乙型肝炎病毒前S1基因酵母表达载体的构建及表达

为探讨乙型肝炎病毒（HBV）前S1蛋白的功能，在真核生物酵母细胞中表达HBV前S1基因。以HBV ayw亚型全长质粒pCP10为模板，多聚酶链反应（PCR）扩增HBV前S1基因，克隆到pGEM-Tfawsk ,双酶切后回收与酵母表达质粒pGBKT7连接，将重组载体转化酶母细胞AH109，提取酵母蛋白质，进行十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）和Western免疫印迹分析，结果成功地构建了HBV前S1基因酵母表达载体，Western免疫印迹显示HBV前S1在酵母细胞中表达，表达产物在胞内存在，分子量30kD左右。表明HBV前S1蛋白在酵母细胞中表达成功。     

酵母双杂交技术筛选与RIG-Ⅰ相互作用蛋白

目的:筛选人脾细胞cDNA 文库中与维甲酸诱导Ⅰ型基因(RIG-Ⅰ)所编码蛋白具有相互作用的蛋白基因.方法:通过聚合酶链反应(PCR),以HEK293T细胞RNA为模板扩增RIG-Ⅰ基因的2CARD结构域部分,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒pGBKT7-RIG-Ⅰ2CARD,转化到酵母细胞AH109感受态中,得到阳性克隆AH109[RIG-Ⅰ2CARD].然后将人脾细胞cDNA文库转化进AH109[RIG-Ⅰ2CARD],在含有X-α-半乳糖(X-α-Ga1)四缺营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,提取质粒后转化DH5α大肠杆菌并经氨苄青霉素抗性筛选,挑取单克隆菌落抽提质粒,并进行测序,再进行生物信息学分析.结果:成功构建酵母诱饵蛋白表达质粒pGBKT7-RIG-Ⅰ2CARD,并能在酵母中表达.筛选出阳性菌落59个,经生物信息学分析,最后从脾细胞cDNA文库中筛选出12个与RIG-Ⅰ2CARD 有相互作用的蛋白基因.结论:成功克隆出RIG-Ⅰ2CARD基因,并从脾细胞cDNA文库中筛选出12种能与RIG-Ⅰ2CARD具有相互作用的蛋白基因.     

hPer1 bHLH-PAS结构域酵母双杂交系统的构建

目的构建hPer1 bHLH-PAS结构域的酵母双杂交系统,以寻找与hPer1相互作用的新蛋白.方法构建pGBKT7-hPer1 bHLH-PAS重组诱饵质粒及pGADT7-Rec-脑cDNA文库质粒;将两种质粒顺序转染至酵母细胞AH109中,进行营养缺陷筛选阳性克隆株.结果经酶切和基因测序鉴定,证实重组诱饵质粒pGBKT7-hPer1 bHLH-PAS构建成功.脑cDNA文库转化效率为1.2×106/3 μg pGADT7-Rec.结论酵母双杂交文库筛选得到24个阳性克隆.这为寻找脑组织中与hPer1相互作用的未知蛋白奠定了基础.     

乙型肝炎病毒DNA聚合酶反式调节蛋白HBVDNAPTP1相互作用蛋白的筛选与鉴定

目的 筛选并鉴定与乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶反式调节蛋白(HBVDNAPTP1)相互作用的蛋白.方法 将HBVDNAPTP1基因片段插入酵母细胞表达载体pGBKT7中,转化AH109酵母菌株并获得表达,与含有白细胞文库质粒的Y187酵母菌株配合,利用营养缺陷型培养基筛选阳性克隆.提取单个阳性文库质粒进行酶切鉴定,测序后回复验证其在酵母中的相互作用.利用免疫共沉淀方法进一步验证HBVDNAPTP1与成对免疫球蛋白受体α(PILRα)在体外的相互作用.结果 经RT-PCR扩增获得HBVDNAPTP1基因片段,成功构建HBVDNAPTP1基因的酵母细胞"诱饵"表达质粒,获得了与HBVDNAPTP1具有相互作用的已知功能蛋白4种,分别为PILRα、酶原颗粒蛋白16、羧酸脂酶1、β转导素样蛋白2.免疫共沉淀结果表明HBVDNAPTP1与PILRα在体外存在相互作用.结论 获得了4种可与HBVDNAPTP1相互作用的候选蛋白,HBVDNAPTP1可能参与了肝细胞的增殖分化、信息传递和生长代谢.     

DC-SIGN真核表达载体的构建及其稳定转染BHK21细胞系的建立

目的 构建DC-SIGN分子真核表达载体,获得可稳定表达DC-SIGN分子的BHK21细胞系.方法 以pUNO-hDC-SIGN1Aa质粒为模板,通过PCR方法扩增人DC-SIGN基因,经过Not Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切之后,将其克隆入真核表达载体pIRES-neo,构建真核表达载体pIRES-neo-DC-SIGN,以Not Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切以及测序验证重组质粒的正确性.将重组质粒以Lipo-fectamine~(KM) 2000转染到BHK21细胞,通过G418及有限稀释法进行阳性克隆的筛选,建立稳定表达DC-SIGN分子的BHK21细胞系,利用流式细胞仪、Western blotting及免疫荧光法检测DC-SIGN分子的表达.结果 双酶切鉴定证明DC-SIGN基因已经成功克隆入真核表达载体pIRES-neo中,测序结果表明EC-SIGN基因与原序列一致.pIRES-neo-DC-SIGN转染BHK21细胞后,获得了急定表达DC-SIGN分子的细胞系.流式细胞仪检测结果显示,阳性克隆中DC-SIGN分子的表达率为85.42%.免疫荧光结果显示,DC-SIGN分子主要表达于细胞膜表面.Western blotting能检测到DC-SIGN蛋白表达的特异条带.结论 成功构建了稳定、高效表达DC-SIGN分子的BHK21细胞系,为后续DC靶向性疫苗研究奠定了基础.     

人GDNF-TAT真核表达载体的构建及其在毕赤酵母中的表达

目的：在毕赤酵母中表达带有TAT多肽的人胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line-derived neurotro-phic factor,GDNF）,为探讨GDNF-TAT用于帕金森病的治疗奠定基础。方法：用密码子优化法合成人GDNF基因序列连在pPICZαA,用PCR方法分别在上游引入TAT位点与XbaⅠ酶切位点,下游设计扩增pPICZαA上的α-因子序列。然后插入pPICZαA载体中,转化大肠杆菌TOP10,筛选阳性克隆,对其进行PCR和双酶切并测序鉴定,构建GDNF-TAT在毕赤酵母表达质粒pPICZαA-GDNF-TAT。电击转化毕赤酵母GS115,对阳性克隆进行诱导表达后经SDS-PAGE和Western印迹鉴定目的蛋白。结果：双酶切pPICZαA-GDNF-TAT后,琼脂糖电泳可分别见到大小约为3.1kb和432bp片段,表明目的片段已插入载体中,经序列测定其含有完整的GDNF-TAT基因片段,Western印迹结果显示含有pPICZαA-GDNF-TAT的毕赤酵母GS115能分泌表达GDNF-TAT。结论：成功构建了毕赤酵母表达载体pPICZαA-GDNF-TAT,并能在毕赤酵母GS115中分泌表达GDNF-TAT。     

肿瘤相关抗原MART-1蛋白原核表达载体的构建、表达纯化和活性鉴定

目的构建编码肿瘤相关抗原MART-1融合基因的原核表达载体,在大肠埃希菌中表达His-MART-1融合蛋白,并对蛋白进行纯化和免疫原性鉴定。方法采用PCR法扩增编码MART-1的基因片段,将该基因片段克隆到含有His标签的pET-28b原核表达载体上,重组质粒经双酶切、PCR及测序鉴定正确后转化大肠埃希菌,IPTG诱导融合蛋白表达,用镍离子亲和层析法纯化融合蛋白并进行脱盐,SDS-PAGE电泳和Western blotting法鉴定。通过ELISA法检测经树突状细胞提呈后的His-MART-1融合蛋白对特异性CD4+T细胞的刺激作用。结果重组质粒经双酶切、PCR和测序鉴定证明载体构建成功。His-MART-1融合蛋白经表达纯化后,分子量约13kD,与预期值相符。Western blotting证实该融合蛋白可与抗His单克隆抗体发生特异性结合。His-MART-1融合蛋白经树突状细胞提呈后能刺激MART-1特异性CD4+T细胞分泌IFN-γ。结论成功构建了编码MART-1基因原核表达载体pET-28b-MART-1,表达及纯化获得该融合蛋白,并证实其具有良好的免疫原性。     

PCGF1过表达慢病毒载体的构建及稳定过表达A549细胞系的建立

目的 构建人多梳家族环指蛋白1(PCGF1)基因的慢病毒载体,建立稳定表达PCGF1基因的细胞系.方法 根据人PCGF1序列设计并合成引物,以A549细胞cDNA为模板,PCR扩增目的基因.双酶切目的基因并插入pLVX-IRES-puro质粒,对重组质粒进行慢病毒包装,用包装好的病毒感染A549细胞系,通过嘌呤霉素筛选阳性表达细胞,Western blotting验证PCGF1表达情况.结果 重组质粒经测序分析正确,瞬时转染293T细胞后,Western blotting验证PCGF1表达明显升高.包装慢病毒颗粒后感染A549细胞,经嘌呤霉素筛选后,Western blotting验证得到PCGF1稳定过表达的A549细胞系.结论 成功构建了pLVX-IRES-PCGF1-puro慢病毒过表达载体和PCGF1稳定过表达的A549细胞系,为进一步研究PCGF1的功能奠定了基础.     

肝细胞内与HBeAg结合的新蛋白编码基因E-36的筛选与克隆

目的　探讨HBeAg在乙型肝炎病毒 (HBV)致病过程中所起的作用。方法　利用酵母双杂交系统 3筛选并克隆人肝细胞cDNA文库中与HBeAg有相互作用的蛋白的基因。将HBeAg编码基因克隆入酵母表达载体 pGBKT7中构建诱饵质粒 ,转化酵母细胞AH10 9并在其内表达 ,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合 ,双重筛选阳性菌落 ,提取质粒并测序。结果　通过行生物信息学分析 ,发现其中有 1个未知基因 ,命名为E 36。结论　根据GenBank中的序列信息设计引物 ,从HepG2细胞中扩增出E 36新基因的完整序列并克隆到另一酵母表达载体pGADT7中 ,并用体外免疫共沉淀方法再次验证了HBeAg与E 36新蛋白之间有结合作用 ,为HBeAg的功能研究提供了新线索。     

人DOC-2氨基端PID结构域酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活鉴定

目的：获得人DOC-2氨基端磷酸酪氨酸作用结构域（PID）cDNA基因，构建酵母双杂交诱饵载体，并检测对报告基因的激活作用。方法：PCR扩增含人DOC-2编码区的全长cDNA片段，克隆入诱饵载体pGBKT7，再亚克隆得到含PID结构域的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-nDOC2。将重组质粒导入酵母菌AHl09，检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因有无激活作用。结果：成功构建人DOC-2氨基端磷酸酪氨酸作用结构域（PID）酵母双杂交诱饵载体，该段基因表达的蛋白对酵母菌AH109既无毒性，对报告基因也没有激活作用。结论：我们可利用构建的酵母双杂交诱饵载体来钓取人DOC-2氨基端PID结构域的相互作用蛋白，以利于对DOC-2基因功能进行研究。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A结合蛋白37基因的克隆化研究

丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)可与多种细胞内蛋白发生结合，涉及调节细胞生长、干扰素耐受、脂质代谢和其他细胞内信号转导通路。本实验通过酵母双杂交技术筛选得到一个与NS5A相结合的未知功能蛋白基因，命名为NS5ABP37，根据GenBank数据库推定蛋白编码序列的信息，应用反转录聚合酶链反应(PCR)扩增出该基因序列。连接人酵母和真核细胞表达载体表达成功，并经回交实验证实NS5A与NS5ABP37的结合作用，为进一步研究奠定基础。     

酵母双杂交技术筛选人95D细胞中肺癌转移相关蛋白1相互作用蛋白及其验证

 目的 通过酵母双杂交实验、免疫共沉淀及GST pull down技术筛选并验证肺癌细胞系95D细胞中与肺癌转移相关蛋白1(lung cancer metastasis-related protein 1,LCMR1)相互作用蛋白,为进一步研究LCMR1在肺癌发生发展中的作用提供科学依据。方法 将诱饵质粒pGBKT7-LCMR转化AH109,应用酵母双杂交系统筛选出95D细胞中与LCMR1相互作用的候选克隆;应用反复划线法、X-α-Gal显色法和共转化回复验证法排除假阳性克隆,对真阳性克隆进行测序及生物学分析;构建含Myc标签的LCMR1融合蛋白的重组载体pCMV - Myc-LCMR1载体,以及带flag标签的目标相互作用蛋白载体,共转染细胞,利用免疫共沉淀技术验证LCMR1与相互作用蛋白之前的相互作用;融合蛋白沉降(GST pull- down)法进一步体外验证LCMR1与相互作用蛋白之间的作用。结果 诱饵质粒pGBKT7 -LCMR1与95D细胞cDNA文库共转化AH109,初步获得20个候选克隆;重复划线法后获得16个阳性克隆,X-α-Gal显色法获得12个蓝色阳性克隆,进一步将文库质粒与诱饵质粒共转化酵母菌回复验证,最终获得6个真阳性克隆;成功构建含标签重组载pCMV-Myc-LCMR1、pcDNA3.0-flag-RPL29及pcDNA3.0- flag-GNG5载体,经免疫共沉淀验证LCMR1与RPL29在细胞内有相互作用,与GNG5在细胞内无相互作用;GST pull-down实验验证LCMR1与RPL29在体外有相互作用,与GNG5在细胞外无相互作用。结论 酵母双杂交技术筛选出95D细胞中相互作用蛋白6个,经免疫共沉淀和GST pull-down实验验证LCMR1与RPL29体内体外均有相互作用。     

乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白1的克隆及原核表达

目的 对应用酵母双杂交技术及生物信息学技术筛选得到的乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白1(HBEBP1)进行克隆,并诱导其在大肠埃希菌BL21中的表达.方法 应用反转录PCR(RT-PCR)技术,以HepG2细胞mRNA为模板,扩增获得HBEBP1基因片段,连接到pGEM-T载体,双酶切鉴定及测序正确后克隆至原核表达载体pET-32a( )中,转化大肠埃希菌BL21,IPTG诱导表达以获得HBEBP1融合蛋白,并通过SDS-PAGE及Western blot证实融合蛋白的特异性.结果 RT-PCR扩增获得大小为372bp的HBEBP1基因片段,插入至原核表达载体pET-32a( )中,转化大肠埃希菌BL21,经IPTG诱导后,成功获得大小约为33kD的重组蛋白,Western blot证实其具有良好的特异性.结论 构建了pET-32a( )-HBEBP1原核表达载体,并在大肠埃希菌BL21中诱导表达了HBEBP1融合蛋白,为研究HBEBP1蛋白的免疫原性和生物学特性奠定了基础.     

丙型肝炎病毒NS5A反式激活蛋白7的重组表达及生物信息学分析

目的 构建丙型肝炎病毒NS5A反式激活蛋白7(NS5ATP7)的原核表达载体,诱导其在大肠埃希菌中的表达,并初步探讨其结构与功能.方法 应用逆转录PCR(RT-PCR)技术,以HepG2细胞mRNA为模板,扩增获得NS5ATP7基因片段,连接到pGEM-T载体,酶切鉴定及测序正确后插入至原核表达载体pET-32a( )中,转化大肠埃希菌BL21,IPTG诱导以获得NS5ATP7融合蛋白的表达,SDS-PAGE、Western blot免疫印迹分析和证实该融合蛋白表达的特异性,并应用生物信息学方法对该融合蛋白的结构和功能进行预测.结果 利用RT-PCR扩增获得大小为891bp的NS5ATP7基因片段,插入pET-32a( )表达载体,转化BL21宿主菌,经IPTG诱导,成功获得了大小为48kD的目的蛋白,Western blot进一步证实了该蛋白具有特异性免疫反应识别.生物信息学预测结果显示此蛋白富含螺旋结构,为非跨膜蛋白,无信号肽.结论 利用大肠埃希菌BL21成功表达了NS5ATP7融合蛋白,结合生物信息学分析结果,为研究NS5ATP7蛋白的免疫原性和生物学特性奠定了基础.     

小鼠附睾分泌蛋白Spink12的原核表达与纯化

目的原核表达带有His标签的小鼠附睾蛋白Spink12,对表达产物进行鉴定和纯化,以研究Spink12的免疫避孕效果。方法提取小鼠附睾组织总RNA,RT-PCR扩增不含信号肽的Spink12蛋白编码序列,以NdeⅠ和EcoRⅠ酶切后,将其连入原核表达载体pET28(a);经酶切和测序鉴定正确的重组质粒pET28(a)-Spink12,转化大肠埃希菌BL21感受态细胞。融合蛋白经IPTG诱导表达,产物经SDS-PAGE电泳和Western blotting免疫印迹鉴定。用Ni-NTA在非变性条件下利用不同的咪唑梯度浓度纯化融合蛋白6×His-Spink12。结果酶切和测序结果显示成功构建出原核表达载体pET28(a)-Spink12。重组质粒转化大肠埃希菌BL21并经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳显示表达出约9kD的融合蛋白6×His-Spink12,与理论分子量相符。融合蛋白的表达量占菌体蛋白总量的23.5%。用抗His单克隆抗体进行Western blotting免疫印迹鉴定,检测到同样大小的条带。经纯化获得较高纯度的融合蛋白6×His-Spink12,纯度达91.1%。结论成功表达并纯化了融合蛋白6×...     

一种新的人端粒相关蛋白T-STAR 的克隆及功能分析

目的 筛选、鉴定新的人端粒相关蛋白，为进一步了解端粒酶全酶的结构、生物学功能及其作用机制奠定实验基础。方法 采用研究蛋白质间相互作用非常有效的分子生物学方法酵母双杂交技术、哺乳细胞双杂交技术进行人端粒相关蛋白分子的筛选、鉴定。结果 成功构建端粒酶催化亚单位诱饵融合蛋白表达载体pGBKT7-hTERT，无自身激活活性，pG—BKT-7hTERT融合蛋白在酵母细胞AH109内有效稳定表达。以pGBKT7-hTERT为诱饵进行cDNA库筛选，将阳性克隆质粒cDNA测序，同源性比较获得了已收录人cDNA序列T—STAR。成功构建真核表达载体pVP16-T-STAR、pM—hTERT，证明T-STAR与hTERT在哺乳细胞内发生相互作用。T—STAR mRNA在正常胃粘膜组织低表达，在胃癌细胞内高表达。结论 T—STAR是人端粒相关蛋白新成员，可能参与酪氨酸蛋白激酶信号传递并通过介入hTERT的磷酸化或去磷酸化调节端粒酶的活性。     

HCCR-2基因的克隆及原核表达

目的:克隆HCCR-2基因、原核表达并鉴定。方法:从培养的人骨肉瘤细胞SOSP-9607中提取总RNA,经RT-PCR获得HCCR-2基因。将该基因克隆到pGEM-T-Easy克隆载体中,测序、鉴定。将测序正确的HCCR-2基因亚克隆到pET-28a( )表达载体中,构建HCCR-2表达载体,IPTG诱导表达1~5h,做SDS-PAGE分析,鉴定HCCR-2蛋白的表达。结果:DNA测序证明,获得了HCCR-2基因,其序列与GenBank中报道序列完全一致。SDS-PAGE分析表明,HCCR-2蛋白获得高效表达,其相对分子质量为39kDa,表达量约占菌体总蛋白的25%。结论:HCCR-2基因的克隆和表达均获得了成功,为进一步探讨HCCR基因在骨肉瘤诊治中应用奠定了基础。