CTGF siRNA联合电针治疗对大鼠损伤脊髓星形胶质细胞GFAP表达的影响

目的:探讨抗CTGF小干扰RNA(small interferon RNA,siRNA)局部注射联合电针治疗对脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达的影响。方法:将SD大鼠随机分为SCI组、CTGF siR-NA干扰(CTGF)组、CTGF siRNA干扰联合电针(EA+CTGF)组。制作大鼠SCI模型,将含有CTGF siRNA/Invivo-fectamine复合物溶液的明胶海绵移植入CTGF组和EA+CTGF组大鼠的脊髓(T10)损伤断端,SCI组用Invivo-fectamine转染试剂代替。EA+CTGF组在模型制备后每天的固定时间给予电针治疗。各组在3 d、7 d、14 d后分别取材,应用免疫荧光组织化学、Western Blot和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)观察星形胶质细胞的形态、数量和GFAP、GFAP mRNA表达变化。结果:SCI组星形胶质细胞反应性增生、胞体肥大,损伤边缘区形成GFAP强表达的胶质界膜;CTGF siRNA干预后,GFAP表达减弱,胞体减小,GFAP阳性细胞数减少;EA+CTGF组GFAP免疫反应表达明显降低,损伤边缘区GFAP荧光强度与脊髓其它区域基本相同。Western Blot结果显示:与SCI组相比,CTGF组与EA+CTGF组的GFAP均减少,有统计学意义(P<0.05),与CTGF组相比,EA+CTGF组的GFAP减少,有统计学意义(P<0.05);RT-PCR电泳结果表明损伤早期EA+CTGF组GFAP mRNA表达明显低于损伤组并有显著性差异(P<0.01),变化与Western Blot结果是一致的。结论:SCI后,CTGF siRNA联合电针治疗能有效阻止GFAP表达,使胶质反应减轻,有助于神经功能恢复。     

大鼠心肌细胞结缔组织生长因子的诱导表达及RNA干扰研究

目的：探讨心肌细胞对结缔组织生长因子（CTGF）的基础表达及转化生长因子β1（TGF-β1）对其分泌的诱导作用,并进一步研究以RNA干扰(RNAi)技术靶向抑制CTGF对下游纤维化因子的影响。方法:实验分为以下5组：组Ⅰ：单纯心肌细胞组;组Ⅱ：TGF-β1诱导组;组Ⅲ：阴性质粒组;组Ⅳ：RNAi组;组Ⅴ：脂质体组。分离培养SpragueDawley（SD）大鼠乳鼠心肌细胞,以5μg/L终浓度的TGF-β1对培养的心肌细胞进行诱导,再通过脂质体法将靶向大鼠CTGF的短发夹RNA(shRNA)干扰质粒转染入心肌细胞,流式细胞技术分选出成功转染的细胞。通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和免疫印迹（Westernblotting）技术进一步研究各实验组心肌细胞CTGF、纤维连接蛋白（FN）mRNA及蛋白的表达水平。结果:单纯心肌细胞组对CTGF、FN均有低水平的基础分泌,在予以TGF-β1诱导后表达水平显著升高（P＜0.01）;而在靶向特异性RNAi后,上述因子的表达均被显著抑制（P＜0.01）;并且纤维化因子FN的表达水平与促纤维化因子CTGF的表达显著相关。结论:心肌细胞可自主低水平分泌或诱导后高表达CTGF及下游纤维化因子FN,提示心肌细胞主动参与了心肌纤维化及心脏重塑过程;而通过RNAi靶向抑制CTGF后可阻抑心肌细胞分泌下游纤维化因子,进一步提示CTGF是促心肌纤维化的关键性细胞因子,而RNAi是一种特异高效的很有前途的干预手段。     

小干扰RNA对大鼠OX40基因表达的沉默作用

目的:研究靶向大鼠OX40基因的二聚体小干扰RNA(siRNA-OX40) 对靶基因表达的沉默作用.方法:建立并筛选稳定表达OX40基因的293T转染细胞株,用脂质体转染法将体外合成的siRNA-OX40转染上述细胞株,采用实时荧光定量PCR检测靶基因OX40 mRNA表达情况.结果:用不同浓度的siRNA-OX40转染细胞48小时,10 nmol/L浓度对293T细胞靶基因表达的抑制作用最强 [抑制率(68.3±8.7)%],1 nmol/L浓度仍有一定的抑制作用[(37.2±4.8)%];25、10 nmol/L siRNA转染293T细胞后,均在24小时内起效[(21.4±3.2)%,(26.8±3.8)%],抑制作用至少能维持72小时[(61.7±8.4)%,(39.6±5.6)%].结论:siRNA-OX40对293T细胞外源性靶基因表达有较强的特异性沉默作用,siRNA在24小时内起效,48～72小时达高峰,抑制作用至少能维持72小时.本研究结果为下一步在动物或临床进行siRNA干扰试验提供了实验依据.     

川芎嗪和siRNA沉默转化生长因子β1干预大鼠肝星状细胞 结缔组织生长因子的表达

背景：作者前期研究发现川芎嗪可以通过抑制肝星状细胞的增殖、阻抑p38MARK信号通路、下调结缔组织生长因子的表达等多途径发挥抗肝纤维化的作用。一般认为转化生长因子β1是促进纤维化发生最重要的细胞因子,结缔组织生长因子是转化生长因子β1的下游效应介质,siRNA靶向抑制转化生长因子β1可能成为治疗肝纤维化的新方法。 目的：观察川芎嗪及化学合成的siRNA转化生长因子β1对大鼠肝星状细胞结缔组织生长因子表达的影响。 方法：体外培养大鼠肝星状细胞,从3条siRNA转化生长因子β1中筛选一条有效的基因沉默片段,然后利用脂质体转染试剂共同转染培养24 h的细胞作为转染组,并设计空白对照组、转染试剂组、川芎嗪组及联合治疗组。 结果与结论：与空白对照组相比,转染组、川芎嗪组、联合治疗组Ⅰ、Ⅲ型胶原及结缔组织生长因子mRNA表达均下调(P < 0.05)。在转染组、川芎嗪组及联合治疗组,结缔组织生长因子蛋白表达均下调(P < 0.05);培养上清液中Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原含量均降低(P < 0.05)。结果表明,siRNA 沉默转化生长因子β1基因能下调结缔组织生长因子的表达,减少Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达。川芎嗪也能下调结缔组织生长因子的表达,但对Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的抑制作用更加显著,提示川芎嗪抗肝纤维化可能是多种作用靶点。     

小干扰RNA的设计及原理

RNA干扰技术在人类基因功能研究、药物靶点鉴定等方面备受青睐,并且具有潜在的临床应用价值。但只有设计合理的小干扰RNA (siRNA)才能高效、特异地抑制靶基因表达。本文总结了siRNA序列的一般特点以及设计siRNA的方法和相应原理,并介绍了如何利用实验手段,验证RNA干扰的有效性及特异性。从而促进RNA干扰技术的广泛开展。     

脊髓损伤模型大鼠神经修复与法舒地尔和RhoA基因沉默的干预

背景：研究认为Rho激酶可致使神经生长锥塌陷,对神经修复具有抑制作用。 目的：观察Rho激酶抑制剂法舒地尔及RNA干预介导的RhoA基因沉默对脊髓损伤大鼠在体神经损伤修复的作用。 方法：雄性SD大鼠60只半切法制成脊髓半横断模型,随机等分成对照组、法舒地尔组和RhoA siRNA组。法舒地尔组于腹腔注射10 mg/kg法舒地尔,2次/d,连续用药1周;RhoA siRNA干扰组将RhoA siRNA表达质粒注射于大鼠脊髓损伤区。 结果与结论：伤后4周,法舒地尔和RhoA siRNA组大鼠后肢运动功能均有明显恢复,可见少量神经轴索样结构,辣根过氧化物酶阳性神经纤维数增多(P < 0.05),体感诱发电位的潜伏期明显缩短、波幅显著增强(P < 0.05)。提示大鼠脊髓损伤后给予Rho激酶抑制剂法舒地尔及RNA介导的RhoA基因沉默能够促进受损伤的脊髓神经功能恢复。     

电针改善脊髓损伤大鼠逼尿肌的形态结构和膀胱功能

背景：大量临床和基础研究表明,电针能够改善骶上脊髓损伤后神经源性膀胱的功能。目的：观察电针对骶上脊髓损伤大鼠膀胱功能及结缔组织生长因子表达的影响。方法：将48只雌性SD大鼠随机分为4组,每组12只：空白组不做任何处理;假手术组仅暴露T8椎体下脊髓;模型组建立T8椎体下脊髓横断损伤模型;电针组建立T8椎体下脊髓横断损伤模型后第19天给予电针干预,选择“次髎”“中极”“三阴交”三穴,20 min/次,1次/d,连续干预10 d。干预结束后,进行相关指标检测。结果与结论：(1)尿流动力学检测：与空白组比较,模型组大鼠漏尿点压、膀胱最大容量、膀胱最大压力均升高(P <0.05);与模型组比较,电针组大鼠漏尿点压、膀胱最大容量、膀胱最大压力均下降(P <0.05);(2)苏木精-伊红染色：与空白组比较,模型组大鼠膀胱上皮细胞排列紊乱,固有膜被破坏,逼尿肌肌束肥大,肌纤维排列紊乱,组织水肿明显;与模型组比较,电针组大鼠膀胱上皮细胞排列相对规则有序,膀胱纤维化及组织水肿程度相对减轻;(3)Masson染色：模型组大鼠膀胱逼尿肌纤维化程度较重,电针组大鼠膀胱逼尿肌纤维化程度轻于模型组;(4...     

督脉电针联合神经干细胞移植治疗脊髓全横断损伤后aggrecan的表达变化

目的:观察督脉电针联合神经干细胞( NSCs)移植治疗脊髓损伤对硫酸软骨素蛋白多糖aggrecan的表达影响.方法:成年SD大鼠随机分为脊髓损伤对照组、督脉电针组、NSCs移植组以及督脉电针联合NSCs移植组.建立成年大鼠第9～10胸椎段脊髓全横断模型.其中电针组和电针联合NSCs组于术后当天进行电针治疗.用免疫组织化...     

抗结缔组织生长因子特异性小干扰RNA的设计、合成及筛选

目的 设计和合成针对抗肝纤维化关键基因抗结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)的特异性小干扰RNA(siRNA),并筛选高效的CTGF siRNA抗肝纤维化序列.方法 参照siRNA设计原则,应用RNA在线设计软件,设计3段RNA干扰候选序列,分别转染正常干细胞株(...     

siRNA沉默波形蛋白表达抑制大鼠急性脊髓损伤胶质瘢痕的形成

背景：脊髓损伤后胶质瘢痕形成物理屏障抑制轴突跨越损伤部位,被认为是神经修复过程中的不利因素。目的：研究siRNA干扰波形蛋白表达对反应性星形胶质细胞的影响,探讨其在脊髓损伤后胶质瘢痕形成中的意义。 方法：①选取生长良好的第3代星形胶质细胞,分为未转染组、siRNA-NC组、siRNA-Vimentin组,利用siRNA干扰技术沉默星形胶质细胞中波形蛋白表达,转染24 h进行波形蛋白免疫荧光染色,采用划痕法观察细胞迁移及增殖情况。②SD大鼠随机分为3组：正常组10只,只打开椎板,不损伤脊髓;模型组20只,制备脊髓损伤模型,脊髓内直接注射盐水和空载质粒;治疗组20只,制备脊髓损伤模型,脊髓内直接注射siRNA干扰24 h波形蛋白质粒,分别于术后1 d和4,8周观察脊髓的连续性、粗细及瘢痕与周围组织粘连情况。结果与结论：①siRNA-Vimentin组免疫荧光染色积分吸光度值低于未转染组、siRNA-NC组(P < 0.05),siRNA-Vimentin组的划痕宽度大于未转染组、siRNA-NC组;②术后4,8周,治疗组损伤部位脊髓组织结构改善,胶质瘢痕形成范围小于模型组;③结果表明,波形蛋白对反应性星形胶质细胞增殖及迁移能力有显著的抑制作用,并可以抑制脊髓损伤后胶质瘢痕的形成,为脊髓损伤后轴突再生及神经功能恢复提供良好的微环境。https://orcid.org/0000-0002-5711-4346 (李剑锋) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程     

大鼠脊髓挤压伤后小胶质细胞Toll样受体4表达的变化

目的探讨脊髓挤压伤后各时间点小胶质细胞Toll样受体4(TLR4)的表达变化及其与损伤面积和免疫球蛋白G渗出范围的关系。方法 48只成年雄性SD大鼠建立T8节段脊髓挤压伤模型,随机分为6组,每组8只;假手术对照组及挤压伤组动物在手术后0h、3h、24h、72h和7d用4%多聚甲醛灌注固定,取以挤压点为中心的2cm脊髓,冷冻切片后进行HE染色和免疫荧光染色,分别观察损伤面积的变化,TLR4表达和TLR4阳性小胶质细胞的分布,以及与血浆免疫球蛋白G(IgG)渗出范围的比较,并用IPP6.0软件计算各组的阳性数目。结果脊髓损伤后TLR4主要表达在小胶质细胞,在3～24h之间开始表达,伤后在72h达到高峰,7d时已经显著下降。阳性小胶质细胞的分布与IgG渗出范围一致。结论大鼠脊髓挤压伤模型中,表达在脊髓小胶质细胞上的TLR4可在脊髓继发性损伤中发挥重要作用,并与血脊髓屏障开放有关。     

骨髓基质干细胞移植治疗大鼠脊髓挫伤中碱性成纤维生长因子的变化

探讨骨髓基质干细胞(BMSCs)对脊髓损伤修复的可能作用及其对bFGF表达的影响,为BMSCs修复脊髓损伤提供实验依据。采用改良的Allen的WD法建立脊髓(T12节段)损伤模型,将66只SD大鼠随机分为正常组(A组)、损伤后未移植的对照组(B组)和BMSCs移植治疗组(C组)。通过BBB行为学评分记录两组动物后肢恢复功能,免疫组织化学方法检测bFGF的表达。结果显示:BMSCs移植组BBB评分高于对照组;bFGF在各组大鼠脊髓中均呈阳性表达,损伤后对照组与BMSCs移植组各个时点的表达量仍高于正常组(P<0.05),7d最高,后渐下降,但21d表达仍高于正常。其中BMSCs移植组与对照组各个时点的bFGF表达量均有显著差异(P<0.05)。结果提示:BMSCs移植治疗大鼠脊髓损伤模型有助于其功能的恢复。     

脊髓挫伤速度对颈脊髓原发性损伤影响的实验研究

目的　确定脊髓挫伤速度是脊髓损伤的因素,探讨不同速度的脊髓挫伤对大鼠颈脊髓原发性损伤的影响。  方法    20只成年雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为快速组（500 mm/s,n=8）、慢速组（5 mm/s,n=8）和对照组（n=4）。用直径为4 mm的平头圆锥打击头在C5水平产生1.5 mm的挫伤位移。损伤后即行心脏固定,切取以挫伤部位为中心长约1.5 cm的脊髓组织。行连续矢状位冰冻切片。HE染色观察脊髓大体形态,计算出血量。β-APP免疫组化后观察轴索损伤程度。  结果　挫伤后观察到脊髓表面有一带状出血,且快速组出血带颜色更深。快速组挫伤位移为(1.50±0.05) mm,最大力为(5.3±1.2) N;慢速组挫伤位移为(1.51±0.04) mm,最大力为(2.8±0.6) N,两组间最大力的差异有显著性（P=0.001）。HE染色显示脊髓出血大部分都集中在灰质,白质相对较少。快速组脊髓总出血量、灰质出血量和白质出血量分别为0.94、0.71和0.23 mm3,慢速组分别为0.55、0.43和0.12 mm3,其中两组间总出血量和灰质出血量的差异有显著性（P＜0.05）。β-APP免疫组化观察到快速组轴索断裂比慢速组更为严重。  结论　脊髓挫伤速度是影响脊髓原发性损伤的因素,快速的脊髓挫伤导致的原发性脊髓损伤更为严重,导致更多的脊髓出血和轴索断裂。     

大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡及相关调控蛋白Caspase-3表达的时空分布

目的 观察大鼠脊髓损伤（SCI）后神经元细胞凋亡和相关调控蛋白Caspase-3表达的时间、空间分布规律。方法 SD大鼠50只,分为假手术组和SCI组,钳夹法建立SCI模型,用结晶紫（CV）染色法、TUNEL法和免疫组织化学方法观察SCI后6h、12h、24h、3d和7d损伤中心到头端0～5.00mm空间范围内脊髓神经细胞存活、凋亡以及相关调控蛋白Caspase-3的表达状况。 结果 CV染色发现,SCI后6h～7d在0～0.50mm空间范围内均未发现存活的神经细胞,在1.00～3.50mm距离内,存活的神经细胞数逐渐增加,4.00mm处达峰值;TUNEL结果发现,SCI后6h～7d在1.05～4.55mm范围内,神经细胞出现凋亡,3d时在2.55mm处,细胞凋亡达高峰,7d时显著减少;免疫组织化学结果发现,SCI后6h～7d在1.10～4.60mm范围内,神经元细胞出现Caspase-3阳性表达,3d在3.10mm处Caspase-3表达达到高峰,7d显著减少。 结论 SCI后,凋亡的神经细胞及其相关调控蛋白Caspase-3的表达有一定的时空分布规律。     

表没食子儿茶素没食子酸酯对大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡及Caspase-3表达的影响

目的观察表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对脊髓损伤(SCI)大鼠神经元凋亡和凋亡调控蛋白Caspase-3时间、空间表达的影响,探讨其脊髓损伤保护机制。方法 SD大鼠75只,分为假手术组、SCI组、EGCG组(n=25只);钳夹法制作脊髓损伤模型,EGCG组和SCI组损伤后即刻和1h后腹腔注射EGCG(50 mg/kg)和等量生理盐水;用结晶紫(CV)染色法、TUNEL和免疫组织化学方法,观察SCI后6h、12h、24h、3d和7d时间范围内,从损伤中心到头端0~5.00mm空间范围内,EGCG对脊髓神经元存活、凋亡以及相关调控蛋白Caspase-3表达的影响。结果 CV染色发现,SCI后6h~7d,在0~0.50mm空间范围内均未发现存活的神经元,在1.00~4.60mm范围内,EGCG和SCI组相比存活的神经元数明显增加(P0.01);TUNEL结果发现,SCI后6h~7d,在1.05~3.05mm范围内,EGCG与SCI组相比凋亡神经元数明显减少(P0.01);免疫组织化学发现,SCI后6h~7d,在1.10~3.10mm范围内,EGCG与SCI组相比Caspase-3阳性表达的神经元数明显减少(P0.01)。结论 EGCG在一定时间、空间范围内能下调Caspase-3表达,减少神经元凋亡,对继发性SCI有拮抗作用。     

Effect of cervical spinal cord hemisection on the expression of axon growth markers

To evaluate the plasticity processes occurring in the spared and injured tissue after partial spinal cord injury, we have compared the level of axon growth markers after a C2 cervical hemisection in rats between the contralateral (spared) and ipsilateral (injured) cervical cord using western blotting and immunohistochemical techniques. In the ipsilateral spinal cord 7 days after injury, although GAP-43 levels were increased in the ventral horn caudal to the injury, they were globally decreased in the whole structure (C1–C6). By contrast, in the contralateral intact side 7 days and 1 month after injury, we have found an increase of GAP-43 and βIII tubulin levels, suggesting that processes of axonal sprouting may occur in the spinal region contralateral to the injury. This increase of GAP-43 in the contralateral spinal cord after cervical hemisection may account, at least partially, to the spontaneous ipsilateral recovery observed after a cervical hemisection.     

减压对大鼠脊髓压迫性损伤后脱髓鞘病变和BDNF表达的影响

目的观察脑源性神经生长因子(BDNF)对脊髓压迫性损伤(CSCI)后有髓神经纤维脱髓鞘病变的影响,为阐明BDNF对神经纤维脱髓鞘病变修复提供实验基础。方法将大鼠均分成4组:正常组、假手术组、压迫组和减压组。用自行设计的压迫器制作大鼠脊髓压迫模型。压迫组作脊髓压迫12 h,减压组作脊髓压迫1 h,假手术组仅作脊髓显露,不作压迫。用锇酸染色观察CSCI后1、3和7 d有髓神经纤维变化情况;Western blot和免疫荧光双标检测BDNF和髓鞘碱性蛋白(MBP)的表达。结果压迫组和减压组都出现脱髓鞘病变,并随着时间的延长,髓鞘逐渐水肿、变性、MBP崩解。BDNF表达量在CSCI后随时间延长也逐渐降低(P0.05),但与压迫组相比较,减压组脱髓鞘病变较轻且MBP和BDNF降低幅度小而缓慢(P0.05)。结论 CSCI后尽早减压可减轻脱髓鞘的发生,且可能与BDNF的表达有关。     

被动运动对脊髓损伤大鼠后肢运动功能及骨骼肌的影响

目的　观察被动运动促进脊髓损伤（Spinal cord injury, SCI）大鼠后肢运动功能恢复和改善骨骼肌萎缩的影响;探讨脑源性神经营养因子（BDNF）对被动运动促进功能恢复和延缓肌萎缩的作用。 方法　将36只健康成年雌性SD大鼠随机分假手术组、对照组（未行运动）,被动运动组（损伤1周后开始被动运动,共4 周）。采用改良的Allen’s法制备SCI模型。术后1 d和1、2、3、4 周通过大鼠Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)行为学评分检测各组大鼠的运动功能;术后5周,采用HE染色比较各组大鼠脊髓组织病理变化,观察大鼠后肢腓肠肌的横断面积、直径和形态变化。测量腓肠肌湿重、体重和肌湿重/体重,评价肌萎缩情况;采用Western blots检测腓肠肌中BDNF的表达变化。 结果　被动运动组运动功能明显高于对照组（P<0.05）。损伤5周后,对照组和被动运动组的脊髓组织失去正常形态,神经元数量减少,损伤区大量空洞形成,而被动运动组的变化较对照组轻。对照组腓肠肌湿重、肌湿重/体重、横断面积和直径下降,被动运动组改善上述肌萎缩情况（P<0.05）。与假手术组相比,对照组和被动运动组BDNF表达量增加（P<0.05）,其中被动运动组高于对照组（P<0.05）。 结论　被动运动可能是通过增加SCI后BDNF表达促进损伤后运动功能的恢复,并能有效改善失神经性肌萎缩。     

Metallothionein-II improves motor function recovery and increases spared tissue after spinal cord injury in rats

After spinal cord injury (SCI), a complex cascade of pathophysiological processes rapidly damages the nervous tissue. The initial damage spreads to the surrounding tissue by different mechanisms, including oxidative stress. We have recently reported that the induction of metallothionein (MT) protein is an endogenous rapid-response mechanism after SCI. Since the participation of MT in neuroprotective processes after SCI is still unknown, the aim of the present study was to evaluate the possible neuroprotective effect of exogenously administered MT-II during the acute phase after SCI in rats. Female Wistar rats weighing 200-250g were submitted to spinal cord contusion by means of a computer-controlled device (NYU impactor). Rats received several doses of MT-II (3.2, 10 and 100μg) at 2 and 8h after SCI. Results of the BBB scale were statistically analysed using an ANOVA of repeated-measures, followed by Tukey's test. Among the three doses tested, only 10 and 100μg were able to significantly increase (p<0.05) BBB scale scores eight weeks after SCI from a mean of 7.88 in the control group, to means of 12.63 and 10.88 for the 10 and 100μg doses of MT-II, respectively. The amount of spared tissue was also higher in the groups treated with 10 and 100μg, as compared to the control group values. Results from the present study demonstrate a significant neuroprotective effect of exogenously administered MT-II. Further studies are needed in order to characterize the mechanisms involved in this neuroprotective action.