βB2—晶体蛋白的克隆和在大肠杆菌中的高效表达物纯化

表达βＢ２－晶体蛋白，以研究其结构与功能的关系。方法用ＲＴ－ＰＣＲ的方法从大鼠晶状体中获βＢ２－晶体蛋白的ｃＤＮＡ，将ｃＤＮＡ克隆到表达载体ｐＭＯＮ５７４３，杂Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＪＭ１０１，     

βB2-晶体蛋白的克隆和在大肠杆菌中的高效表达和纯化

目的表达βＢ２－晶体蛋白，以研究其结构与功能的关系。方法用ＲＴ－ＰＣＲ的方法从大鼠晶状体中获得βＢ２－晶体蛋白的ｃＤＮＡ，将ｃＤＮＡ克隆到表达载体ｐＭＯＮ５７４３，转染Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＪＭ１０１，以萘啶酮酸诱导表达βＢ２－晶体蛋白，用ＤＥＡＥ纤维素层析纯化。结果ＲＴ－ＰＣＲ扩增获得约７００ｂｐ的ｃＤＮＡ，在Ｅ．ｃｏｌｉ中获得高效表达，βＢ２－晶体蛋白占细菌总蛋白的３０％。ＤＥＡＥ纯化后获一２４ｋＤ蛋白，分子量与βＢ２－晶体蛋白一致。结论βＢ２－晶体蛋白ｃＤＮＡ可在大肠杆菌中获高效表达，表达产物的分子量约２４ｋＤ。     

βB2晶体蛋白基因敲除小鼠模型的建立

目的:建立βB2晶体蛋白基因敲除小鼠模型.方法:采用美国iGTL实验室的技术构建打靶载体,建立基因敲除小鼠模型.采用PCR对小鼠基因型进行鉴定,Western印迹法对晶体蛋白的表达进行鉴定.结果:PCR成功检测出3种基因型;纯合子基因敲除的小鼠未检测到βB2晶体蛋白的表达.结论:成功构建了βB2晶体蛋白基因敲除的小鼠模型.     

βB2基因敲除小鼠睾丸组织长链非编码RNA的差异性表达分析

目的 探讨长链非编码RNA(lncRNA)在βB2基因敲除小鼠睾丸中的表达及其影响睾丸发育的可能机制.方法 采用lncRNA芯片技术,筛选野生型(WT)和βb2基因敲除(KO)小鼠睾丸组织(均n=3)中lncRNA及信使RNA(mRNA)表达谱的变化;对差异表达lncRNA和mRNA进行GO数据库分析及KEGG数据库分析,建立调控网络图;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证差异表达的lncRNA和mRNA,探讨调控通路.结果 (1)两组小鼠睾丸组织差异表达的lncRNA共140条,mRNA共477条;(2)通过GO数据库分析,筛选出差异表达lncRNA共12条,其中上调7条,下调5条;(3)经KEGG数据库进行路径分析,发现差异表达mRNA主要经由Ca2+信号、配体-受体相互作用等信号通路起作用;(4)用关联矩阵法建立了lncRNA和mRNA共表达网络图,共有17个节点,12条连接,包含9条lncRNA和8条mRNA;其中Rsl1由3条lncRNA调控,Lpo和Mpo各由2条lncRNA调控,Hdac1、Ephb4等各由1条lncRNA调控.(5) qRT-PCR分析结果表明,在βB2基因敲除小鼠睾丸组织中,lncRNA A-30-P01019163和P2rx7的表达均下调(P＜0.05).结论 lncRNA与βB2基因的晶状体外功能密切相关,其中lncRNA A-30-P01019163可能通过调控下游P2rx7 mRNA的表达影响睾丸组织细胞周期及信号转导,进而调控睾丸发育.     

前列腺素E2对人肝癌细胞β1-integrin表达调控及相关机制的研究

目的:阐明前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)通过EP1受体上调肝癌细胞Huh-7中β1-integrin的表达及其相关的信号转导通路?方法:用PGE2?EP1受体激动剂(17-PT-PGE2)?EP1受体抑制剂SC19220?NF-κB抑制剂PDTC处理Huh-7细胞,通过Western blot?免疫荧光组织化学实验等方法检测β1-integrin蛋白表达水平和NF-κB的活性?结果:5 μmol/L的PGE2处理Huh-7细胞24 h后,β1-integrin的表达水平与对照组相比上升了129.48% (P < 0.01),5 μmol/L EP1受体激动剂17-PT-PGE2处理使细胞β1-integrin的蛋白表达水平升高了216.34%(P < 0.01)?10 μmol/L的EP1受体抑制剂SC19220处理后β1-integrin表达水平与PGE2组相比下降了34.51%(P < 0.05)?免疫荧光组织化学实验显示17-PT-PGE2处理Huh-7细胞120 min后,NF-κB核表达水平明显增加;Western blot实验显示5 μmol/L 17-PT-PGE2处理Huh-7细胞120 min后,磷酸化NF-κB-p65上升了209.27%(P < 0.01)?NF-κB抑制剂PDTC处理Huh-7细胞后β1-integrin蛋白表达水平与EP1受体激动剂组相比降低了63.49%(P < 0.01)?结论:PGE2可通过EP1受体上调Huh-7细胞中β1-integrin的表达,此调节作用可能与NF-κB信号转导通路有关?     

2型糖尿病胰岛β细胞凋亡机制

2型糖尿病(T2DM)是一种多基因遗传性疾病,其病因及发病机制目前尚不十分清楚.一般认为,T2DM的发生是多源性的,是环境因素和遗传因素共同作用的结果.近年研究证实,胰岛β细胞功能上的改变在发病初期起关键作用,由凋亡所致的β细胞数量减少及胰岛功能受损在整个病程中都起着重要的作用.本文就近年来2型糖尿病胰岛β细胞凋亡机制的研究进展作一综述.     

基于β2AR2/βarrestin2/NFκB通路的地佐辛对心肌缺血再灌注损伤大鼠的作用及机制

目的 探讨地佐辛对心肌缺血再灌注损伤大鼠β2肾上腺素受体(β2AR)/β抑制蛋白2(β-arrestin2)/核转录因子-κB(NF-κB)通路及心肌凋亡的影响。方法 60只大鼠随机分为假手术组（Sham组）,心肌缺血再灌注模型组（MIRI组）,地佐辛高、中、低剂量组（20、10、5 mg/kg）,每组12只。地佐辛各剂量组在造模前30 min经股静脉注射相应剂量的地佐辛,Sham组和MIRI组给予等量生理盐水,采用手术结扎大鼠冠状动脉左前降支的方法复制大鼠MIRI模型。再灌注2 h后,检测各组大鼠心率（HR）、左心室收缩压（LVSP）、左心室舒张末（LVEDP）,评价心脏功能;并检测血清中肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶MB（CKMB）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）水平;HE染色观察左心室组织学变化;TUNEL染色观察心肌细胞凋亡情况,计算凋亡指数;免疫组织化学法检测心肌组织Bcl-2、Bax、Caspase-3的蛋白表达;Western blot检测心肌组织β2AR、β-arrestin2、IκBα、NF-κB p65蛋白表达。结果 心肌组织病理学可见,Sham组心肌纤维完整、排列整齐,MIRI组心肌严重受损,局部肌纤维横纹消失,大量炎性细胞浸润;与Sham组相比,各治疗组明显好转。与Sham组相比,MIRI组大鼠HR、LVSP、Bcl-2/Bax比值、心肌组织β2AR、β-arrestin2、IκBα蛋白表达显著降低,各治疗组较MIRI组明显升高（均P＜0.05）;与Sham组相比,MIRI组LVEDP、血清CK、CK-MB、TNF-α、IL-6水平、心肌组织Bcl-2、Bax、Caspase-3、NF-κB p65蛋白表达、心肌细胞凋亡率显著升高,各治疗组较MIRI组明显降低（均P＜0.05）。结论 地佐辛可抑制炎症反应,减少心肌细胞凋亡,对MIRI大鼠具有保护作用;其作用机制可能与上调β2AR、β-arrestin2、IκBα的表达,降低NF-κB p65表达有关。     

人源脂肪细胞SH2B1β基因的克隆表达

目的获取人源脂肪细胞SH2B1β基因序列,构建SH2B1β-pET28a(+)重组表达质粒,在大肠杆菌中对其进行表达。方法利用RT-PCR方法从人源分化成熟的脂肪细胞RNA中扩增出SH2B1β的cDNA片段,并插入pET28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),通过IPTG诱导表达带6×His标签的融合蛋白。结果PCR和酶切电泳鉴定结果显示SH2B1β基因克隆入载体中,测序结果证实克隆的基因序列与GenBank中的人源SH2B1β序列相符,SDS-PAGE电泳结果表明获得相对分子质量约75000的目的蛋白。结论成功获取了人源脂肪细胞的SH2B1β基因,并在BL21(DE3)中高效表达目的蛋白,为下一步表达纯化SH2B1β重组蛋白及蛋白的初步功能研究奠定基础。     

2型糖尿病发病机制及胰岛β细胞功能障碍的研究进展

2型糖尿病发病机制主要是胰岛素抗性和胰岛β细胞功能受损,而后者是2型糖尿病发病的中心环节。造成胰岛β细胞功能受损的病理机制,主要是脂毒性和糖毒性。具有保护和改善胰岛β细胞功能药物主要有磺脲类药物、三磷酸腺苷敏感的K+通道开放剂、胰升糖素样肽1及其衍生物、胰岛素增敏剂等;中药主要包括开郁清胃、益气养阴、活血化瘀类。     

蛋白酪氨酸磷酸酶1B对胰岛β细胞功能影响的研究进展

酪氨酸磷酸化作为一种重要的翻译后调节机制在调控人体新陈代谢稳态中起重要作用.蛋白酪氨酸磷酸酶1B(protein tyrosine phosphatase 1B,PTP1B)对胰岛素信号通路的负调节作用使其成为2型糖尿病等代谢综合征治疗的潜在靶点.本文综述了PTP1B的结构特征、对胰岛β细胞数量、分泌功能及β细胞内质网应激和炎症反应的影响,提示PTP1B抑制剂对保护β细胞及治疗2型糖尿病具有重要意义.     

β细胞功能相关2型糖尿病易患基因的研究进展

2型糖尿病是环境和遗传因素共同作用引起的代谢紊乱,是以胰岛素分泌不足和作用障碍引起高血糖为特征的临床综合征。此前,大多数关联分析和候选基因研究只发现了少量的2型糖尿病相关疾病易患基因位点,而全基因组关联研究的出现改变了这种格局,发现了大量与2型糖尿病相关性较强的基因位点,其中大多与β细胞功能下降相关。2型糖尿病易患基因的发现,有助于人们更好地了解其发病机制,并制订相应的诊断、预防和治疗措施。该文就2型糖尿病易患基因与β细胞功能的相关性予以综述。     

B细胞在多发性硬化发病中的作用机制及相关治疗进展

多发性硬化（MS）是青壮年神经功能障碍最常见的病因之一,是中枢神经系统典型的炎症性脱髓鞘疾病,可导致髓鞘和轴突损伤。关于MS的发病机制有很多报道,B细胞耗竭疗法（如抗CD20单克隆抗体的成功应用）提示了B细胞在触发MS疾病中的关键作用。本文对近年来B细胞在MS发病中的作用机制及相关治疗进行述评,以帮助临床医生提高对MS发病机制及治疗的认识。     

解偶联蛋白2基因表达与胰岛β细胞分泌功能的关系及机制

目的 观察长期高脂饮食对大鼠胰岛β细胞胰岛素分泌功能的影响,探讨解偶联蛋白2(UCP2)及相关的氧化应激在其中的作用及机制.方法 8周龄SD大鼠随机分为正常饲料组(NC组,20只)和高脂饲料组(HF组,20只).饲养20周检测以下指标:(1)血浆硝基酪氨酸,丙二醛(MDA)和还原型谷胱甘肽(GSH)水平;(2)正常血糖高胰岛素钳夹试验,评价外周组织胰岛素抵抗程度;(3)胰岛细胞表面灌注试验,评价离体胰岛β细胞动态分泌功能;(4)实时荧光定量PCR方法比较两组大鼠胰岛细胞胰岛素受体底物-1(IRS-1)、胰岛素受体底物-2(IRS-2)以及UCP2mRNA表达的变化.(5)免疫组织化学染色及图像分析检测IRS-1,IRS-2在两组大鼠胰岛中的表达.结果 (1)HF组血浆硝基酪氨酸(0.17±0.01)μmol/L和MDA(22±5)nmol/L水平高于NC组(0.14±0.02)μmol/L,(13±3)nmol/L,(P均＜0.05),GSH水平(103±9)mg/ml明显低于NC组(142±9)mg/l,(P＜0.01);(2)HF组葡萄糖输注率(GIR)较Nc组明显降低(P＜0.01);HF组葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)功能明显下降(P＜0.01);(3)HF组胰岛细胞IRS-1及IRS-2mRNA表达分别降低42.3%、28.1%,UCP2表达增高32.5%(P均＜0.05).(4)HF组胰岛IRS-1和IRS-2的表达较对照组分别降低26.3%(P＜0.05)和11.2%(P＞0.05).(5)UCP2与胰岛细胞IRS-1 mRNA表达呈负相关(r=-0.621,P＜0.05);且与IRS-2mRNA表达也呈负相关(r=-0.416,P＜0.05).结论 长期高脂饲养能导致大鼠胰岛细胞胰岛素信号分子表达下降,β细胞胰岛素分泌功能受损,具体机制推测与UCP2相关的氧化应激增强有关.     

整合素-β1在转化生长因子-β2诱导晶状体上皮细胞转化中的作用

目的探讨整合素-β1(integrinβ1)在转化生长因子-β2(TGF-β2)体外诱导晶状体上皮细胞(HLECs)向肌成纤维细胞转化中的作用。方法体外培养的HLECs,选择传3代的细胞进行实验,以TGF-β2作为诱导剂。免疫荧光方法检测HLECs integrinβ1、E-cadherin、α-SMA和F-actin的表达,RT-PCR方法检测E-cadherin和α-SMAmRNA的表达。其中部分细胞预先加入去整合素kistrin孵育1h,再加入TGF-β2刺激细胞48h。结果 TGF-β2处理晶状体上皮细胞后,integrinβ1、α-SMA和F-actin的表达明显增强,细胞E-cadherin表达明显减弱。加入去整合素kistrin后,细胞α-SMA和F-actin的表达明显减弱,细胞E-cadherin表达明显增强。结论 TGF-β2诱导了HLECs转分化,整合素-β1参与了TGF-β2诱导的HLECs向肌成纤维细胞的转化过程。     

青光眼患者房水中转化生长因子-β2的定量研究

目的:通过检测青光眼患者房水中转化生长因子-β2(transforming growth factor-β2,TGF-β2)的水平,探讨TGF-β2在青光眼发病机制中的作用.方法:在手术中收集了31份青光眼患者房水样本,其中原发性开角型青光眼(primary open-angle glaucoma,POAG)11眼、原发性闭角型青光眼(primary angle-closure glaucoma,PACG)10眼、青少年型青光眼(juvenile glaucoma,JG)10眼.另收集10份白内障患者的房水样本作为对照.采用双抗体夹心酶联免疫吸附法检测房水中TGF-β2的含量.结果:POAG和JG组房水中成熟(有生物活性)TGF-β2的浓度分别为256.7±93.3 pg/ml和277.0±103.8 pg/ml,比PACG组151.4±81.0 pg/ml和白内障组136.9±57.7 pg/ml有显著性升高(P＜0.01).而POAG组、JG组和PACG组TGF-β2的总量(有生物活性的+潜活的)分别为1677.5±564.6 pg/ml、1739.4±592.0 pg/ml和1499.2±490.4 pg/ml,各组间比较无显著性差异(P＞0.05),它们与白内障组1004.9±372.1 pg/ml比较均有显著性差异(P＜0.05).结论:POAG和JG患者房水中成熟TGF-β2的水平明显增高,高水平的成熟TGF-β2可能在POAG和JG的发病机制中起着重要作用.     

胰岛B细胞功能评价的方法及相关指数在2型糖尿病中的应用

近年来,对2型糖尿病发病机制的研究逐渐深入,2型糖尿病的发病机理主要与胰岛素抵抗伴胰岛素分泌不足,或胰岛素分泌缺陷伴或不伴有胰岛素抵抗有关。应用多种方法对胰岛B细胞功能进行评价,本文就评价方法及相关指数在2型糖尿病的临床应用作一综述。1     

老年核性及皮质性白内障晶状体上皮细胞中TGF-β2的表达

目的 :比较老年核性及皮质性白内障晶状体上皮细胞中转化生长因子 β2 (TGF β2 )mRNA的表达有无差异 ,结合两种类型白内障晶状体上皮细胞的增殖状态 ,探讨其发病机理。方法 :将老年核性与皮质性白内障的患者分为两组 ,每组 4 0例 (男、女比例 1∶1) ,于白内障超声乳化术中截取其前囊膜 (含晶状体上皮细胞 ) ,用RT PCR的方法检测出每组晶状体上皮细胞中TGF β2 mRNA的水平 ,两组间u检验作统计学分析。结果 :老年核性白内障组晶状体上皮细胞中TGF β2 mRNA的水平低于老年皮质性白内障组 (P <0 .0 1)。结论 :TGF β2 通过调节晶状体上皮细胞增殖状态 ,从而在白内障发生过程中起重要作用。老年核性白内障的发生与晶状体上皮细胞增殖有关 ,而皮质性白内障的发生与晶状体上皮细胞的退行性变有关。     

阿托伐他汀对Ox-LDL/β2GPⅠ/anti-β2GPⅠ诱导的血管内皮功能紊乱的改善作用及其机制

目的:探讨阿托伐他汀(ATO)对氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)/β2糖蛋白Ⅰ(β2GPⅠ)/抗β2糖蛋白Ⅰ抗体(anti-β2GPⅠ)复合物引发的血管内皮细胞损伤的改善作用以及对TRAF3-相互作用蛋白2(TRAF3IP2)/Ikappa B激酶(IKK)/核因子κB(NF-κB)信号通路的影响,阐明ATO改善抗磷脂...     

原花青素B2保护血管内皮细胞延缓凋亡及机制研究

目的 以H2O2诱导人内皮细胞凋亡为模型,观察原花青素B2 (GSPB2)延缓人内皮细胞凋亡的保护作用及其机制.方法 用0.5 mmol H2O2预处理细胞,分别加入不同浓度的GSPB2(5.0、10.0、20.0 μmol/L)保护细胞,TUNEL法检测细胞凋亡;Western blotting检测凋亡相关分子Caspase-3、Bax、Bcl-2以及影响凋亡的相关分子PI3K、p-Akt、Akt的蛋白表达;Transwell小室检测各组细胞迁移情况.结果 0.5 mmol H2O2致人内皮细胞凋亡明显增加(P＜0.01),GSPB2能明显减轻H2O2所致的人内皮细胞凋亡(P＜0.05),10 μmol/mL的GSPB2就能接近恢复到H2O2未处理的对照组水平.进一步研究发现:Caspase-3、bax蛋白表达上调,Bcl-2表达下调;PI3K、p-Akt、Akt表达上调.结论 不同浓度的GSPB2对H2O2诱导的血管内皮细胞具有保护作用,而且表现为浓度依赖性和时间依赖性,其机制与相关分子PI3K、p-Akt、Akt有关.     

COX-2、β-catenin及E-cadherin在乳腺肿瘤中的表达及相关性研究

目的 研究乳腺肿瘤组织中环氧化酶-2(cyelooxygenase-2,COX-2)、上皮钙黏素(E-cadherin,E-cad)及β-连环蛋白(β-catenin)的表达,探讨其相关性及临床意义.方法 采用免疫组化对96例乳腺肿瘤的COX-2、β-catenin及E-cadherin进行检测.结果 COX-2、E-cadherin及β-catenin在乳腺导管内乳头状肿瘤组及不同乳腺肿瘤组中表达的差异有统计学意义(P<0.05),在乳腺肿瘤中E-cadherin和β-catenin之间表达的变化趋势一致,COX-2表达与E-cadherin及β-catenin表达的变化趋势相反,COX-2表达增高时E-cadherin及β-catenin的表达均下降,COX-2与E-cadherin/catenin构成的复合体二者之间表达趋势差异有统计学意义(P<0.05).结论 COX-2的高表达与E-cadherin及β-catenin的低表达在乳腺肿瘤的发生发展过程中起重要的作用,检测其表达异常对判断临床进展、推测预后以及制定针对性的治疗方案有一定的参考价值.