卵巢癌细胞中乳源免疫调节肽受体蛋白的筛选

目的乳源免疫调节肽(PGPIPN)在人卵巢癌细胞株(SKOV3)上进行受体蛋白的筛选。方法异硫氰酸荧光素(FITC)标记PGPIPN,作用于SKOV3观察其细胞定位;从SKOV3中提取作用部位的蛋白;通过NHS-activated亲和层析柱进行分离和纯化受体蛋白质,SDS-PAGE的初步鉴定。结果在激光扫描共聚焦显微镜下观察荧光标记肽结合于SKOV3的胞膜上。通过提取膜蛋白和亲和层析法成功筛选了受体膜蛋白。结论 PGPIPN的作用位点位于细胞膜上,其抗癌作用可能通过胞膜结合蛋白而启动信号转导通路,为进一步探讨其抗癌机制奠定基础。     

Screening of immunomodulating peptide receptor protein from human ovarian carcinoma cells

目的 乳源免疫调节肽(PGPIPN)在人卵巢癌细胞株(SKOV3)上进行受体蛋白的筛选.方法 异硫氰酸荧光素(FITC)标记PGPIPN,作用于SKOV3观察其细胞定位;从SKOV3中提取作用部位的蛋白;通过NHS-activated亲和层析柱进行分离和纯化受体蛋白质,SDS-PAGE的初步鉴定.结果 在激光扫描共聚焦显微镜下观察荧光标记肽结合于SKOV3的胞膜上.通过提取膜蛋白和亲和层析法成功筛选了受体膜蛋白.结论 PGPIPN的作用位点位于细胞膜上,其抗癌作用可能通过胞膜结合蛋白而启动信号转导通路,为进一步探讨其抗癌机制奠定基础.     

人食管癌Eca-109细胞膜蛋白的分离和纯化

目的:建立人食管癌Eca109细胞系膜蛋白分离和初步纯化方法。方法:使用改良的Neville法提取细胞膜,在pH6.3的条件下,用去垢剂TritonX100和辛基β葡糖苷把细胞膜上的蛋白溶解下来,以超滤法纯化膜蛋白并分组。结果:在pH6.3的条件下,适当的去垢剂与膜蛋白质量之比使用去垢剂辛基β葡糖苷时为61;使用TritonX100时为21。超滤法将膜蛋白分为相对分子质量<3000、3000～10000、<10000、10000～30000、30000～100000、>100000共6个组分。结论:获得适当的去垢剂与膜蛋白质量比,并获得了不同的膜蛋白组分,为进一步研究人食管癌Eca109细胞肿瘤抗原奠定了基础。     

非液相等电聚焦蛋白质分离技术获取人热休克蛋白-多肽复合物

目的：利用非液相等电聚焦蛋白质分离技术（FS-IEF）从肝细胞癌（HCC）患者的癌组织的裂解液内提纯热休克蛋白多肽复合物（HSP-PCs）。制备热休克蛋白（HSP）肿瘤疫苗。方法：制备HCC细胞蛋白,经等电聚焦蛋白质分离获得目的蛋白,SDS-PAGE电泳和Western-Blot鉴定为热休克蛋白多肽复合物。利用紫外吸收法测定其浓度。结果：利用FS-IEF从HCC肿瘤细胞裂解液中成功分离提纯出HSP-PCs,分离的富含分子伴侣的细胞裂解物（CRCL）经鉴定为CRT、HSgpP96、HSP90和HSP70。这些分子伴侣蛋白沿pH梯度集中分布于4～7号收集管中,pH跨度为4.4～5.2。1g肝癌组织经液相等电聚焦分离后可产生1000μg的热休克蛋白疫苗。结论：通过非液相等电聚焦蛋白质分离技术可获得纯化的所需量的HSP-PCs。     

SILAC技术研究DNP对鼻咽癌细胞株6-10B蛋白质组的影响

目的应用细胞培养稳定同位素标记技术(SILAC)结合生物质谱分析的方法,分析二亚硝基哌嗪(DNP)对6-10B细胞蛋白质表达的影响,并鉴定与转移相关的蛋白质。方法利用SILAC标记6-10B细胞,得到"重标"的6-10B细胞,经DNP处理24 h后提取细胞总蛋白,与未经DNP处理的"轻标"细胞中提取的总蛋白等量混合,酶解肽段,经正交反相色谱分离后用质谱鉴定,对数据进行定性和定量分析。结果共鉴定到2 853个蛋白质,其中172个表达上调,199个表达下调。筛选其中5个与肿瘤转移相关的蛋白质,进行Western blotting验证,证明SILAC定量结果的正确性。通过GO进行分析,从生物过程、细胞定位和分子功能3个方面对差异蛋白进行注释。结论建立了利用SILAC技术研究宿主细胞-化学药物相互作用的方法,发现了DNP处理细胞的关键蛋白质,为探索DNP致鼻咽癌转移的分子机理提供了实验基础。     

卵巢癌细胞中乳源免疫调节肽受体的筛选、鉴定及其功能的初步研究

目的利用乳源免疫调节肽(PGPIPN)在人卵巢癌细胞株(SKOV3)进行受体的筛选、鉴定及其功能的初步研究。方法在激光共聚焦显微镜下,用异硫氰酸荧光素(FITC)标记PGPIPN,作用于SK-OV3,观察其细胞定位;培养SKOV3细胞,从中提取PGPIPN的受体或作用位点蛋白;PGPIPN作为亲和层析的配基,通过NHS-activated亲和层析柱进行分离和纯化受体;真空冷冻干燥仪浓缩蛋白;SDS-PAGE初步验证筛选结果;经电喷雾质谱法及生物信息学对条带蛋白进行测序和分析;荧光标记肽与受体的结合试验,验证受体和PGPIPN的结合性;利用MTT法将一定浓度的PGPIPN和不同浓度的受体与卵巢癌细胞共孵育,观察对细胞增殖/凋亡可能产生的影响。结果在激光扫描共聚焦显微镜下观察荧光标记肽结合于SKOV3的胞膜上;通过提取膜蛋白和亲和层析法成功筛选了特异性结合的受体;通过电喷雾质谱法初步确定性质相似、功能相关蛋白,可能为ATP合酶、basigin等;荧光标记肽与受体的结合试验验证了受体的特异性;MTT结果显示:在不加受体时,PGPIPN能抑制SKOV3增殖,当PG-PIPN、受体与卵巢癌细胞共孵育时,PGPIPN抑制SKOV3增殖明显减弱(P<0.05,P<0.01)。结论PGPIPN能抑制SKOV3的增殖并诱导细胞凋亡的作用位点位于细胞膜上,其抗癌作用可能通过胞膜结合蛋白而启动信号转导通路,为进一步探讨其抗癌机制奠定了基础。     

建立BioID-质谱联用技术筛选细胞内蛋白质相互作用

目的 通过BioID-质谱联用技术建立一种新的蛋白质相互作用的筛选系统,并采用免疫共沉淀-蛋白质印迹法验证与Yes相关蛋白1(YAP1)相互作用的蛋白质.方法 构建YAP1-BirA*融合表达质粒,将质粒转染进293T细胞后,在细胞培养基中加入50μmol/L生物素,继续培养24 h后提取细胞总蛋白质.利用YAP1特异抗体,采用蛋白质印迹法检测YAP1-BirA*融合蛋白的表达.利用HRP偶联的亲和素检测细胞内蛋白质被生物素标记的水平.通过亲和素磁珠对细胞内生物素化的蛋白质进行亲和纯化,多次洗涤去除亲和素磁珠上非特异性结合的蛋白质后对亲和素磁珠纯化的蛋白质进行溶解.取40μg总蛋白行SDS-PAGE,然后采用蛋白质银染试剂盒对凝胶中的蛋白质进行染色,确定亲和素磁珠对生物素化蛋白的纯化效果.用非标记定量质谱法鉴定生物素化的蛋白质.针对鉴定得到的蛋白质,采用蛋白质印迹法对生物素化的SMAD家族成员3(SMAD3)进行验证.通过YAP1的免疫共沉淀-蛋白质印迹法确定SMAD3能否与YAP1相互作用.结果 成功构建YAP1-BirA*融合表达质粒,该质粒在293T细胞中能够高效表达融合蛋白.在生物素存在的情况下,YAP1-BirA*融合蛋白能够利用生物素标记细胞内与YAP1-BirA*融合蛋白邻近的蛋白质.在细胞裂解后,这些在细胞内被生物素标记的蛋白质能够被偶联亲和素的磁珠纯化,经过多次洗涤,能够富集生物素标记的蛋白质.质谱鉴定显示,能够获得细胞内与YAP1在空间上相互靠近的蛋白质.免疫共沉淀-蛋白质印迹法结果证明SMAD3蛋白能与YAP1相互作用.结论 BioID-质谱联用方法是一种能用于蛋白质相互作用筛选的简单、高效技术,与免疫共沉淀-蛋白质印迹法联合使用可以成为一种新的蛋白质相互作用研究体系.     

重组离子通道特性的研究

<正> 离子通道是细胞膜上具有重要功能的特殊蛋白质分子,它对不同的离子有选择性通透能力,参与离子在细胞膜内外的交换,离子通道与生物体内许多生理过程如肌肉收缩、细胞运动、分泌、代谢、分化及免疫等密切相关。现已发现除了可兴奋细胞外,一些非可兴奋细胞如淋巴细胞细胞膜中也有离子通道。对离子通道进行研究的主要方法有:细胞培养,研究培养细胞膜通道的功能和特性;分离、纯化和鉴定通道蛋白并研究其特性;将分离纯化得到的膜通道蛋白质进行人工重组,利用分子生物学和分子遗传学方法研究膜通道蛋白质。70年代初,Racker等进行了离子传运系统重组的研究工作,曾成功地将线粒体ATP驱动的质小泵重组到小脂囊泡中,为Ach受体通道的研究开辟了     

肌层浸润性膀胱癌的间质蛋白表达谱研究

目的 系统生物学层面探讨肌层浸润性膀胱移行细胞癌间质蛋白表达谱的特点,并探寻膀胱肿瘤的生物学特性及生物标记组发现.方法 ①激光捕获显微切割获得纯化的浸润性膀胱移行细胞癌间质细胞/正常间质细胞.②二维液相色谱分离多肽混合物,电喷雾串联质谱鉴定蛋白质.③生物信息学方法分析鉴定蛋白质.④GO对蛋白质表达特点进行总体描述.⑤差异表达蛋白质生物通路分析.⑥候选生物标记物的统计学分析.结果 4例配对癌间质/正常间质标本中共表达蛋白868/872个,差异表达蛋白978个.487/491个蛋白特异表达于癌间质/正常间质标本中.与整个IPI数据库中的蛋白质比对,生物学途径中42/42个GO术语为浓集表达,8/5个GO术语为缺失表达.显著改变的生物通路主要包括代谢通路、核糖体、聚合粘附等.描述统计学证实极性分子以及大分子蛋白有同样的概率成为生物标记.结论 该研究结果表明,间质细胞是肿瘤的必要组分,生物标记的发现及网络化多靶点治疗应该将肿瘤细胞本身及其相应的间质作为统一的整体进行研究.     

膀胱癌T-24细胞系中细胞角蛋白20的分离纯化及鉴定

目的分离纯化细胞角蛋白20(Cytokeratin20,CK20)并加以鉴定,为进一步研制抗CK20单克隆抗体奠定基础。方法培养人膀胱肿瘤T-24细胞系并用免疫组化检测CK20表达,然后大量培养并收集细胞,超声波细胞粉碎后,先用萃取、高速离心、透析等方式进行蛋白初分离,然后利用以DE52为介质的阴离子交换层析分离纯化CK20蛋白,以电泳示踪,最后采用SDS-PAGE、HLPC和Western-blotting加以鉴定。结果在阴离子交换层析时出现3组洗脱峰,CK20主要存在第二组峰中,该峰在SDS-PAGE和Western—blotting上均呈现单一条带,HLPC分析显示CK20蛋白主峰呈正态分布,仅处一个较低峰度的蛋白质杂峰。结论该纯化方法简便、可行、效果好、获得的蛋白纯度高,提取的蛋白可确认为CK20并且具有较高的免疫生物活性。     

顺铂与癌细胞膜相互作用的电子自旋共振自旋标记研究

本文使用马来酰亚胺自旋标记技术研究抗癌药物顺铂与小鼠L1210白血病细胞和艾氏腹水肝癌细胞膜的相互作用,表明顺铂可以作用于癌细胞膜影响膜巯基结合部位。提示顺铂作用使癌细胞膜表面蛋白质构象改变。     

HL-60细胞诱分化及细胞膜恶性标志逆转的实验研究

本文采用荧光偏振技术和受体荧光定量测定法,动态观察DMSO(二甲亚砜)体外诱导人急性早幼粒白血病细胞系(HL-60细胞)沿粒系统成熟分化过程中细胞膜流动性及膜ConA受体结合量的改变,还测定Molt4和Raji淋巴瘤细胞膜的相应变化.结果表明,随分化细胞百分率增加膜流动性和ConA受体结合量降低,呈现有意义的逆转改变(P<0.01).二株淋巴瘤细胞膜的流动性和ConA受体结合量均明显高于正常淋巴细胞。实验结果证实了膜流动性增高及ConA受体结合量增加是HL-60细胞的膜表型特征,并能随恶性细胞的诱导分化而逆转。     

Asparagine synthetase is partially localized to the plasma membrane and upregulated by L-asparaginase in U937 cells

This study investigated the intracellular localization of asparagine synthetase (ASNS) in the relation with chemoresistance in leukemia. pIRES-GFP-ASNS-Flag/Neo expression vector was transiently tansfected into SK-N-MC cells and 297T cells respectively. Immunofluorescence and Western blot analysis were performed for cellular localization of ASNS respectively. U937 cells were treated with L-asparaginase for 48 h and examined for endogenous ASNS expression on plasma membrane by immunofluorescence staining. Immunofluorescence staining showed that the transiently expressed ASNS was partly localized on transfected-SK-N-MC cell surface. Moreover, Western blotting exhibited that ASNS expressed both in cytosol and on plasma membrane of transfected-293T cells. Immunofluorescence staining with anti-ASNS-specific monoclonal antibody revealed that endogenous ASNS was localized on the plasma membrane of U937 cells, except for its distribution in the cytosol. In addition, ASNS exhibited a higher expression on plasma membrane after treatment with L-asparaginase as compared with the untreated cells. It was concluded that the subcellular translocation of ASNS may play an important role in L-asparaginase resistance in leukemia cells.     

缺氧对细胞膜ABCA1降解的影响及其机制研究

摘要：目的  探讨缺氧对细胞膜三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ABCA1）降解的影响及其与钙蛋白酶的相关机制。方法  肝X受体激动剂TO-901317刺激RAW264.7细胞24 h,实时定量聚合酶链反应检测ABCA1 mRNA表达水平。生物素标记法提取细胞膜蛋白,Western blot检测细胞膜ABCA1蛋白水平表达。Western blot检测在放线菌酮存在或不存在条件下,TO-901317干预的RAW264.7细胞经过12 h缺氧（1%氧气O2）处理后细胞膜ABCA1蛋白水平,Suc-LLVY-氨基虫荧光素法检测缺氧细胞内钙蛋白酶活性。RAW264.7细胞给予钙蛋白酶抑制剂ALLN干预,检测细胞膜ABCA1蛋白表达及钙蛋白酶活性。结果  TO-901317上调ABCA1 mRNA及细胞膜蛋白水平表达。无论放线菌酮存在或不存在情况下,缺氧均能降低细胞膜ABCA1蛋白水平,升高钙蛋白酶活性。钙蛋白酶抑制剂ALLN能部分逆转缺氧诱导细胞膜ABCA1蛋白水平降低。结论  缺氧可能通过增加钙蛋白酶活性,从而加速细胞膜ABCA1蛋白降解。

     

龙葵碱对H22荷瘤小鼠细胞膜流动性和膜蛋白水平的影响

目的观察龙葵碱对H22荷瘤小鼠肿瘤细胞膜流动性和膜蛋白水平的影响。方法采用荧光探针DPH标记法测定肿瘤细胞膜流动性，考马斯亮蓝法测定肿瘤细胞膜蛋白水平。结果龙葵碱可显著降低H22荷瘤小鼠肿瘤细胞膜流动性，降低H22小鼠肿瘤细胞膜蛋白水平。结论龙葵碱是通过影响肿瘤细胞膜的流动性和肿瘤细胞膜上的蛋白水平恢复细胞的正常生理活性而达到抗肿瘤作用。     

缺血再灌注兔心肌细胞质膜渗透性的改变及其钙通道阻滞剂对它的影响

应用镧离子示踪法于透射电镜下观察了缺血再灌注兔心肌细胞质膜渗透性的改变及其钙通道阻滞剂对它的影响。正常心肌中镧离子存在于细胞外间隙;缺血30min时超微结构改变呈可逆性,镧进入细胞并粘附于线粒体膜外面;再灌注后超微结构损伤呈不可逆性,镧进入线粒体内;再灌注前给以异搏停,再灌注损伤明显改善,线粒体内镧颗粒消失;缺血前给以异搏停,细胞膜和超微结构保存较好,细胞内镧基本消失。实验提示缺血再灌注心肌细胞中,细胞膜渗透性改变先于细胞的不可逆性损伤,而细胞膜渗透性改变又早于细胞器膜,无论是在缺血前还是于再灌注前给以导搏停,对质膜结构和功能均有一定的保护作用。     

Morphological Study on the Mechanism of Tumor-selective Cytocidal Action of Tumor Necrosis Factor

Using light microscopy and electron microscopy, we observed the morphological changes inheuman hepatocellular carcinoma cell line (SMMC-7721) treated with tumor necrosis tumor necrosis factor (TNF)and the cytocidal effect of TNF on the heterotransplanted human hepatocellular carcinoma. It wasfound that the changes of the injury occurred earlier in the cell membranes than in the nuclei duringthe course of TNF killing of SMMC-7721 cells and there were similar lesions around the necroticarea in the heterotransplanted human hepatocellular carcinoma in the nude mice as compared withthose produced in SMMC-7721 cells. In addition, the determination of the DNA content in TNF-treated SMMC-7721 cells and controls revealed no significant difference between them. On the basisof these results and Darzynkiewicz's proposals, it is suggested that TNF exerts its tumor-selectivekilling effect by binding to a specific to a specific plasma membrane receptor to disturb synthesis or assembly ofcell membrane components, thus causing the plasma membrane injury and finally cell lysis.     

二甲基甲酰胺诱导艾氏腹水型癌细胞膜表面蛋白多糖的电镜观察

用 Ehrlich 腹水癌细胞为肿瘤模型,利用电镜细胞化学方法研究了二甲基甲酰胺对 Ehrlich 腹水癌细胞分化诱导作用,观察了癌细胞表面微绒毛及蛋白多糖的变化。结果表明,Ehrlich 腹水癌细胞在二甲基甲酰胺分化诱导下,细胞表面微绒毛减少或变短,同时细胞表面微绒毛区和非微绒毛区的蛋白多糖也有不同程度的减少。     

猪鼻支原体抗原在人结肠腺癌细胞表达的研究

目的 :通过研究猪鼻支原体 (Mhy)相关抗原在人肿瘤细胞的表达情况 ,以初步探讨Mhy与肿瘤的关系。方法 :通过培养Mhy提取其抗原 ,免疫家兔后获得其特异性抗血清 ,然后使用链霉亲和素 生物素过氧化物酶(SABC)方法 ,检测 32例人结肠腺癌和 5例胚胎不同组织细胞标本。结果 :Mhy相关抗原在 2 9例癌细胞胞膜及胞浆中有表达 ,在癌周正常组织细胞和胚胎细胞无表达 ,阳性率 90 .6 %。结论 :人某些恶性肿瘤细胞胞浆及胞膜存在Mhy相关抗原 ,作为一种新的肿瘤标志物用于恶性肿瘤的检测以及在研究支原体与人恶性肿瘤的关系方面具有一定的理论和实际意义。