人谷胱甘肽硫转移酶M1真核表达系统序列分析

目的 对人谷胱甘肽硫转移酶M1真核表达系统的构建及序列分析。方法 采用RT-PCR方法将肺组织中提取总RNA扩增人谷胱甘肽硫转移酶M1基因的cDNA序列，将其插入到真核表达载体pcDNA3．1多克隆位点中，构建重组表达质粒，并用PCR扩增、酶切分析及序列测定等方法对重组质粒进行鉴定。结果 入谷胱甘肽硫转移酶M1克隆到真核表达质粒pcDNA3．1中，测序结果同Genbank GSTM1(GI：183668)cDNA序列相比较，在619位点C→A，氨基酸由Pro→Thr；在519位点C→G，编码的氨基酸仍为1ys；在528位点C→T，编码的氨基波仍为Asp。同源性为99％，基因登陆号为AY532926。结论 入谷胱甘肽硫转移酶M1真核表达系统的构建，为进一步进行真核细胞和动物的解毒机制研究，提供应用材料。     

人谷胱甘肽硫转移酶A1真核表达系统的构建及序列分析

目的 构建人谷肽甘肽硫转移酶A1真核表达系统，为毒理学、遗传药理学的研究等提供材料。方法 用RT—PCR技术从人肝脏组织总RNA中分离扩增人谷胸甘肽硫转移酶A1基因的cDNA序列，将其插入到真核表达载体pcDNA3多克隆位点中，构建重组表达质粒，并用PCR扩增、酶切分析及序列测定等方法对重组质粒进行鉴定。结果 人谷胱甘肽硫转移酶A1被正确地克隆到真核表达载体pcDNA3中，测序结果同Genbank序列比较，在152位点T→C，氨基酸由Met→Thr。结论 经酶切鉴定和PCR扩增，证实人谷胱甘肽硫转移酶A1真核表达系统构建成功。     

梅毒螺旋体膜蛋白Tp92真核表达重组体的构建及其表达鉴定

目的 以梅毒螺旋体(Trepondmapallidum，Tp)外膜蛋白基因Tp92为目的基因，构建Tp真核表达重组体pcDNA3．1( )-Tp92，并鉴定其在Hela细胞能否正确表达，为进一步开展TpDNA疫苗动物实验打下基础。方法 应用PCR技术从TpNichols株基因组模板中扩增Tp92基因，定向克隆构建真核表达重组体pcDNA3．1( )-Tp92，脂质体介导将pcDNA3．1( )-Tp92转染入Hela细胞，以免疫酶标法和一步法RT～PCR检测pcDNA3．1( )Tp92在Hela细胞中的表达情况。结果 双酶切及测序鉴定证明成功构建Tp真核表达重组体pcDNA3．1( )-Tp92，DNA测序显示重组质粒含有2103bp的目的基因片段，读码框架正确，无碱基错配及移码突变。测序后结果经与GenBank登录的序列做blast比较，载体上所连目的基因片段序列与GenBank登录的Nichols株Tp92基因序列完全一致，同其他病原性密螺旋体菌株登陆序列比较同源度为95．5％～100％，证实本研究所得到的基因为所需基因，同时也表明该基因为Tp的保守性基因。免疫酶标法结果显示该重组体在Hela细胞能有效表达目的蛋白与梅毒阳性标准血清中相应抗体反应；RT-PCR检测结果显示RT-PCR扩增产物与Tp92基因片段大小相符，确实源于重组质粒转录后的mRNA。结论 TD真核表达重组体pcDNA3．1( )-Tp92的成功构建及在体外真核细胞中的有效表达，为进一步研制梅毒DNA疫苗及其生物学功能的研究奠定了一定的实验基础。     

小鼠抵抗素基因及其反义核酸真核表达体系的构建与鉴定

目的构建载有小鼠抵抗素（resistin）基因及其反义核酸的重组真核表达质粒,为下一步进行resistin生物功能研究打基础。方法用resistin基因mRNA编码区序列特异引物,从小鼠脂肪组织中．通过RT—PCR的方法合成resistin cDNA,T4DNA连接酶将resistin cDNA克隆于pGEM-T载体,经双酶切及测序鉴定克隆成功后再亚克隆于pcDNA3．1^（＋）或pcDNA3．1^（-）真核表达载体,并测序鉴定。结果PCR产物长度与resistin cDNA理论长度363 bp相符;重组pGEM—T被EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ内切酶切为约3000bp和355bp两个片段,测序结果表明插入pGEM-T的DNA片段的核苷酸序列与小鼠resistin基因mRNA编码区序列完全一致。重组pcDNA3．1^（＋）和pcDNA3．1^（-）测序结果表明插入的DNA片段分别与小鼠resistin基因mRNA编码区序列和反义resistin基因mRNA编码区核苷酸序列一致。结论成功克隆载有resistin基因和载有resistin基因反义核酸的重组真核表达质粒。     

阴道毛滴虫氢化酶体腺苷酸激酶基因真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建阴道毛滴虫氢化酶体腺苷酸激酶(adenynate kimse,AK)基因真核表达载体并予以鉴定.方法 根据AK基因已知序列设计合成一对引物,应用PCR技术从阴道毛滴虫基因组DNA中扩增出AK基因,并将其克隆入pMD18-T Simple载体.阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR鉴定后,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定.应用BLAST软件辅助分析所测基因与Genbank中阴道毛滴虫氢化酶体AK序列的同源性.克隆载体PMD-18T-AK经限制性内切酶BamHI和XbaI双酶切,得到含这2个酶切位点之AK DNA片段,T4连接酶连接到含有这2个酶切位点的真核表达载体pcDNA3.1( ),构建出重组真核表达载体pcDNA3.1( )-AK,经凝胶电泳鉴定、酶切鉴定、PCR鉴定证实DNA片段大小的正确性.结果 经凝胶电泳鉴定、酶切鉴定、PCR鉴定证实含大小正确的AK DNA片段.结论 成功地构建了基因真核表达载体.     

结核杆菌含信号肽的Mtb8.4真核表达质粒的构建及在COS-7细胞中的表达

目的：克隆结核杆菌含信号肽的Mtb8．4(MS)基因，导入真核表达载体pcDNA3．1( )，构建成重组质粒pcDNA3．1( )-MS，并在真核细胞中进行表达。方法：提取人结核杆菌H37Rv株的基因组作为模板，进行PCR圹增，获得含信号肽的Mtb8．4(MS)基因后，与pcDNA3．1( )载体进行连接重组，用限制性内切酶消化、PCR及DNA序列分析等多种方法进行鉴定；重组质粒转染COS-7细胞48h后，用RT—PCR方法鉴定MS在转录水平的表达情况。结果：pcDNA3．1( )-MS真核表达载体构建成功；转染COS-7细胞后，MS在转录水平成功表达。结论：pcDNA3．1( )-MS真核表达质粒的构建以及MS在COS-7细胞中的成功表达，为进一步研究该真核表达质粒的免疫保护效果及制备结核病pcDNA3．1( )-MSDNA疫苗奠定了基础。     

日本血吸虫pcDNA3．1．（＋）-SjPGK重组质粒的构建及鉴定

目的 构建日本血吸虫中国大陆株磷酸甘油酸激酶基因片段(SiPGK)的真核表达重组质粒，寻找新的预防日本血吸虫病的候选疫苗分子。方法 采用逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)技术，从日本血吸虫总RNA中体外扩增SPGK基因片段；克隆人pMD18-T载体中，然后挑取阳性克隆经双酶切分析、PCR鉴定；亚克隆人真核表达载体pcDNA3．1( )中，阳性克隆经鉴定后进行脱氧核糖核酸序列测定；运用Blast程序，将测序结果及其推导的编码氨基酸序列与NCBI数据库在核苷酸水平和氨基酸水平进行同源性比较。结果 RT-PCR特异性扩增出一条长约830bp大小的条带；重组质粒pMD18-T-SPGK和pcDNA3．1( )-SPGK经双酶切和以质粒为模板进行PCR扩增，均可获得一条与RT-PCR产物一致的DNA片段；脱氧核糖核酸序列测定和分析结果表明：SjPGK基因片段长为830bp，与SmPGK的核苷酸同源性为85％，分值为672；氨基酸同源性为94％，分值为473。结论 成功地构建pcDNA3．1( )-SiPGK重组质粒，为构建其核酸癌苗提供了条件。     

HOGG1基因特异性锤头状核酶表达载体的构建及其在细胞中表达的研究

目的：设计并合成人8-羟基鸟嘌呤-DNA糖苷酶(HOGG1)特异性的锤头状核酶(hammerhead ribozyme)基因并构建其真核表达载体。初步探讨其在A549细胞中的瞬时表达效应。方法：运用计算机软件人工设计并合成核酶基因(RZ)，将核酶基因克隆到真核表达载体pcDNA3．1( )中，阳性重组子由BamHⅠ和EcoRⅠ酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定及DNA测序证实。大量抽提阳性重组子并在非脂质体转染试剂FuGENE 6的介导下引入人肺腺癌细胞株A549，RT—PCR(逆转录多聚酶链反应)法半定量检测转染细胞中HOGG1 mRNA表达的改变。结果：经酶切电泳及DNA测序证实合成的核酶基因序列正确并已被准确克隆入pcDNA3．1( )的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间，命名为pcDNA3．1( )-RZ。经RT—PCR法检测到转染核酶的靶细胞中HOGG1 mRNA表达下降36％，与空白细胞组差异有显著性。结论：成功合成HOGG1特异性的锤头状核酶基因并构建了该基因的真核表达载体。核酶在A549细胞内对靶基因HOGG1具有抑制其表达的作用。     

结核分枝杆菌RD1区Rv3873基因真核表达载体的构建及鉴定

[目的]构建结核分枝杆菌RD1区Rv3873基因的真核表达载体pcDNA3-Rv3873，并对其进行鉴定。[方法]利用PCR技术从结核杆菌H37Rv中扩增Rv3873基因，并将其定向克隆至原核载体pGEx-4T-1中，经测序鉴定后，将重组质粒pGEX-4T-1-Rv3873中的目的基因亚克隆入真核表达载体pcDNA3．1（＋），构建重组子pcDNA3．1-Rv3873，通过限制性内切酶切酶及PCR进行鉴定。[结果]克隆的Rv3873基因序列与GenBank公布的一致性为100％，限制性内切酶酶切及PCR分析表明Rv3873已成功插入pcDNA3．1（＋）中。[结论]成功构建了Rv3873基因真核表达载体，为进—步研究新型结核杆菌DNA疫苗奠定了基础。     

小鼠抵抗素基因及其反义核酸真核表达体系的构建与鉴定

目的构建载有小鼠抵抗素(resistin)基因及其反义核酸的重组真核表达质粒,为下一步进行resistin生物功能研究打基础。方法用resistin基因mRNA编码区序列特异引物,从小鼠脂肪组织中,通过RT-PCR的方法合成resistin cDNA,T4DNA连接酶将resistin cDNA克隆于pGEM-T载体,经双酶切及测序鉴定克隆成功后再亚克隆于pcDNA3.1(+)或pcDNA3.1(-)真核表达载体,并测序鉴定。结果PCR产物长度与resistin cDNA理论长度363bp相符;重组pGEM-T被EcoRⅠ和XbaⅠ内切酶切为约3000bp和355bp两个片段,测序结果表明插入pGEM-T的DNA片段的核苷酸序列与小鼠resistin基因mRNA编码区序列完全一致。重组pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(-)测序结果表明插入的DNA片段分别与小鼠resistin基因mRNA编码区序列和反义resistin基因mRNA编码区核苷酸序列一致。结论成功克隆载有resistin基因和载有resistin基因反义核酸的重组真核表达质粒。     

肿瘤转移抑制基因KiSS-1的克隆与真核表达载体的构建

目的克隆不含信号肽的人肿瘤转移抑制基因KiSS-1,构建KiSS-1基因的真核表达载体并鉴定。方法从正常人膀胱组织中提取总RNA,经RT-PCR得到KiSS-1基因开放阅读框cDNA序列,将其克隆到真核表达栽体pcDNA3.1( ),构建真核表达质粒pcDNA3.1( )/KiSS-1。结果经基因序列分析及PCR和酶切鉴定,证实目的基因片段已成功插入载体pcDNA3.1( )且序列正确。结论重组质粒pcDNA3.1( )/KiSS-1构建成功,为下一步KiSS-1蛋白的表达和研究该蛋白的功能奠定了良好的基础。     

应用RT-PCR构建人表皮生长因子基因真核表达质粒

目的体外克隆及构建带信号肽的人表皮生长因子(hEGF)基因真核表达质粒。方法设计人表皮生长因子(hEGF)基因和信号肽基因引物,采用RT-PCR技术从胎肾组织总RNA中扩增出hEGF基因和信号肽基因序列,克隆入pGEM-T载体,酶切鉴定和序列分析后经T4连接酶连接并克隆入表达质粒pcDNA3.1( ),再次酶切鉴定和序列分析。结果RT-PCR扩增产物电泳获得约90 bp和180 bp条带,与hEGF及其信号肽cDNA大小符合;克隆入T载体后经序列分析与hEGF及信号肽基因一致,克隆入pcDNA3.1( )质粒后双酶切获得约230 bp和5.4 kb条带,再次测序与hEGF cDNA一致。结论成功构建带信号肽的hEGF基因的真核表达质粒。     

pcDNA3．1（＋）／NspA真核表达载体的构建及鉴定

目的构建pcDNA3.1( )淋病奈瑟菌外膜蛋白—奈瑟菌表面蛋白A(Neisseria surface Protein A,NspA)基因真核表达载体,为研制淋病奈瑟菌核酸疫苗奠定基础。方法根据淋病奈瑟菌NspA基因序列,设计合成一对引物,用PCR方法从淋病奈瑟菌基因组DNA中扩增出NspA基因片段,将扩增的产物连接于测序载体pUCm-T上,并构建重组体pcDNA3.1( )/NspA,进行酶切、PCR及测序鉴定。结果NspA基因体外扩增产物大小约为525 bp。所构建的pcDNA3.1( )/NspA重组体经双酶切及PCR鉴定,与预期片断的大小相符;测序结果与GenBank中收录的NspA全长序列一致,表明pcDNA3.1( )/NspA真核表达载体构建正确。结论成功地构建了淋病奈瑟菌真核重组表达载体pcD-NA3.1( )/NspA,为NspA蛋白的功能研究和淋病奈瑟菌核酸疫苗的研制提供了物质基础。     

幽门螺杆菌Lpp20真核表达重组载体的构建及鉴定

目的以幽门螺杆菌外膜脂蛋白Lpp20为目的基因,构建H.pylori Lpp20基因的真核表达重组载体pcD-NA3.1( )-Lpp20,为H.pylori核酸疫苗的研制奠定实验基础。方法用Pri mer5.0软件分析GenBank中H.pylori外膜脂蛋白Lpp20基因序列,设计合成相应特异性引物,引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点,以H.pylori26695株基因组为模板,PCR扩增Lpp20目的基因片段,定向插入真核表达载体pcDNA3.1( )多克隆酶切位点中,构建重组体pcDNA3.1( )-Lpp20;通过酶切分析,PCR鉴定及测序鉴定,筛选阳性重组体。结果以H.pylori26695株基因组DNA为模板扩增出特异的Lpp20基因片段,大小约为528bp;双酶切及测序鉴定证明成功构建了H.pylori真核表达重组载体pcD-NA3.1( )-Lpp20。结论PCR扩增得到了大小约为528bp的H.pylori Lpp20目的基因片段;并成功构建了pcD-NA3.1( )-Lpp20真核表达重组载体。     

真核表达载体pcDNA3．1-RASSF1的构建及其对肝癌细胞凋亡的影响

目的构建pcDNA3．1－RASSFl真核表达载体,并检测其对肝癌细胞系HepG2凋亡的影响。方法应用聚合酶链反应技术从人RASSFlcDNA中扩增出RASSF1基因后,以内切酶XhoI和EcoRI进行双酶切,将其克隆人用相同酶处理的载体pcDNA3．1;将重组质粒pcDNA3．1－RASSF1转染肝癌HepG2细胞,应用Westernblot法检测RASSF1的表达水平;用AnnexinV／PI法检测细胞的凋亡情况。结果酶切和测序结果表明,重组质粒pcDNA3．1．RASSF1构建成功;Westernblot法结果表明转染pcDNA3．1-RASSF1后HepG2细胞中RASSFl表达升高;AnnexinV／PI法用流式细胞术检测凋亡,空白组、pcDNA3．1组和pcDNA3．1-RASSFl组HepG2细胞的凋亡率分别为（5．8±0．42）％、（7．48±0．68）％和（35．1±3．15）％。结论真核表达载体pcDNA3．1-RASSF1构建成功;RASSF1蛋白在HepG2细胞中高表达,并促进细胞凋亡。     

帕金森病PINK1蛋白真核表达载体pcDNA3．1-myc／PINK1的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的构建帕金森病PINK1基因真核表达载体pcDNA3．1-mye／PINK1,检测其转染COS-7细胞后的表达。方法用PCR方法从人cDNA文库DNA中扩增PINK1全长cDNA,该基因片段两端设计了EcoR I和BamH I限制性酶切位点。将所得片段连接到T载体上测序证实。利用重组DNA技术将PINK1的cDNA构建到真核表达载体pcDNA3．1-myc—his（-）B上,酶切鉴定。通过脂质体介导的转染技术将所构建的载体导入COS-7细胞中,体外培养,于转染48h后利用RT—PCR和Western Blotting方法检测目的基因的表达情况。主要观察指标：（1）PINK1基因cDNA扩增产物检测。（2）pcDNA3．1-myc／PINK1重组体酶切鉴定。（3）Western—blotting。结果经琼脂糖凝胶电泳及测序证实,PCR获得的片段与GenBank中登记的PINK1序列完全相同;pcDNA3．1-myc／CHIP酶切片段的长度与理论大小相符;转染48h后的COS-7细胞可检测到PINK1蛋白的表达。结论PINK1蛋白真核表达载体构建成功,在COS-7细胞中可获得表达。     

人乳腺珠蛋白基因真核表达载体的构建及其表达

[目的]构建人乳腺珠蛋白(hMAM)基因的真核表达载体pcDNA3.1-hMAM,并观察重组载体在COS-7细胞中的表达,为肿瘤DNA疫苗研究奠定基础.[方法]利用PCR方法扩增hMAM基因,酶切测序分析后,克隆入真核表达载体pcDNA3.1,构建真核表达载体pcDNA3.1-hMAM.将重组载体用脂质体转染法转染入COS-7细胞,间接免疫荧光法检测目的基因的表达.[结果]成功扩增hMAM基因,酶切测序结果表明,重组载体含有hMAM基因,在COS-7细胞中可检测到hMAM表达.[结论]hMAM基因的真核表达载体构建成功,为进一步进行DNA肿瘤疫苗研究提供了实验依据.