(P<0.01);大鼠胃组织ghrelin表达水平与体重增量、能量利用率、肾周与睾周脂肪、空腹血糖呈正相关关系(P<0.05),与胰岛素敏感指数呈负相关关系(P<0.05)。结论:胃组织ghrelin表达水平较高或较低很可能是大鼠形成OP或OPR的重要影响因素。     

全身垂直振动对去卵巢骨质疏松大鼠骨髓细胞分化的调节作用

目的:观察全身垂直振动对去卵巢骨质疏松大鼠骨髓细胞分化的调节作用.方法:将36只3月龄雌性未孕SD大鼠按体重分层后随机分为假手术、去卵巢静止和去卵巢振动3个组.去卵巢手术后10周,去卵巢振动组大鼠经过1周适应振动治疗后,开始接受正式全身垂直振动治疗,每次振动15 min、频率为90 Hz,每天振动2次,每周7次.治疗7周时,用721分光光度计检测血清碱性磷酸酶和甘油三酯水平;常规HE染色观察左侧胫骨组织形态学;收集右侧股骨和胫骨骨髓细胞,一部分细胞用作碱性磷酸酶和油红O染色,另一部分细胞用作尼罗红(Nile Red)染色.结果:与假手术组比较,去卵巢静止组骨髓细胞碱性磷酸酶阳性染色细胞数目显著降低,而骨髓细胞Nile Red阳性染色细胞百分比和胫骨骨髓脂肪空泡数目显著增加;与去卵巢静止组比较,去卵巢振动组骨髓细胞碱性磷酸酶阳性染色细胞数目显著增加,而骨髓细胞Nile Red阳性染色细胞百分比和胫骨骨髓脂肪空泡数目显著下降.结论:全身垂直振动不仅增加去卵巢骨质疏松大鼠骨髓细胞的成骨分化能力,而且降低去卵巢骨质疏松大鼠骨髓细胞的成脂分化能力.     

高脂饲料诱导的肥胖倾向和肥胖抵抗倾向大鼠内脏脂肪visfatin和AMPK表达及其相互关系

目的:探讨大鼠内脏脂肪组织visfatin和AMPK的表达对肥胖倾向(OP)和肥胖抵抗倾向(ORP)形成的可能作用。方法:20只雄性Wistar大鼠,高脂饲料喂养10周,依据腹脂/体重比值选大鼠进入OP和ORP两组,每组各7只,测定大鼠血脂、血糖、血浆胰岛素和visfatin浓度,肾周脂肪组织中visfatin表达和AMPK活性。结果:与ORP组大鼠相比,OP组大鼠血浆visfatin浓度有升高趋势(P=0.16),肾周脂肪组织visfatin表达显著升高(P<0.05),而AMPK活性显著降低(P<0.05),内脏脂肪visfatin表达与AMPK活性之间存在负相关关系。结论:内脏脂肪组织中visfatin表达升高和AMPK活性降低可能与肥胖倾向有关。Visfatin可能通过负性调节AMPK活化程度影响肥胖倾向的发生。     

鸢尾素对兔骨髓间充质干细胞成脂分化的影响

 目的 探讨鸢尾素对兔骨髓间充质干细胞(bone-marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成脂分化的影响及其信号机制。方法 分离、培养兔BMSCs,检测鸢尾素对BMSCs增殖的影响。BMSCs成脂诱导后,实时荧光定量PCR(polymerase chain reaction,PCR)检测成脂相关基因PPARγ和C/EBPα的转录表达,油红O染色检测细胞内脂质形成情况,Western blot检测Wnt10a信号蛋白的表达。结果 鸢尾素不影响BMSCs的增殖活性;显著下调PPARγ[成脂诱导第7天,(0.20±0.06)vs(1.00±0.10);成脂诱导第14天,(0.61±0.06)vs(1.00±0.15)]和C/EBPα[成脂诱导第7天,(0.40±0.06)vs(1.00±0.12);成脂诱导第14天,(0.70±0.09)vs(1.00±0.18)]的表达,明显抑制BMSCs成脂分化[(0.45±0.05)vs(0.95±0.10);P<0.05];同时,鸢尾素明显促进Wnt10a表达[(5.01±0.78)vs(1.00±0.25);P<0.05]。结论 鸢尾素可抑制BMSCs脂向分化,其作用与激活Wnt信号通路有关。     

直接接触共培养技术在体外探索细胞间相互作用的应用研究

目的:建立观察直接接触共培养体系中单一种类细胞生长变化的研究方法,探索直接接触共培养技术在体外细胞之间相互作用研究中的应用。方法:大鼠软骨细胞与荧光标记的大鼠骨髓间充质干细胞以1∶2的比例平面共培养7天。共培养2天时,应用共聚焦显微镜观测共培养体系中两种细胞的增殖情况;共培养7天时,应用流式分选技术分选出单一种类细胞,然后分析其成软骨分化特异性基因的表达。结果:经过共培养后,骨髓间充质干细胞比例减少;共培养组中软骨细胞增殖率高于单独培养组;在共培养体系中骨髓间充质干细胞的成软骨分化趋势明显,但软骨细胞成软骨分化特异性基因表达下降。结论:本实验应用流式细胞术以及共聚焦显微镜技术成功检测了直接接触共培养体系中骨髓间充质干细胞和软骨细胞各自的细胞增殖与成软骨分化特异性基因的表达,明确了直接接触共培养技术可以有效地应用于体外细胞间相互作用的研究。     

骨髓间充质干细胞功能异常在雌激素所致骨质疏松发病中的作用研究

目的通过研究去势骨质疏松小鼠骨髓间充质干细胞（BMMSC）增殖及分化功能的改变,揭示其在骨质疏松发病中的作用。方法建立去势小鼠骨质疏松模型,检测BMMSC增殖和多向分化能力变化,采用反转录酶-聚合酶链反应（RT-PCR）和小核糖核酸（microRNA）芯片对骨质疏松BMMSC的分化相关基因和microRNA表达谱进行检测。结果在雌激素缺乏所致的骨质疏松中,BMMSC的增殖能力和成骨分化能力出现了一定的下降,而成脂分化能力却明显增强,同时发现一组分化功能相关基因及microRNA表达出现改变。结论 BMMSC的功能缺陷与骨质疏松的病理改变相一致,可能在骨质疏松发生中起到重要作用。而部分功能基因及microRNA的改变可能是导致BMMSC功能异常的分子机制。     

活性氧介导的铁过载对小鼠骨髓间充质干细胞的影响及其机制探讨

目的建立小鼠骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)铁过载(IO)模型,并对铁过载模型小鼠进行去铁及抗氧化治疗,探讨铁过载对小鼠BM-MSCs的损伤作用及活性氧(ROS)在该损伤中的作用机制。方法采用随机区组设计,将40只雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组、铁剂(右旋糖酐铁,25mg/ml)组(IO组)、铁剂+去铁治疗(DFX,125mg/kg)组(Fe+DFX组)、铁剂+抗氧化治疗(NAC,40mmol/L)组(Fe+NAC组),每组10只。从小鼠密质骨中分离BM-MSCs培养至P1代,检测BM-MSCs内铁颗粒、不稳定铁(LIP)及ROS水平;利用倍增时间及CCK-8试剂盒检测BM-MSCs增殖情况;采用碱性磷酸酶染色(ALP)、茜素红染色、成骨分化基因检测等方法评估BM-MSCs成骨分化能力;采用油红O染色检测BM-MSCs成脂定向分化能力。结果与对照组相比,铁剂组BM-MSCs内存在明显铁颗粒,LIP及ROS水平明显增高(P<0.05),倍增时间明显延长(2.07±0.14d vs 1.03±0.07d,P<0.01)。DFX组及NAC组倍增时间较铁剂组有所缩短,分别为1.52±0.07d与1.68±0.03d(P<0.05)。与对照组比较,铁剂组BM-MSCs矿化能力及向成骨细胞分化能力下降,成骨基因ALP、RUNX2、OSN表达增强,而成脂定向分化能力增强。在去铁及抗氧化治疗后,上述改变发生部分逆转。结论铁过载可影响小鼠骨髓MSCs的增殖及定向分化能力,其机制可能与铁过载所致ROS升高有关。     

阿伦膦酸钠对去势大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化的影响

目的 探讨阿伦膦酸钠(Alendronate,Aln)对骨髓间充质干细胞(BMSCs)成脂分化的影响,并阐明丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路在该过程中的作用. 方法 BMSCs取自9个月龄去势SD大鼠,分别暴露于0.01,0.1,1,10 μmol/L Aln.成脂诱导2周后进行油红O染色和镜下计数分析,RT-PCR检测过氧化物酶体增殖体激活受体γ2(PPARγ2)表达;使用MAPK通路特异性抑制剂并诱导2周后再观察PPARγ2表达情况,Western blot观察Aln对MAPK通路表达的影响. 结果 BMSCs成脂诱导2周后,油红O染色阳性细胞数随着药物浓度的增高而显著减少(P<0.01).PPARγ2表达随着药物浓度的增高而显著降低.分别使用ERK1/2、JNK抑制剂PD98059和SP600125并诱导2周后,PPARγ2表达上调;使用p38抑制剂SB203580并诱导2周后,PPARγ2表达下调.Western blot结果显示,Aln在5,15,30 min时上调P-ERK1/2和P-JNK的表达,分别使用抑制剂后,表达下调. 结论 Aln通过激活ERK1/2和JNK信号通路,而不是p38,发挥抑制去势大鼠来源的BMSCs成脂分化作用,其效应具有浓度依赖性.     

骨形成蛋白-2和地塞米松对骨髓基质细胞的联合生物学效应

探讨重组人骨形成蛋白－2（rhBMP-2）的地塞米松（Dex）单独和联合作用对骨髓基质细胞（BMSC）增殖和分化的影响。利用四唑盐比色法（MTT）、细胞总蛋白考马斯亮蓝测定法及碱性磷酸酶（ALP）检测试剂盒分别测定不同浓度的rhBMP-2和Dex单独和联合作用后BMSC的增殖和分化情况。结果显示,rhBMP-2对BMSC的增殖和ALP的表达均有促进作用,Dex促进ALP的表达,但高浓度的Dex对BMSC有增殖抑制,rhBMP-2和Dex联合作用后BMSC的增殖和ALP活性较单独作用有更明显的作用。提示 rhBMP-2和Dex联合作用对于促进BMSC的增殖和向成骨细胞分化有协同作用。     

骨髓间充质干细胞经肾动脉途径不同移植次数对大鼠阿霉素肾病的修复作用比较

目的 比较分析骨髓间充质干细胞(BMSC)经肾动脉途径单次或多次移植于阿霉素肾病大鼠后对其肾功能的改善作用.方法 以阿霉素经尾静脉输入构建大鼠慢性肾病模型32只,随机分为M0、M1、M2、M3组(4×n,n=8),另选8只为正常对照组(N组).以2×106个/ml、单次0.5 ml分别移植BMSC细胞0次(M0组)、1次(Ml组)、2次(M2组)、3次(M3组),不进行BMSC移植组别每次操作以L-DMEM培养基0.5 ml作为安慰剂对照,移植间隔为1周.移植前及末次移植后1、2周末检测大鼠血尿素氮、血肌酐、24 h尿蛋白、24 h尿微量蛋白,末次移植l周末制作病理片并于激光聚焦显微镜下观察大鼠肾脏病理和BMSC细胞在肾脏内分布情况.结果 M0、M1、M2、M3组在各观察点血尿素氮、血肌酐、24 h尿蛋白总量、24 h尿微量蛋白均明显高于N组(P＜0.001),末次移植第1周末M2、M3组24 h尿蛋白总量、24 h尿微量蛋白明显低于M1组(P＜0.05),M2、M3组间差异无统计学意义(P=0.063).结论 BMSC经肾动脉途径移植2次治疗大鼠阿霉素肾病效果最宜.     

红细胞生成素(EPO)对脑源性神经干细胞增殖与分化的调控作用

目的探讨红细胞生成素(EPO)对大鼠海马神经干细胞(NSCs)体外增殖和分化的影响。方法利用无血清培养、单细胞克隆技术,体外培养SD大鼠海马组织源NSCs,在NSCs增殖和分化过程中添加不同剂量EPO,以免疫细胞化学方法对NSCs及其分化后的细胞进行鉴定。结果与对照组相比,不同接种密度条件下的NSCs加入EPO后,增殖期表达Nestin的细胞增加2～4倍,分化期表达Nestin的细胞数明显减少;表达Tuj1和GFAP的细胞出现早,且Tuj1阳性细胞较对照组明显增加(P<0.05),加入antiEPO后Tuj1阳性细胞较对照组明显减少(P<0.01);相同细胞接种密度下,添加不同剂量EPO后Tuj1阳性细胞数呈剂量依赖性增加。结论EPO可促进大鼠海马源NSCs的增殖,并使其呈剂量依赖性的向神经元分化。     

Wnt3a蛋白诱导BMSC定向分化并促进大鼠创面修复的实验研究

目的在细胞水平和动物模型整体层面观察Wnt3a诱导BMSCs定向分化并促进大鼠皮肤软组织缺损创面修复的过程。方法选取清洁级SD大鼠80只,雄性,3周龄,体重40~50g。全骨髓贴壁分离法获取大鼠骨髓来源间充质干细胞,所获取细胞经免疫荧光染色鉴定为干细胞。体外扩增后分为对照组及Wnt3a组,对照组用普通DMEM培养基培养,Wnt3a组以DMEM+Wnt3a信号通路激动剂Wnt3a(终浓度为200μg/L)培养。分别通过qRT-PCR和免疫荧光检测血管内皮细胞,周细胞及平滑肌细胞相关标志物的表达,验证Wnt3a在体外对BMSCs的诱导分化作用,并利用大鼠全层皮肤缺损模型作为研究对象,观察BMSC与Wnt3a联合应用对创面修复的促进作用。结果 RT-PCR的结果显示,Wnt3a组在加入Wnt3a激动剂培养7d以后,BMSCs的干细胞相关分子Klf4,Oct4表达水平相比对照组有相应下降(0.732±0.048,0.591±0.097,倍比数,P0.001),证实BMSCs发生了相应的分化行为。其中NG2、VEGF、CD31及α-SMA在Wnt3a组mRNA表达显著增高(P0.001)。整体动物水平,BMSC+Wnt3a联合应用组大鼠创面愈合率、肉芽组织形成及评分、创面成熟度及再血管化程度均高于空白对照组(P0.001)。RT-PCR结果显示代表创面修复所需关键细胞的标志物(NG2、VEGF、CD31及α-SMA)mRNA表达水平明显高于空白对照组(P0.01)。结论本研究通过体外及体内实验证实,利用Wnt信号途径激动剂的经典蛋白Wnt3a与BMSC共培养,能够提高干细胞活性,发挥其再生特性,并能够诱导前者定向分化为皮肤修复相关的关键细胞,因而加速肉芽组织重建和再生,最终促进创面愈合,为临床上BMSCs移植修复大面积皮肤软组织缺损提供了新的思路。     

经骨髓间充质干细胞诱导分化的神经样细胞对大鼠脊髓损伤的修复作用

 目的 探讨经骨髓间充质干细胞诱导分化的神经样细胞对大鼠脊髓损伤的修复作用。方法 提取、培养和扩增骨髓间充质干细胞后,在体外诱导分化为神经样细胞。大鼠脊髓损伤造模后,分别进行神经样细胞、骨髓间充质干细胞及无细胞悬液移植,每组18只。术后采用BBB评分及斜板实验观察3组大鼠的运动功能恢复情况。结果 体外诱导骨髓间充质干细胞后,经免疫组化染色发现具备神经细胞特征。术后6周,BBB评分方面,实验组(16.56±2.42)优于阳性对照组(13.70±2.66),后者又优于阴性对照组(8.37±2.35)。Rivlin斜板实验评分方面,实验组术后2、4、6周,均优于阳性对照组,后者又均优于阴性对照组。实验组术后可见较多的神经纤维,结构完整,优于阳性对照组及阴性对照组。结论 体外诱导骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化后,移植治疗大鼠脊髓损伤具有良好效果。
     

高糖对外周血内皮祖细胞数量和功能的影响

目的　观察高糖对外周血内皮祖细胞(EPCs)数量和功能的影响。方法　密度梯度离心法获取外周血单个核细胞 ,培养 7天后 ,收集贴壁细胞并加入不同浓度葡萄糖使培养液终浓度分别为 1 5、2 5、35和 4 5mmol/L ,并干预一定时间 (6、1 2、2 4和 4 8h)。多波长激光共聚焦显微镜鉴定FITC UEA Ⅰ和DiI acLDL双染色细胞为正在分化的EPCs,流式细胞仪检测其表面标志进一步鉴定EPCs,倒置荧光显微镜下计数。然后 ,分别采用MTT比色法、改良的Boyden小室、黏附能力测定实验和体外血管生成试剂盒分别观察EPCs的增殖、迁移、黏附和体外血管生成能力。结果　高糖呈量效和时效地减少外周血EPCs数量 ,4 5mmol/L浓度高糖作用 2 4h对EPCs数量的影响最为显著 (较对照组减少了近 1 / 2 ,P <0 0 1 )。高糖也显著抑制外周血EPCs的黏附、迁移、增殖和体外血管生成能力。结论　高糖可减少EPCs数量、抑制其功能 ,并呈浓度和时间依赖性