腺病毒介导hTGF-β1基因体内转染兔椎间盘对髓核细胞I型、II型胶原的影响

目的:观察腺病毒载体介导外源性人转化生长因子(Ad/CMV-hTGF-β1)对兔椎间盘髓核细胞Ⅰ型、Ⅱ型胶原的影响。方法:纯种成年新西兰大白兔20只,随机分为实验组和对照组,每组10只。于实验组兔腰3、4椎间盘髓核内注射Ad/CMV-hTGF-β1(6×106pfu),注射量为20μl,对照组则注射20!μl磷酸盐缓冲液(PBS)。术后3周取出椎间盘,免疫组织化学方法观察椎间盘髓核细胞中Ⅰ型、Ⅱ型胶原的表达情况,并用VIDAS图像分析系统进行半定量分析。结果:免疫组织化学染色显示:实验组椎间盘髓核细胞Ⅰ型胶原的表达比对照组低;而Ⅱ型胶原的表达则比对照组高,差别有统计学意义(P<0.05)。结论:体内转染腺病毒介导的hTGF-β1基因能降低椎间盘髓核细胞Ⅰ型胶原的表达、提高Ⅱ型胶原的表达,提示hTGF-β1可以抑制椎间盘的退变。     

腺病毒介导hTGF-β1基因体内转染兔椎间盘对髓核细胞Ⅰ型、Ⅱ型胶原的影响

目的观察腺病毒载体介导外源性人转化生长因子(Ad/CMV-hTGF-β1)对兔椎间盘髓核细胞Ⅰ型、Ⅱ型胶原的影响.方法纯种成年新西兰大白兔20只,随机分为实验组和对照组,每组10只.于实验组兔腰3、4椎间盘髓核内注射Ad/CMV-hTGF-β1(6×106pfu),注射量为20μl,对照组则注射20μl磷酸盐缓冲液(PBS).术后3周取出椎间盘,免疫组织化学方法观察椎间盘髓核细胞中Ⅰ型、Ⅱ型胶原的表达情况,并用VIDAS图像分析系统进行半定量分析.结果免疫组织化学染色显示实验组椎间盘髓核细胞Ⅰ型胶原的表达比对照组低;而Ⅱ型胶原的表达则比对照组高,差别有统计学意义(P＜0.05).结论体内转染腺病毒介导的hTGF-β1基因能降低椎间盘髓核细胞Ⅰ型胶原的表达、提高Ⅱ型胶原的表达,提示hTGF-β1可以抑制椎间盘的退变.     

腺病毒介导hTGF-β1基因体内转染兔椎间盘髓核细胞的表达

目的　观察以腺病毒为载体的外源性治疗基因Ad CMV hTGF β1转染兔椎间盘髓核细胞后的表达。　方法　采用本实验室构建的腺病毒载体基因Ad CMV hTGF β12 0 μl(6× 10 6 pfu)注射于纯种成年新西兰大白兔腰椎间盘髓核内 ;手术后不同时间分别取出椎间盘 ,用免疫组织化学方法对椎间盘髓核细胞进行基因表达产物测定 ;用VIDAS图像分析系统进行半定量观察。　结果　免疫组织化学染色显示注射Ad CMV hTGF β1椎间盘 ,4d组可见髓核细胞内呈现阳性染色颗粒 ;1周组即显示强阳性染色 ,阳性表达持续至 12周组。实验对照组及自身椎间盘对照组呈阴性或弱阳性反应。　结论　椎间盘髓核作为靶细胞能够被外源性基因转染 ;腺病毒载体基因Ad CMV hTGF β1转染兔椎间盘髓核细胞后能在相当长时间内表达TGF β1蛋白     

正常腰椎间盘的测量及其临床意义

目的:为腰椎间盘人工髓核(PDN)置换术提供解剖学参数。方法:对12具新鲜成人尸体标本的椎间盘进行解剖,测量椎间盘的中部矢状径和横径、椎间盘髓核中部的矢状径和横径。结果:48个椎间盘髓核的矢状径为20.5±3.5mm(14.4～25.4mm),其中10.4%大于24mm;髓核中部的横径为33.8±2.8mm(27.9～37.6mm)。48个椎间盘中部的矢状径为(34.2±5.8)mm(24.6～39.2mm),其中有39.6%(19个)椎间盘中部的矢状径大于或等于37mm,在这19个椎间盘中,有73.7%(14个)椎间盘的髓核中部矢状径小于24mm。结论:根据中国人的腰椎间盘及其髓核的解剖特点,只宜行单枚PDN人工髓核假体置换术。     

去细胞髓核支架材料制备方法的比较学研究

目的探索去细胞化天然髓核支架,以构建组织工程椎间盘修复脊柱退行性疾病。方法 1个月龄及1岁龄Beagle犬各4只,平均体质量分别为0.6kg、7.5kg。取结构完整椎间盘髓核组织各40块。随机分为4组,每组10块。分别采用化学萃取及酶消化2种方法分别处理Beagle犬椎间盘髓核组织,进行形态学和组织学比较研究,分析并比较不同方法及不同年龄髓核供体的去细胞效果及对基质结构的完整性。以噻唑蓝法进行间接接触细胞毒性实验检测去细胞髓核的细胞生物相容性。结果 1岁龄髓核去细胞处理后残余细胞分别为（4.32±4.15）个/高倍视野（化学萃取组）、（4.98±4.52）个/高倍视野（酶消化组）,显著高于1个月龄髓核组,且结构完整性显著改善。化学萃取与酶消化2种方法制备的去细胞髓核浸提液在1周内的细胞毒性分级均为0级与1级。1个月龄髓核去细胞效果良好,但无论化学萃取或是酶消化法均对基质成分有严重破坏作用,不宜作为去细胞髓核支架的供体。结论酶消化法能够在去除犬1岁龄髓核细胞成分的同时更好地保留细胞外基质框架结构,无明显的细胞毒性,不影响细胞的正常功能;是制备去细胞髓核天然支架的良好方法。     

骨形态发生蛋白2对退变椎间盘组织学和Ⅰ，Ⅱ型胶原的影响

背景：研究表明,退变椎间盘细胞外基质的主要变化是Ⅱ型胶原和蛋白多糖含量的减少和Ⅰ型胶原含量的增加。 目的：观察腺相关病毒介导的骨形态发生蛋白2基因(AAV-BMP-2)对兔退变腰椎间盘内髓核Ⅰ,Ⅱ型胶原的影响。 方法：将12只新西兰大白兔L2-3,L3-4,L4-5,L5-6椎间盘针刺制造退变模型后随机分为3组,每组4只。其中AAV-BMP-2组兔椎间盘注射AAV-BMP-2,AAV组兔椎间盘注射不携带目的基因的空载体,生理盐水组兔椎间盘注射生理盐水,注射后第8周处死动物取其相应的椎间盘常规石蜡包埋,组织切片,以苏木精-伊红染色观察其髓核组织学变化,免疫组织化学法检测髓核组织Ⅰ型、Ⅱ型胶原表达并进行半定量分析。 结果与结论：普通苏木精-伊红染色结果显示AAV-BMP-2组椎间盘内髓核细胞数目较多,呈单个或者簇状分布,髓核结构清晰,无纤维样组织填充。而AAV组和生理盐水组的组织结构相似,髓核内细胞数目少,髓核皱缩干瘪,细胞间为纤维样组织填充且排列紊乱。免疫组织化学染色显示：AAV-BMP-2组椎间盘髓核内Ⅱ型胶原的表达均高于AAV组和生理盐水组(P < 0.05);AAV-BMP-2组椎间盘髓核内Ⅰ型胶原的表达均低于AAV组和生理盐水组(P < 0.05)。结果说明,体内转染AAV-BMP-2能抑制椎间盘髓核细胞表达Ⅰ型胶原,促进椎间盘髓核细胞表达合成Ⅱ型胶原,提示维持椎间盘内胶原的含量、种类,可维持椎间盘内组织学的结构和形态,稳定髓核细胞生长环境,延缓椎间盘的退变。     

不同代次兔髓核细胞的形态学特征和生物学性状

背景：椎间盘退变是个慢性、复杂的过程,然而椎间盘退变其发生机制尚未完全阐明,很难自行修复。近年来研究细胞移植治疗椎间盘退行性变尚处在实验室阶段。研究髓核细胞的生物学性状可为研究椎间盘退变机制、组织工程构建椎间盘、基因治疗等提供理论依据。 目的：研究兔不同代次髓核细胞的生物学特性,旨在找出合适的种子细胞去治疗椎间盘退变性疾病。 方法：从新西兰大耳白兔椎间盘髓核组织中,分离并培养髓核细胞同时进行培养传代,对原代及第3,4代髓核细胞进行苏木精-伊红染色观察细胞形态学变化;甲苯胺蓝染色和免疫细胞化学法检测髓核细胞内聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达;反转录PCR法测定Ⅱ型胶原和聚合蛋白聚糖mRNA的表达水平,观察各代髓核细胞生物学特性的变化。 结果与结论：兔椎间盘髓核细胞可以在体外培养并进行传代,原代髓核细胞一般需7 d左右贴壁,形状呈类圆形或多角形,原代和第3代髓核细胞都呈圆形或多角形,活力较强,苏木精-伊红染色后细胞核被染成均一蓝黑色,胞浆呈现淡粉色;髓核细胞经过甲苯胺蓝染色后,胞浆内呈现天蓝色,通过Ⅱ型胶原免疫组织化学染色后,胞浆内表现为黄褐色沉淀。到第4代细胞出现退变,Ⅱ型胶原和聚合蛋白聚糖mRNA的表达水平较前几代细胞显著下降。前3代的髓核细胞代谢旺盛,表型一致,聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原表达正常,传第4代后髓核细胞开始出现衰老、退变。     

地塞米松可影响兔髓核细胞增殖及Ⅱ型胶原的表达

背景：地塞米松是细胞增殖的一种常用药物,但能否促进髓核细胞增殖呢？ 目的：观察地塞米松对兔椎间盘髓核细胞增殖的影响,以及对髓核细胞分泌Ⅱ型胶原的影响。 方法：无菌条件下取兔椎间盘,常规分离消化髓核细胞进行培养;传代培养第2代髓核细胞7 d,加入塞米松浓度分别为1,10,100,1 000,10 000 nmol/L,培养1~5 d每日MTT常规测一组490 nm处的吸光值并制定生长曲线。另选取最佳作用浓度100 nmol/L地塞米松加入髓核细胞进行培养,以不加于地塞米松为对照。 结果与结论：MTT检测结果表明地塞米松对兔髓核细胞增殖有促进作用,最佳作用浓度为100 nmol/L,最佳作用时间为    48 h;RT-PCR检测结果表明经地塞米松处理的髓核细胞其Ⅱ型胶原表达明显较对照组高(P < 0.05)。提示地塞米松可以促进兔椎间盘髓核细胞的增殖,并可使兔髓核细胞内Ⅱ型胶原表达增高。     

兔视网膜LANT-6免疫反应节细胞的研究

用免疫组织化学ＡＢＣ法和间接免疫荧光双标法，研究ＬＡＮＴ－６免疫反应神经元在成年兔视网膜的定位与分布。结果表明，ＬＡＮＴ－６免疫阳性细胞体仅位于节细胞层，呈圆形或椭圆形，直径约为１０～４０μｍ，胞体可发生１个或多个树突伸向内网层，在神经纤维层偶见免疫视神经纤维。ＬＡＮＴ－６免疫细胞分布于视网膜各个区，细胞密度以视纹最高，其平均密度为３７８．３±（３０）／ｍｍ２，从视纹向边缘区密度变少，中央区、外围区和边缘区的平均密度分别为２０２±（１０）／ｍｍ２、１１４．３±（１５）／ｍｍ２和２１．６±（７）／ｍｍ２。双标实验的结果表明，兔视网膜的ＬＡＮＴ－６免疫神经元是视网膜节细胞。上述结果提示ＬＡＮＴ－６可能对视网膜节细胞与视觉中枢之间的神经传递起重要作用。     

bFGF对人退变椎间盘髓核细胞影响的临床研究

目的:探讨bFGF对人退变髓核细胞合成细胞外基质的影响,观察退变髓核细胞基因表达量高于正常髓核细胞的生长刺激因子对退变髓核细胞的影响。方法:分离、培养人退变椎间盘髓核细胞,取第2代髓核细胞,随机将退变椎间盘髓核细胞分为5组。A组:加入100μg/L bFGF;B组:加入200μg/L bFGF;C组:500μg/L bFGF;D组:1 000μg/LbFGF,E组:对照组,不加干扰因素。通过对试验组和对照组髓核细胞测定细胞II型胶原和糖胺多糖的mRNA表达;检测细胞外基质II型胶原和糖胺多糖表达水平。结果:bFGF刺激退变髓核细胞,II型胶原、糖胺多糖mRNA,细胞外液Ⅱ型胶原和糖胺多糖含量在第7天较对照组增加明显(P<0.05)。14 d、21 d II型胶原、糖胺多糖mRNA明显低于对照组(P<0.05)。但细胞外液Ⅱ型胶原和糖胺多糖含量在14 d、21 d两个时间点仍高于正常组(P<0.05)。结论:根据本研究结果结合文献调研,bFGF在椎间盘髓核细胞中存在着双重效应(促进或改善椎间盘退变)。     

猪隐孢子虫内生发育虫体超微结构观察

用扫描电镜和透射电镜技术观察了猪隐孢子虫(Cryptosporidium suis)sucp分离株在5日龄仔猪体内内生发育虫体形态结构和寄生特点。结果发现,感染前期和高峰期,在盲肠、结肠和直肠有虫体寄生,而感染后期仅在直肠上发现虫体,并且多集中在肠腺区域。实验观察到滋养体、裂殖体、大配子体、合子和孢子化卵囊等不同阶段的虫体。虫体周围一定区域的微绒毛融合、萎缩或倒伏,肠粘膜上的微绒毛明显脱落。中期滋养体营养器和致密带之间有一层较宽的特殊结构,并且该结构到后期滋养体和裂殖体阶段消失,这层特殊结构尚未见文献报道。在带虫空泡内膜与虫体外膜形成的致密带上方存在典型的呈竖向或斜向排列的纤维塞状结构(microfilament plug)营养器。     

不同时期视网膜前体细胞的培养

目的 研究不同时期视网膜前体细胞的培养.方法 分离E14和E18 SD大鼠的视网膜前体细胞,用改进DMEM/F12无血清培养基悬浮培养并利用体外诱导分化、免疫细胞化学、扫描电镜和透射电镜等方法对细胞进行鉴定.结果 视网膜前体细胞在DMEM/F12无血清培养基中悬浮成球,贴壁后,细胞逐渐从细胞球向周围迁移分化.扫描电镜可见细胞球和分化细胞的形态,透射电镜可见细胞球和分化细胞的超微结构.免疫细胞化学显示,悬浮培养的细胞球中大部分细胞表达神经外胚层源性干细胞标志物nestin和细胞分裂增殖标志物BrdU.贴壁后,视网膜前体细胞能分化为多种视网膜细胞类型,包括Thy1.1阳性的视网膜神经节细胞.E14和E18视网膜神经节细胞的百分比分别为16.91%±4.05%和4.65%±1.88%,两组比较,差异有统计学意义(t=15.04,P＜0.001).结论 改进DMEM/F12无血清培养基可成功培养视网膜前体细胞,培养的细胞具有无限增殖和多向分化潜能.早期视网膜前体细胞向视网膜神经节细胞分化的百分比较高.     

癫痫患者大脑病灶组织的透射电镜研究

本文运用透射电镜对癫痫病人手术分离的脑组织病灶的超微结构进行了观察。主要病理变化有：（1）质膜系统的崩解。"脱髓鞘"现象及细胞膜的断裂或缺失;（2）细胞核的变性,异染色质增多及染色质边缘化,有的出现凋亡小体,提示可能有癫痫引发的细胞凋亡;（3）神经丝的紊乱,说明低分子量的神经丝蛋白过量表达.可能是由于膜破损引起Ca2+的大量内流,继而激活了某些代谢通路所致．同时,Ca2+内流也可能是细胞凋亡的原因;（4）内膜系统的肿胀和扩张。     

大鼠肺泡巨噬细胞吞噬煤尘颗粒的实验研究

本实验用相差显微电影、溶酶体荧光定位和透射电镜等方法,研究了大鼠离体肺泡巨噬细胞吞噬煤尘的作用,并用二氧化矽和酵母菌作实验对照。结果表明,煤尘颗粒同二氧化矽类似,经过附着,迅速以吞噬体形式被摄入胞浆,而酵母菌呈典型的伪足包围和缓幔吞噬过程。实验证明,用吖啶橙作活细胞溶酶体定位是有效的。被标记的溶酶体发出强橙色荧光。当煤粒吞噬体进入胞浆后,常被多个溶酶体接触包围,形成次级溶酶体。电镜观察提示,煤尘可引起次级溶酶体膜的损害。     

己烯雌酚对未成熟大鼠卵巢卵泡颗粒细胞分化的形态学观察

取出生后21～26天Sprague-Dawley未成熟雌性大鼠,分为实验与对照两组。实验组只/天注射己烯雌酚(DES)0.5mg(溶于芝麻油中),并按注射天数分为2、3、4、5天组;对照组注射等量的芝麻油。注射2天后,逐日取材固定,用光镜和电镜观察两组动物的卵巢和卵泡颗粒细胞。同时从各组卵巢中分离出卵泡颗粒细胞,用无血清McCoy 5a培养基培养,加入不同的激素,分为对照组、FSH组、DES+FSH组、FSH+hCG组。培养3天后,取材固定,用光镜、透射电镜、扫描电镜观察各组的细胞形态,结果为:1.实验组卵巢比对照组的大,卵泡也大。卵泡细胞增多,细胞体积大,分裂象多见。2.注射3天以上DES的卵巢中,闭锁卵泡和退化的卵泡细胞增多。3.电镜下,实验组卵泡细胞中与蛋白质合成有关的细胞器比对照组发达。4.体外培养的卵泡颗粒细胞,对照组细胞排列分散;FSH组细胞集聚成团,细胞表面微绒毛增多;细胞质内与合成蛋白质有关的细胞器比对照组的发达。DES+FSH组的细胞排列和结构与FSH组的相似。FSH+hCG组细胞体积增大,细胞表面微绒毛减少或消失。细胞质内出现滑面内质网,细胞开始黄体化。5.注射2～5天DES的各组细胞形态和结构均相似。从形态学来看,经DES处理的未成熟雌鼠的卵泡颗粒细胞的形态、排列和对不同激素作用下的变化,与文献报道的去垂体雌鼠的同类细胞相似。因此我们认为,未成熟雌鼠的卵泡颗粒细胞也能作为研究细胞分化的一种模型。     

大鼠两型肺泡巨噬细胞吞噬煤粒的图像分析和扫描电镜研究

用微分干涉差显微镜、扫描电镜和图像分析技术,对大鼠两型肺泡巨噬细胞体外吞噬煤粒能力及吞噬方式做进一步研究。结果显示,球型细胞吞噬煤粒能力较扁平型细胞强。两型细胞均可伸出细长突起,捕捉细胞周围的煤粒,煤粒逐渐陷入,被细胞以内吞方式摄入胞体。还对单位时间内巨噬细胞摄入的煤粒,进行了定量测定,为细胞吞噬无机粉尘物质提供了一种新的研究方法和测量手段,也为尘肺发病机理研究提供一些形态学依据。     

大鼠脑脊髓不同部位室管膜上皮细胞表面的超微结构特征--扫描电镜观察

目的 研究大鼠脑脊髓室管膜上皮细胞的区域性结构特征，并初步探讨其功能。方法 采用扫描电子显微镜观察法。结果 侧脑室壁室管膜上皮细胞游离端呈不规则多边形，可见纤毛及微绒毛，偶见分泌泡。侧脑室脉络丛上皮细胞游离端呈不规则多角形、梭形或三角形，微绒毛、分泌泡丰富，纤毛少见，可见“丛上细胞”。第Ⅲ脑室室管膜上皮细胞具明显区域性，脑室底部上皮细胞微绒毛短小、散在，有少量分泌粒，无纤毛；侧壁分泌泡较多，纤毛丰富；均可见“丛上细胞”。第Ⅲ脑室脉络丛上皮细胞可见大量细长微绒毛，分泌泡及“丛上细胞”较少。室问孔室管膜上皮呈梭形，长轴与室间孔平行，游离面罕见微绒毛，“丛上细胞”较多。穹窿下器及终板处室管膜细胞纤毛少见，而正中隆起处可见大量纤毛及微绒毛，并可见单个散在的纤毛上皮细胞。中脑导水管壁具有平行走向的纵嵴，游离面可见大量纤毛、微绒毛及分泌泡。第Ⅳ脑室室管膜上皮具大量长纤毛及微绒毛，分泌泡罕见。第Ⅳ脑室脉络丛上皮游离面呈多型性，可见短小密集的微绒毛及处于不同分泌周期的分泌泡，以及形态各异的“丛上细胞”，偶见纤毛上皮细胞及特殊的单鞭毛上皮细胞。脊髓中央管结构较简单，游离面可见大量长纤毛、微绒毛及分泌泡。结论 大鼠脑脊髓室管膜不同部位上皮细胞游离面超微结构差异，可能与其功能不同有关。分泌泡、纤毛及微绒毛的大小及多寡，可能是脑脊液的分泌、流动及代谢活性中分别有区域性不同的形态学基础。