低浓度超顺磁性氧化铁标记兔骨髓间充质干细胞的体外磁共振成像研究

目的:以浓度为25μg Fe/ml的超顺磁性氧化铁纳米粒子(SPIO)体外标记兔骨髓间充质干细胞(BMSCs),并探讨1.5 T核磁共振仪成像的特征和成像所需最低标记细胞浓度,以及在标记后1 d、1周、2周、3周、4周的信号变化特征。方法:分离、纯化、培养兔BMSCs并以25μg Fe/ml的SPIO培养液浓度标记,对标记后不同时间的细胞行普鲁士蓝染色和台盼蓝拒染后显微镜观察,并进行MR成像,测量不同序列下不同浓度标记细胞管的信号强度,以确定扫描敏感序列及成像所需最低标记细胞浓度;再测量不同细胞浓度不同时相信号强度,来观察信号强度随时间变化的规律,并进行统计学分析。结果:浓度为25μg Fe/ml的超顺磁性氧化铁纳米粒子标记BMSCs的有效率接近100%,普鲁士蓝染色见细胞浆内有大小不等的蓝染铁颗粒,且在标记后4周内细胞仍具有活力,标记后的BMSCs在T2WI、尤其是GRE(T2*WI)序列信号明显降低;并且细胞浓度越高信号降低越明显,GRE序列MR成像的最低细胞浓度为5×104/ml。当标记细胞浓度为5×104/ml时,信号在T2*WI序列的降低2周后失去统计学意义;而在细胞浓度为5×105/ml时,标记3周后,信号在T2*WI序列的降低才失去统计学意义。结论:25μg/ml铁浓度标记干细胞不仅标记效率高,而且对细胞生长及增殖活力无明显影响,标记后MR信号改变与干细胞数目及标记时间相关。     

超顺磁性氧化铁标记鼠骨髓间充质干细胞的体外MR成像研究

目的: 探讨不同浓度超顺磁性氧化铁(SPIO)颗粒标记鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的标记率和对细胞活力的影响,以及MR成像显示磁标记干细胞的可行性.材料和方法: 将不同浓度的SPIO-PLL复合物与培养基混合,行普鲁士蓝染色观察细胞内铁和检测细胞活力.应用1.5T MR仪,以T1WI和T2WI行磁标记干细胞成像.结果: SPIO可有效标记MSCs,标记后的铁颗粒位于细胞质内.SPIO标记的MSCs可引起T2WI信号降低,50、100、150较25μg Fe /ml的信号强度降低明显.结论: SPIO可以简便标记MSCs,并在适当浓度下对细胞活力没有影响,此技术为干细胞移植的MR活体内示踪奠定基础.     

超顺磁性氧化铁标记小鼠淋巴细胞MR成像特性探讨

目的 探讨超顺磁性氧化铁(SP IO)标记小鼠脾脏淋巴细胞及其体外MR成像的可行性.方法 取5只小鼠脾脏淋巴细胞,采用100、50、25、15、10、5μg/ml的SPIO联合3μg/ml的多聚赖氨酸(PLL)标记淋巴细胞,确定最佳标记浓度.普鲁士蓝染色鉴定细胞内铁.取30份新鲜、标记、未标记淋巴细胞行台盼蓝染色检测细胞存活率的变化.用对照组及2×106、5×106和10×106个/ml的标记后淋巴细胞接种于琼脂糖凝胶中行3.0 T MR T2 WI、T2+WI及磁敏感加权成像(SWI)序列扫描,相同细胞浓度不同序列及相同序列不同细胞浓度时各取21个感兴趣区测量MR信号值.采用组间独立样本t检验比较细胞存活率;单因素方差分析比较MR信号值差异.结果 SPIO联合PLL成功标记小鼠淋巴细胞,最佳SPIO浓度为5μg/ml.普鲁士蓝染色显示细胞内存在蓝染铁颗粒,阳性率为(93.6±2.1)％.30份台盼蓝染色细胞样本,新鲜分离的淋巴细胞存活率为(94.8±3.1)％,细胞培养6h后,标记组和未标记组淋巴细胞存活率分别为(88.7±2.7)％和(88.9±3.2)％.标记组同未标记组细胞间存活率差异无统计学意义(t =0.281,P＞0.05),但标记组、未标记组存活率同培养前相比,其下降均有统计学意义(t值分别为8.125、7.253,P值均＜0.05).相同浓度细胞,T2WI信号降低最弱,SWI信号降低最明显.结论 SPIO联合PLL能有效标记小鼠淋巴细胞,且不影响其存活率,标记细胞体外3.0T MR成像可行,以SWI序列最敏感.     

雷帕霉素对内皮祖细胞数量与功能的影响

目的观察雷帕霉素对外周血内皮祖细胞（EPCs）数量与功能的影响。方法采用密度梯度离心法从外周血获得单个核细胞,将其接种在人纤维连接蛋白包被的培养板上,培养7天后收集贴壁细胞,加入不同浓度（1.0、2．0、5．0ug／m^3）雷帕霉素分别培养6、12、24、48h。激光共聚焦显微镜鉴定,FITC-UEA-I和Dil-acLDL双染色阳性细胞为正在分化的EPCs,流式细胞仪检测其表面标志以进一步鉴定EPCs,并在倒置荧光显微镜下计数。然后分别采用MTT比色法、改良的Boyden小室、黏附能力测定实验和体外血管生成试剂盒来观察EPCs的增殖能力、迁移能力、黏附能力和体外血管形成能力。结果EPCs数量随雷帕霉素浓度与作用时问增加而减少,其增殖能力、迁移能力、黏附能力和体外血管形成能力亦随雷帕霉素浓度与作用时间增加而降低。结论雷帕霉素降低EPCs的数量、增殖能力、迁移能力、黏附能力和体外血管形成能力,并呈浓度和时间依赖性。     

SHU555A标记大鼠骨髓间充质干细胞的磁敏感加权成像

目的 探讨超顺磁性氧化铁颗粒体外标记大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow stem cells,BMSC)后磁敏感加权成像序列显示移植细胞的可行性.方法 使用不同终浓度(7 μg/ml、14 μg/ml、28 μg/ml和56 μg/ml)的SHU555A标记大鼠骨髓间充质干细胞,标记后进行普鲁士蓝染色、细胞内铁颗粒的透射电镜观察及体外磁敏感加权序列成像,并将标记后的BMSC移植入正常大鼠脑内,移植后第1、3周和7周进行3.0T MRI磁敏感加权序列成像.结果 细胞普鲁士蓝染色及透射电镜显示铁颗粒散在分布于细胞胞质内.标记细胞的Ependoff管在SWI序列图像上呈明显低信号,且随SHU555A标记浓度的增高,标记细胞的Ependoff管信号强度在SWI序列幅值图及磁敏感加权图像上依次降低.标记后的BMSC移植入正常大鼠脑内1周后,SWI序列图像可见正常脑组织背景上团块状类圆形局限性极低信号影;移植7周后局部仍可显示低信号.结论 MRI磁敏感加权序列图像不仅可在体外明确显示SHU555A标记所致的低信号,且标记细胞移植入正常大鼠脑内最长达7周后仍可在磁敏感加权序列图像上显示.     

高糖对外周血内皮祖细胞数量和功能的影响

目的　观察高糖对外周血内皮祖细胞(EPCs)数量和功能的影响。方法　密度梯度离心法获取外周血单个核细胞 ,培养 7天后 ,收集贴壁细胞并加入不同浓度葡萄糖使培养液终浓度分别为 1 5、2 5、35和 4 5mmol/L ,并干预一定时间 (6、1 2、2 4和 4 8h)。多波长激光共聚焦显微镜鉴定FITC UEA Ⅰ和DiI acLDL双染色细胞为正在分化的EPCs,流式细胞仪检测其表面标志进一步鉴定EPCs,倒置荧光显微镜下计数。然后 ,分别采用MTT比色法、改良的Boyden小室、黏附能力测定实验和体外血管生成试剂盒分别观察EPCs的增殖、迁移、黏附和体外血管生成能力。结果　高糖呈量效和时效地减少外周血EPCs数量 ,4 5mmol/L浓度高糖作用 2 4h对EPCs数量的影响最为显著 (较对照组减少了近 1 / 2 ,P <0 0 1 )。高糖也显著抑制外周血EPCs的黏附、迁移、增殖和体外血管生成能力。结论　高糖可减少EPCs数量、抑制其功能 ,并呈浓度和时间依赖性     

GFP转基因胎鼠神经干细胞的体外磁标记及MRI

目的 探讨超顺磁性氧化铁颗粒(superparamagnetic iron oxide, SPIO)标记绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)转基因胎鼠神经干细胞(neural stem cells, NSCs)后对其生物学特性的影响及标记后MR成像效果.方法 采用多聚赖氨酸PLL(0.75 μg/ml)介导SPIO(25 μg Fe/ml)的方法标记GFP转基因胎鼠NSCs,用普鲁士蓝染色观察标记后NSCs内铁,比较标记和未标记NSCs的GFP表达、活力、增殖、凋亡及多向分化能力,并对标记的NSCs行MRI.结果 普鲁士蓝染色示标记NSCs胞质内见大量蓝色颗粒.标记与未标记细胞的活力、增殖、凋亡及多向分化能力经单因素方差分析后均显示2组细胞间无统计学差异(P值均＞0.05).MRI示1×105个/0.5 ml细胞管在T2*WI中可见明显低信号改变.结论 用PLL介导SPIO标记GFP转基因胎鼠NSCs是一种可行、安全、有效的细胞内标记方法.1.5T MR仪能够在体外观察到标记后的细胞,以T2*WI序列最为敏感.     

铁羧葡胺标记猪间充质干细胞的体内外磁共振成像研究

目的 探讨铁羧葡胺-多聚赖氨酸复合物标记猪骨髓间充质干细胞(MSC)的体外和活体心脏内MR成像的特点.方法 分离培养猪MSC,用含铁羧葡胺-多聚赖氨酸复合物标记细胞24 h.分别于标记后0、4、8、12、16、20 d行普鲁士蓝染色观察细胞内铁,原子吸收分光光度仪测定细胞内含铁量,锥虫蓝排除试验检测细胞活力.对不同时间点、不同细胞数的磁标记干细胞进行1.5 T MR仪体外成像,并对植入猪心肌内的标记细胞进行体内MR成像.结果 ①MSC标记后见胞质中大量普鲁士蓝着色颗粒,标记率达100%,铁离子含量平均为(13.13±2.30)pg/细胞;随细胞的分裂增殖,细胞内铁离子含量逐渐减少,16 d时铁离子含量下降到(0.68±0.20)pg/细胞,接近标记前水平[(0.21±0.06)pg/细胞,P＞0.05].干细胞磁标记后各时间点的锥虫蓝拒染率与未标记细胞无统计学差异(P＞0.05).②3种成像序列中GRE T2*WI信号改变最为明显,成像细胞数量越多,信号强度变化越明显.1×106个细胞进行MR成像,发现随着标记后体外培养时间延长,T2*WI磁标低信号逐渐消失,12 d以后信号强度和标记前无差异(P＞0.05).体外MR成像最少能检测到5×104～1×105个标记的猪MSC.③标记细胞心肌内移植后1周MR成像显示低信号区.结论 应用铁羧葡胺-多聚赖氨酸复合物标记猪MSC安全、高效;体外MR信号强度能一定程度上反映磁标记细胞的数量及增殖情况;1.5 T临床MR成像仪可对植入心脏的磁标记细胞进行活体显像示踪.     

心脏磁共振在体示踪移植细胞的可行性研究

目的：寻找一种能够对移植细胞进行在体示踪的标记方法,为移植细胞存留、迁移提供重要观察手段。方法：从中华小型猪髂骨处抽取骨髓,体外培养扩增骨髓间充质干细胞（MSCs）。将SPIO和MSCs共同孵育培养36h。普鲁士蓝染色评价细胞的标记效率;通过MTT比色实验评价SPIO对细胞生长能力的影响;台盼蓝染色检验标记后细胞的活性;使用Costar Transwell方法评价铁离子对细胞迁移能力的影响;用细胞分化诱导液培养标记后的细胞评价其向成脂肪细胞和成骨细胞的分化能力。在体内实验中将SPIO标记或未标记的自体MSCs注射到心肌内,通过心脏磁共振检查对移植细胞进行在体示踪观察,取材动物心脏行病理检查观察移植细胞的存活、存留。结果：MSCs经铁离子标记后普鲁士蓝染色阳性率在98%以上,可见蓝色颗粒位于细胞浆内,标记细胞电镜切片可见高密度铁颗粒位于细胞浆内。随着培养液中SPIO浓度的增加细胞增殖能力没有明显改变;标记后98%的细胞保持活性;SPIO标记后的细胞保持原有的形态,可继续培养、传代;SDF-1和VEGF诱导的迁移实验发现标记细胞迁移能力没有降低;铁离子标记后细胞仍可向成脂肪细胞和成骨细胞分化。注射到心肌内的SPIO标记的MSCs可通过心脏磁共振检查进行在体示踪,动态观察显示SPIO标记细胞在磁共振图像上表现为低信号,并且在移植后4周仍可成像。病理学检查可以看到移植细胞呈普鲁士蓝染色阳性,并和影像学有很好的一致性。结论：临床使用的SPIO磁共振对比剂可以安全、有效地标记MSCs,心脏磁共振检查可以实现SPIO标记的移植细胞的在体示踪。     

青蒿琥酯对乳腺癌细胞的生长抑制作用及其机制

目的探讨青蒿琥酯对乳腺癌细胞MDA-MB-231的生长抑制作用及其可能机制。方法利用CCK-8法检测青蒿琥酯对MDA-MB-231细胞的生长抑制作用,并计算IC₅₀值。根据IC₅₀值选择后续实验的青蒿琥酯浓度(0、25、50、100 μg/ml),0 μg/ml青蒿琥酯组作为对照组。采用不同浓度(0、25、50、100 μg/ml)的青蒿琥酯干预MDA-MB-231细胞24 h,利用流式细胞术检测细胞凋亡情况及线粒体膜电位;0、25 μg/ml青蒿琥酯干预MDA-MB-231细胞24 h,利用细胞划痕试验检测细胞迁移能力,Transwell实验检测细胞侵袭能力。结果青蒿琥酯对MDA-MB-231细胞具有增殖抑制作用,且呈浓度依赖性,对MDA-MB-231细胞的IC₅₀为54.24μg/ml。不同浓度的青蒿琥酯干预MDA-MB-231细胞24 h,MDA-MB-231细胞凋亡率显著增高(P<0.01);与对照组相比,青蒿琥酯组细胞线粒体膜电位显著降低(P<0.01),且呈浓度依赖性。细胞划痕实验结果显示,青蒿琥...