体外培养条件下人骨髓间充质干细胞碱性成纤维细胞生长因子基因的转染与鉴定

背景:骨髓间充质千细胞的定向分化需要合适生长因子的调控,利用细胞因子基因转染促进其生长,定向分化和加速骨缺损修复是近年来研究热点.目的:探讨在体外培养条件下转染碱性成纤维细胞生长因子基因对人骨髓间充质干细胞生物学特性的影响.方法:将含人pcDNA3.1-bFGF真核表达载体DH-5α菌扩增,用EndoFree质粒抽提纯化试剂盒抽提质粒,并对所提取的pcDNA3.1-bFGF重组表达质粒进行酶切鉴定和测序.利用脂质体将pcDNA3.1-bFGF质粒转染到生长良好的P3代骨髓间充质干细胞,G418筛选获得抗性克隆.采用荧光定量PCR、免疫组化、免疫荧光、Westem-blot检测转染后骨髓间充质干细胞碱性成纤维细胞生长因子基因及其产物的表达,流式细胞仪检测细胞增殖周期.结果与结论:脂质体介导pcDNA3.1-bFGF重组表达质粒转染骨髓间充质干细胞后,转染细胞确实表达碱性成纤维细胞生长因子,且表达部位丰要位干胞浆.转染细胞增殖活力加强,处于增殖周期的细胞比例更高(P<0.05).提示采用脂质体转染法能将pcDNA3.1-bFGF成功导入体外培养的骨髓间充质干细胞,碱性成纤维细胞生长因子基因转染后可改善骨髓间充质干细胞的生存状态,促进其增殖.     

胰岛素样生长因子1基因转染兔脂肪间质干细胞的增殖

背景:基因工程是目前软骨修复的主要方法,脂肪间质干细胞以其来源丰富、取材容易、免疫相容性良好、体外培养可以较长时间保持分化表型、有较强的向软骨细胞转化的能力而成为理想的种子细胞.目的:探讨胰岛素样生长因子1基因转染对兔脂肪间质干细胞增殖的影响.设计、时间及地点:细胞学基因转染体外观察,于2006-03/2007-03在中国医科大学细胞生物实验室完成.材料:成年新西兰大白兔3只,由中国医科大学实验动物中心提供.含有全长人胰岛素样生长因子1 cDNA片段的质粒pcDNA3.1-hIGF-1由吉林大学徐莘香教授惠赠.方法:取兔颈后皮下脂肪,Ⅰ型胶原酶消化法体外分离培养兔脂肪间质干细胞.取传至第2代细胞,以0.5× 106/孔密度接种于6孔板,细胞融合至90%～95%时随机分为未转染组、转染空载体pcDNA3.1组、转染质粒pcDNA3.1-hIGF-1组,采用脂质体介导基因转染法进行质粒pcDNA3.1-IGF-1转染,经G418筛选后培养4周.主要观察指标:采用RT-PCR及Western blot方法检测胰岛素样生长因子1的表达情况,MTT法及流式细胞仪检测细胞增殖情况.结果:转染pcDNA3.1-hIGF-1组的脂肪间质干细胞内有大量胰岛素样生长因子1 mRNA及蛋白表达,未转染组及转染空载体pcDNA3.1组无表达.细胞增殖曲线显示,转染质粒pcDNA3.1-hIGF-1组的脂肪间质干细胞增殖速度较其他2组细胞明显加快.流式细胞仪检测显示,转染质粒pcDNA3.1-hIGF-1组的脂肪间质干细胞较其他2组细胞的S期比例显著增加(P<0.05),G1期比例显著下降(P＜0.05).结论:质粒pcDNA3.1-IGF-1转染兔脂肪间质干细胞后,可以获得稳定表达,并能明显促进脂肪间质干细胞的增殖.     

转化生长因子β1转染骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化

目的:通过转化生长因子β1基因转染大鼠的骨髓间充质干细胞,观察目的基因的分泌情况及干细胞向软骨细胞分化效果,为构建新型的软骨组织工程学种子细胞提供新思路。方法:实验于2005-10/2006-09在中国医科大学细胞生物实验室完成。实验材料:6周龄Wistar大鼠10只,质粒pcDNA3.1-TGF-β1(由吉林大学徐莘香教授惠赠),转化生长因子β1、Ⅱ型胶原小鼠抗大鼠单克隆抗体(Neomaker公司)。实验分组:分为未经转染的骨髓间充质干细胞(未转染组)、转染空载的骨髓间充质干细胞(转染空载体组)和转染转化生长因子β1的骨髓间充质干细胞(转染转化生长因子β1组)。实验方法:①密度梯度离心法和贴壁分离法相结合分离、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,免疫荧光法检测细胞表面标志。②质粒pcDNA3.1-TGF-β1扩增、提取、鉴定。③转化生长因子β1基因转染骨髓间充质干细胞。实验评估:①四甲基偶氮唑盐法测定筛选后细胞的增殖活性。②Westernblot检测转染后细胞转化生长因子β1和Ⅱ型胶原蛋白表达。结果:①免疫荧光法检测骨髓间充质干细胞:CD29和CD44表达阳性,CD34和CD45表达阴性。②pcDNA3.1-TGF-β1真核表达载体的酶切鉴定:基因测序与GeneBank cDNA序列相符。③转染基因对骨髓间充质干细胞增殖活性的影响:基因转染后骨髓间充质干细胞的增殖力变强,转染组的细胞增殖力高于未转染组和转染空载体组。④转化生长因子β1表达:转染后的骨髓间充质干细胞较未转染和转染空载体的骨髓间充质干细胞分泌转化生长因子β1蛋白增加。⑤Ⅱ型胶原的蛋白表达:在转化生长因子β1目的基因转染后的骨髓间充质干细胞Ⅱ型胶原蛋白表达较未染和转染空载体的骨髓间充质干细胞增强。结论:应用基因转染技术将转化生长因子β1目的基因导入骨髓间充质干细胞中,在蛋白质水平鉴定转染成功,且骨髓间充质干细胞成软骨分化所需的特异性细胞外基质Ⅱ型胶原明显升高,使骨髓间充质干细胞在保持很强的体外传代增殖能力同时,又能产生、表达转化生长因子β1。     

兔脂肪干细胞体外构建组织工程软骨:负载胰岛素样生长因子1基因的作用

背景:前期研究证实在二维培养条件下,转染胰岛素样生长因子1基因能够明显促进脂肪间充质干细胞的增殖.目的:在前期研究基础上,利用壳聚糖明胶复合物为立体培养的载体,观察三维立体培养条件下胰岛索样生长因子1基因转染对兔脂肪间充质干细胞增殖能力的影响,体外初步构建组织工程软骨.方法:分离、培养成年新西兰大耳白兔脂肪间充质干细胞,构建稳定表达pcDNA3.1-IGF-1的细胞株,鉴定后接种于壳聚糖三维支架材料上,分组培养:空白对照组接种未转染基因的脂肪间充质干细胞,空载体组接种胰岛素样生长因子1诱导条件下培养的脂肪间充质干细胞,基因转染组接种稳定转染胰岛素样生长因子1基因的脂肪间充质干细胞,培养1周.扫描电镜观察各组细胞形态,MTT法绘制细胞增殖曲线,CM-DiL荧光标记后观察细胞增殖比率及细胞分布,DMMB法测定糖胺聚糖含量.结果与结论:成功构建稳定表达pcDNA3.1-IGF-1的细胞株,转染后的细胞株在mRNA水平上获得胰岛素样生长因子1的表达,并成功翻译为蛋白.扫描电镜示各组细胞在支架上贴附、伸展良好,基因转染组细胞生长最为旺盛.MTT及GAG检测结果提示,基因转染组增殖能力最强、糖胺聚糖最高(P<0.01),荧光标记显示细胞分布均匀,存活率高(P<0.05).提示胰岛素样生长因子1基因转染联合三维立体培养能够有效促进兔脂肪间充质干细胞的增殖和软骨细胞外基质糖胺聚糖的分泌.     

SOX-9真核表达质粒转染兔骨髓基质细胞的可行性

背景：SOX-9在软骨组织的发生和发育中具有重要作用，可促进间充质细胞凝集，具有转录激活结构域，能直接调控转录。目的：选用SOX-9基因构建pDC316．SOX-9质粒转染兔骨髓基质细胞，观察SOX-9基因对骨髓基质细胞生长特性及产物表达的影响。设计、时间及地点：细胞基因工程体外实验，于2006—06／2007-01在中国科学院北京基因组研究所完成。材料：SPF级6周龄新西兰大白兔8只，用于分离培养骨髓基质细胞。方法：采用脂质体介导法将构建的pDC316-SOX-9质粒转染兔骨髓基质细胞，细胞转染分为SOX-9质粒转染组、空质粒组、只加入等量脂质体的空白对照组。主要观察指标：通过细胞形态、细胞生长活性、免疫组织化学及HE染色、RT-PCR法、ELISA法检测SOX-9基因转染骨髓基质细胞是否成功。结果：pDC316-SOX-9质粒转染4d出现小片的细胞集落，挑取克隆扩增培养后，细胞呈梭形纤维状。随转染时间的延长，空白对照组细胞逐渐死亡，SOX-9质粒转染组、空质粒组的细胞活性均显著延长，在转染2周达高峰，之后逐渐降低。转染第6天，SOX-9质粒转染组骨髓基质细胞免疫组织化学染色呈棕黄色，稳定表达SOX-9蛋白，HE染色可见多个双核细胞，细胞增殖旺盛，与成软骨细胞类似；空质粒组无SOX-9蛋白表达，组胞增殖分裂不旺盛。SOX-9质粒转染组表达SOX-9mRNA，空质粒组及空白对照组均无SOX-9 mRNA表达。转染后24，48，72h及1，2周，SOX-9质粒转染组细胞上清液中SOX-9含量均明显高于空质粒组、空白对照组（P〈0．01）。结论：利用pDC316-SOX-9质粒成功转染兔骨髓基质细胞，增强细胞生长活性，并能持续稳定的分泌SOX-9蛋白，可诱导骨髓基质细胞向软骨方向分化。     

转化生长因子β1基因转染鼠脂肪间充质干细胞的可行性

背景:脂肪间充质干细胞在转化生长因子β_1等生长因子的调控下可被诱导分化为软骨细胞.然而,外源性转化生长因子β_1存在引起趋化性、激发炎症反应、造成局部损伤、有效成分容易被稀释或丢失、半衰期短、缺少理想的转运蛋白等缺陷.因此,利用基因重组技术,使种子细胞表达转化生长因子β_1,对软骨组织工程的进一步发展具有重要的指导意义.目的:探讨真核表达载体pcDNA3.1-转化生长因子β_1质粒的构建方法,并观察其转染脂肪间充质干细胞的可行性.方法:利用基因重组技术,将大鼠转化生长因子β_1全长基因的PCR产物与克隆载体pT7Blue连接,并用大肠杆菌筛选阳性重组体构建真核表达质粒,采用XboⅠ、Hind Ⅲ双酶切及测序方法对质粒进行鉴定;将已经纯化的pcDNA3.1-转化生长因子β_1质粒和空载体pcDNA3.1质粒分别采用阳离子脂质体试剂LipofectamineTM2000转染脂肪间充质干细胞,经G418抗性筛选后扩大培养,同时用pcDNA3.1-绿色荧光蛋白观察转染效率.结果与结论:重组质粒经XboⅠ、Hind Ⅲ双酶切后出现1.35 bp和5.4 kb 2条带,测序结果显示重组质粒所包含的转化生长因子β_1全长碱基序列完全正确,绿色荧光蛋白显示其转染脂肪干细胞的转染效率> 80%,且转染细胞后有转化生长因子β_1 mRNA和蛋白的表达上调.提示利用基因重组技术可成功构建能转染脂肪间充质干细胞的真核表达载体pcDNA3.1-转化生长因子β_1质粒.     

胰岛素样生长因子1对人脂肪来源的间充质干细胞向软骨细胞定向诱导分化的作用

背景:近年研究者发现胰岛素样生长因子1还可以诱导骨髓来源间充质干细胞向软骨细胞方向分化,但目前尚未见胰岛素样生长因子1诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞方向分化及在此过程中与转化生长因子β1相瓦作用的报道.目的:观察胰岛素样生长因子1诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞定向分化的可能性及在诱导分化中和转化生长因子β1的相互作用.方法:获取脂肪来源间充质干细胞,以2×10~5 cells/cm~2的密度接种于培养瓶,使用含胰岛素样生长因子1或(和)转化生长因子β1的无胰岛素软骨诱导剂诱导脂肪来源间充质干细胞.2周后获取细胞,制备细胞爬片,进行甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,观察细胞内高硫酸化的蛋白聚糖和Ⅱ型胶原着色情况.RT-PCR检测Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan及Sox9mRNA的表达.结果与结论:加入诱导剂后,甲苯胺蓝染色显示3个诱导组细胞呈多角形,胞浆及胞膜呈蓝色异染.Ⅱ型胶原免疫组织化学染色显示3个诱导组细胞胞浆及胞膜呈棕黄色着色.RT-PCR检测显示胰岛索样生长因子+转化生长因子组Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan、Sox9 mRNA的表达均显著强于胰岛素样生长因子组和转化生长因子组,胰岛素样生长因子组和转化生长因子组显著强于对照组,而胰岛素样生长因子组与转化生长因子组差异无显著性意义.提示胰岛素样生长因子1可以单独诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞分化,表达软骨细胞特异性细胞表型,胰岛素样生长因子1与转化生长因子β1诱导脂肪来源间充质干细胞向软骨细胞分化有协同作用.     

人血管内皮生长因子165基因转染兔骨髓间充质干细胞的蛋白表达

背景:骨髓间充质干细胞是最好的组织工程种子细胞来源,含有血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165,VEGF165)不仅对血管再生和启动成骨修复有重要意义,其持续稳定的释放还能够提高新生骨的矿化程度,增强修复组织的力学性能。目的:观察hVEG F165基因转染的兔骨髓间充质干细胞分泌血管内皮生长因子的蛋白功能。方法:体外分离、培养兔骨髓间充质干细胞,纯化并鉴定兔骨髓间充质干细胞;免疫荧光法检测细胞表面标志;传代培养后的骨髓间充质干细胞以pcDNA3.1-VEGF165质粒和脂质体1:3比例的混合液转染,并分为3组:转染组应用pcDNA3.1-VEGF165转染细胞,空载体转染组应用pcDNA3.1-空载体转染,未转染组不处理。通过ELISA和Western-blot检测转染后细胞中外源性血管内皮生长因子的表达。结果与结论:转染组与其他两组比较,VEGF165蛋白含量显著增高,差异有显著性意义(P<0.05),但空载体转染组与未转染组之间差异无显著性意义(P>0.05),转染组不同时间点之间VEGF165蛋白含量差异均有显著性意义(P<0.05),hVEGF165基因转染的骨髓间充质干细胞能成功分泌VEGF165蛋白。提示采用基因转染技术可将hVEGF165基因转染到骨髓间充质干细胞中并可有效表达具有生物活性的VEGF165。     

胰岛素样生长因子1对骨髓间充质干细胞软骨分化及基质金属蛋白酶表达的影响术

背景：以往促进骨髓间充质干细胞软骨分化的研究,多将胰岛素样生长因子1作为辅助因子与其他细胞因子联合应用,而胰岛素样生长因子1单独应用能否促进骨髓间充质干细胞分泌软骨特异性胶原仍存在争议,其对骨髓间充质干细胞软骨分化及软骨胶原纤维稳定性的影响尚不清楚.目的：观察胰岛素样生长因子1对骨髓间充质干细胞软骨分化以及基质金属蛋白酶表达的影响.方法：构建含有胰岛素样生长因子1基因完整编码区的表达载体,稳定转染至大鼠骨髓间充质干细胞,设为胰岛素样生长因子1稳定转染组,同时设未转染组作对照.结果与结论：MTT 检测结果显示,实验成功筛选得到胰岛素样生长因子1稳定过表达的骨髓间充质干细胞,转染后4 d,细胞增殖能力显著增强（P〈0.05）.RT-PCR,Western blot法及免疫细胞化学检测结果显示,与未转染组相比,胰岛素样生长因子1稳定转染组细胞胰岛素样生长因子1,Ⅱ型胶原 mRNA和蛋白的表达水平均显著升高（P〈0.01）,基质金属蛋白酶1,2,3 mRNA表达显著降低（P〈0.01）.结果证实,单独应用胰岛素样生长因子1能够有效促进骨髓间充质干细胞的增殖以及软骨分化,并维持软骨胶原纤维的稳定性.     

体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞

背景:自体软骨细胞来源困难是束缚软骨细胞移植和软骨工程学发展的主要问题之一。骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能,在不同诱导条件下,骨髓间充质干细胞能分化形成多种组织细胞,如软骨细胞、成骨细胞、成肌细胞及神经细胞等。胰岛素样生长因子-I是一种对肢体和软骨的形成及发育起重要调控作用的生长因子。目的:观察胰岛素样生长因子-I和软骨细胞培养液是否能在体外诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。设计:开放性实验。单位:中山大学附属第二医院骨科和医学研究中心。材料:实验于2003-03/11在中山大学附属第二医院医学研究中心完成。人骨髓间充质干细胞取自因健康原因需终止妊娠的4～6月龄水囊引产的胚胎。方法:采用Percoll分离液分离培养人胚骨髓间充质干细胞,体外扩增,用流式细胞仪测定骨髓间充质干细胞的CD44,CD71,CD34,CD45表达;在第4代骨髓间充质干细胞的培养基中加入100μg/L胰岛素样生长因子-I和软骨细胞培养液,采用倒置显微镜观察、Ⅱ型胶原免疫组织化学、细胞内蛋白多糖含量测定等方法判断诱导细胞的形态变化和表达软骨基质的能力。主要观察指标:通过检测细胞CD34,CD44,CD45的表达,进行骨髓间充质干细胞表型鉴定。通过观测诱导后细胞Ⅱ型胶原免疫组织化学及细胞分泌蛋白多糖能力的变化判断其是否向软骨细胞分化。结果:①倒置显微镜观察结果:体外培养的骨髓间充质干细胞呈现成纤维细胞形态。②骨髓间充质干细胞表面抗原鉴定:流式细胞仪结果显示细胞均一性较好,第4代骨髓间充质干细胞阳性表达CD44,阴性表达CD34,CD45,说明分离获得的细胞符合骨髓间充质干细胞的特点。③光镜下观察骨髓间充质干细胞诱导为软骨细胞的形态变化:加入软骨细胞条件培养液和胰岛素样生长因子-I共培养,在培养过程中见骨髓间充质干细胞逐渐变圆,15d后可见部分细胞呈短梭形或多角形,突起短,呈现软骨细胞的特征。④Ⅱ型胶原免疫组织化学染色:胰岛素样生长因子组细胞在培养后第15天约72.5%的细胞可见棕黄色的颗粒分布于胞浆内,呈弱阳性或较强阳性。对照组骨髓间充质干细胞第15天的Ⅱ型胶原免疫组织化学为阴性。⑤蛋白多糖含量测定:胰岛素样生长因子-I和软骨细胞培养液共培养组培养15d后,细胞内蛋白多糖含量为(8.92±0.91)μg/L,高于单纯骨髓间充质干细胞培养组[(2.56±0.26)μg/L,P<0.05],但低于软骨细胞组[(13.69±1.51)μg/L,P<0.05]。结论:胰岛素样生长因子-I和软骨细胞培养液能诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。     

人血管内皮生长因子165基因转染兔骨髓间充质干细胞的蛋白表达

背景：骨髓间充质干细胞是最好的组织工程种子细胞来源,含有血管内皮生长因子165（vascular endothelial growth factor 165,VEGF165）不仅对血管再生和启动成骨修复有重要意义,其持续稳定的释放还能够提高新生骨的矿化程度,增强修复组织的力学性能。目的：观察hVEG F165基因转染的兔骨髓间充质干细胞分泌血管内皮生长因子的蛋白功能。方法：体外分离、培养兔骨髓间充质干细胞,纯化并鉴定兔骨髓间充质干细胞;免疫荧光法检测细胞表面标志;传代培养后的骨髓间充质干细胞以pcDNA3.1-VEGF165质粒和脂质体1：3比例的混合液转染,并分为3组：转染组应用pcDNA3.1-VEGF165转染细胞,空载体转染组应用pcDNA3.1-空载体转染,未转染组不处理。通过ELISA和Western-blot检测转染后细胞中外源性血管内皮生长因子的表达。结果与结论：转染组与其他两组比较,VEGF165蛋白含量显著增高,差异有显著性意义（P〈0.05）,但空载体转染组与未转染组之间差异无显著性意义（P〉0.05）,转染组不同时间点之间VEGF165蛋白含量差异均有显著性意义（P〈0.05）,hVEGF165基因转染的骨髓间充质干细胞能成功分泌VEGF165蛋白。提示采用基因转染技术可将hVEGF165基因转染到骨髓间充质干细胞中并可有效表达具有生物活性的VEGF165。     

外源性子宫珠蛋白基因对宫颈癌HeLa细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨人子宫珠蛋白（UG）基因对宫颈癌Hela细胞系细胞增殖及凋亡的影响。方法构建真核细胞表达载体pcDNA3．1-UG（＋），以脂质体介导法稳定转染体外培养的人宫颈癌Hela细胞，同时转染空载体pcDNA3．1质粒，以未转染细胞为对照，转染成功后分别命名为pcDNA3．1-UG（＋）／Hela组、pcDNA3．1／Hela组、Hela组。应用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、Western blot方法分析目的基因表达，并采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法和流式细胞术检测细胞增殖和细胞凋亡。结果pcDNA3，1-UG（＋）／Hela组UGmRNA及UG蛋白出现明显的高表达，与对照组细胞相比差异有统计学意义（P〈0．05）；pcDNA3．1UG（＋）／Hela组细胞生长速度明显慢于未转染Hela细胞，其细胞凋亡率与未转染Hela细胞相比差异也有统计学意义；然而pcDNA3．1／Hela组细胞生长速度和凋亡率均无明显变化。结论转染UG基因能诱导Hela细胞凋亡及抑制Hela细胞生长。     

构建外源性重组pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体转染兔骨髓基质干细胞

背景:在细胞获取、培养、移植等体外环境体系下,骨髓基质干细胞能否有效的应用于局部基因治疗尚不清楚.目的:课题创新性提出构建外源性hBMP-7基因真核表达载体,并期望可提高被转染的兔骨髓基质干细胞诱导成骨能力.设计、时间及地点:细胞-基因学体外观察,于2006-07/2007-07在哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心完成.材料:人健康新鲜胎盘组织由哈尔滨医科大学附属二院妇产科提供,产妇知情同意.健康雄性新西兰大耳白兔1只,由哈尔滨医科大学动物中心提供.方法:从人胎盘组织中克隆出hBMP-7基因,与真核表达载体pcDNA3.1连接,构建重组pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体.从兔骨髓中分离培养骨髓基质干细胞,分为3组:pcDNA3.1-hBMP-7转染组、空载体pcDNA3.1转染组、未转染组.转染前1 d取第2代骨髓基质干细胞5×106个,接种到60 mm3含无抗生素培养基的培养皿中进行转染.主要观察指标:使用RT-PCR、免疫组织化学等方法检测hBMP-7在骨髓基质干细胞中的表达,检测各组细胞碱性磷酸酶、胶原、骨钙蛋白的合成情况.结果:转染72 h后,pcDNA3.1-hBMP-7转染组于1.3 kb处出现特异性条带,细胞胞浆有棕色的颗粒出现,另2组均呈阴性.pcDNA3.1-hBMP-7转染组骨髓基质干细胞碱性磷酸酶活性于转染后第2天显著增高,第8天达峰值,各时间点pcDNA3.1-hBMP-7转染组骨髓基质干细胞碱性磷酸酶活性、羟脯氨酸合成量、骨钙蛋白含量均明显高于其他2组(P<0.05或0.01).结论:实验成功构建了pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体.结局证明了外源性hBMP-7基因可在兔骨髓基质干细胞中充分、高效表达,并且这种外源性hBMP-7基因具备促进兔骨髓基质干细胞向成骨细胞转化的能力.     

pcDNA3.1-成骨生长肽真核表达载体在骨髓基质干细胞中的表达

背景：成骨生长肽具有明显的促进成骨细胞增殖、分化、成熟的作用。目的：观察成骨生长肽基因转染兔骨髓基质干细胞后的表达及表达产物对骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的影响。方法：构建重组真核表达载体pcDNA3.1-成骨生长肽,并在脂质体介导下,将其导入兔骨髓基质干细胞。通过G418筛选获得阳性克隆。RT-PCR方法检测成骨生长肽基因在骨髓基质干细胞内的表达,并观察转染pcDNA3.1-成骨生长肽后骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的情况。结果与结论：实验成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-成骨生长肽,转染pcDNA3.1-成骨生长肽的骨髓基质干细胞可见成骨生长肽mRNA的表达,同时羟脯氨酸的分泌水平增加,碱性磷酸酶活性增高。证实经pcDNA3.1-成骨生长肽转染的兔骨髓基质干细胞不仅可以表达成骨生长肽,而且具有向成骨细胞分化的特性。     

pcDNA3.1-成骨生长肽真核表达载体在骨髓基质干细胞中的表达（英文）

背景:成骨生长肽具有明显的促进成骨细胞增殖、分化、成熟的作用。目的:观察成骨生长肽基因转染兔骨髓基质干细胞后的表达及表达产物对骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的影响。方法:构建重组真核表达载体pcDNA3.1-成骨生长肽,并在脂质体介导下,将其导入兔骨髓基质干细胞。通过G418筛选获得阳性克隆。RT-PCR方法检测成骨生长肽基因在骨髓基质干细胞内的表达,并观察转染pcDNA3.1-成骨生长肽后骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的情况。结果与结论:实验成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-成骨生长肽,转染pcDNA3.1-成骨生长肽的骨髓基质干细胞可见成骨生长肽mRNA的表达,同时羟脯氨酸的分泌水平增加,碱性磷酸酶活性增高。证实经pcDNA3.1-成骨生长肽转染的兔骨髓基质干细胞不仅可以表达成骨生长肽,而且具有向成骨细胞分化的特性。     

基因防龋疫苗构建及其在哺乳动物细胞中的表达特征

背景葡聚糖结合蛋白B(gbpB)具有良好的免疫原性,但能否作为免疫防龋的候选基因疫苗有待研究.目的观察gbpB真核表达质粒在哺乳动物细胞COS-7的表达情况.设计设立对照的实验研究.地点和对象实验在解放军第四军医大学口腔医学院牙体病科完成,对象为Pbs-gbpB质粒(本实验室构建).干预通过基因重组技术构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-gnpB,脂质体转染法将其转染至COS-7细胞.免疫组化SABC法检测,DAB显色.主要观察指标转染后细胞胞浆、胞核着色情况.结果pcDNA3.1(+)-gbpB质粒转染的细胞胞浆中呈棕黄色染色,胞核中无着色,pcDAN3.1(+)空载体转染的细胞胞浆及胞核无着色,空白对照组也无着色.结论质粒pcDNA3.1(+)-gbpB转染COS-7后能够在细胞内翻译、表达,表达的蛋白质位于胞浆中,可与抗GbpB抗体特异性结合,具有抗原性,可作为基因疫苗.     

酪氨酸激酶对鼻咽癌细胞成瘤的影响

目的:研究酪氨酸激酶(Etk/BMX)转染对鼻咽癌细胞成瘤的影响。方法:利用脂质体2000将野生型Etk/BMX表达质粒pcDNA3.1-Etk导入Etk/BMX低表达水平的鼻咽癌细胞株sune-1中,建立Etk/BMX稳定高表达细胞株sune-wt,空质粒pcDNA3.1转染细胞作为对照(sune-vector)。流式细胞仪检测其转染效率,然后分别接种于裸鼠,对成瘤率及大小进行比较。结果:成功筛选到持续高表达Etk的sune-wt细胞,流式细胞仪检测Etk表达(75.5±2.34)%。sune-wt较之sune-vector和sune-1成瘤率较高,肿瘤生长较快。结论:Etk/BMX在鼻咽癌中可促进细胞增殖,增加致瘤性。     

慢病毒介导shRNA LINGO-1质粒转染促进骨髓间充质干细胞向神经细胞转化的研究

目的:探究慢病毒介导shRNA LINGO-1质粒转染促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经细胞转化的研究。方法:利用shRNA基因干扰技术,构建shRNA LINGO-1干扰载体,慢病毒转染BMSCs,根据病毒转染情况分成空白对照组(未转染慢病毒的BMSCs)、空载体病毒组(转染不含shRNA LINGO-1干扰载体慢病毒的BMSCs)、干扰载体病毒组(转染shRNA LINGO-1干扰载体慢病毒的BMSCs)。利用流式细胞仪检测BMSCs的表面蛋白,利用RT-PCR和Western-Blot检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、巢蛋白的表达。结果:CD44和CD29在第2代BMSCs的表达为60.2%和58.3%;CD34和CD45在第2代BMSCs的表达为3.4%和2.6%。慢病毒转染效率为90%以上。空白对照组、空载体病毒组和干扰载体病毒组的GFAP、NSE、NF和巢蛋白m RNA的相对表达量比较差异有统计学意义(P<0.05),其中空载体病毒组和空白对照组的比较差异无统计学意义(P>0.05),干扰载体病毒组和空载体病毒组的差异有统计学意义(P<0.05)。Western-blot检测蛋白表达量也具有同样的表达特点。结论:慢病毒介导shRNA LINGO-1干扰载体转染促进BMSCs可提高BMSCs向神经细胞转化的效率。