IL-7和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体的构建

目的：构建白细胞介素7（IL-7）和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）共表达的重组腺病毒载体,为进一步感染干细胞奠定基础。方法：将目的基因IL-7克隆到含有报告基因EGFP的穿梭质粒中,然后再将构建的重组穿梭质粒转移至pAdxsi载体中,构建重组腺病毒载体质粒,继而在H293细胞中扩增,纯化后测定病毒滴度。结果：pShuttle-EGFP-mIL7重组穿梭质粒经酶切鉴定得到0.5kb和5.1kb 2条带;pAdxsi-EGFP-mIL7重组腺病毒载体质粒经酶切鉴定得到14K、11.8K、3.1kb、2.66kb、2.47K、1.45K、0.6K 7条带;TCID50法测定纯化后的病毒滴度为2×10^10pfu/ml。结论：pAdxsi-EGFP-mIL7重组腺病毒载体构建成功。     

IL-7和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体的构建

目的:构建白细胞介素7(IL-7)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)共表达的重组腺病毒载体,为进一步感染干细胞奠定基础。方法:将目的基因IL-7克隆到含有报告基因EGFP的穿梭质粒中,然后再将构建的重组穿梭质粒转移至pAdxsi载体中,构建重组腺病毒载体质粒,继而在H293细胞中扩增,纯化后测定病毒滴度。结果:pShuttle-EGFP-mIL7重组穿梭质粒经酶切鉴定得到0.5kb和5.1kb 2条带;pAdxsi-EGFP-mIL7重组腺病毒载体质粒经酶切鉴定得到14K、11.8K、3.1kb、2.66kb、2.47K、1.45K、0.6K 7条带;TCID50法测定纯化后的病毒滴度为2×1010pfu/ml。结论:pAdxsi-EGFP-mIL7重组腺病毒载体构建成功。     

人IL-2基因克隆及其重组腺病毒载体的构建

目的克隆人白细胞介素2基因（hIL-2），构建其重组穿梭载体pAdBM5-GFP—hIL-2。方法：应用PHA体外刺激培养的Jurkat细胞以促进hIL-2基因表达．设计特异性引物，应用RT—PCR法扩增hIL-2基因。将测序正确的片段用PmeⅠ和BglⅡ双酶切定向插入到pAdBM5-GFP穿梭载体中，酶切鉴定。结果：RT—PCR方法，成功克隆了hIL-2基因，并构建出pAdBM5-GFP-hIL-2真核表达载体．克隆的hIL-2序列全长528bp，含462个碱基开放读框．结论；构建含人白细胞介素2基因片段的重组腺病毒表达载体（pAdBM5-GFP—hIL-2），为下一步扩增重组腺病毒开展肝癌的免疫与基因治疗研究奠定基础．     

腹腔内注射IL-2重组腺病毒、IL-3重组腺病毒增强化疗药物抗白血病作用的研究

对实验性白血病小鼠模型大剂量化疗后,直接腹腔注射IL-2重组腺病毒(Ad-IL-2)和/或IL-3重组腺病毒(Ad-IL-3),发现腹腔注射对照腺病毒载体小鼠虽经大剂量化疗,仍有大量白血病细胞浸润至骨髓、血管、肝脏及脾脏。而腹腔注射Ad-IL-2或Ad-IL-3组小鼠肿瘤生长缓慢,注射Ad-IL-2组小鼠脾NK、CTL活性显著提高,注射Ad-IL-3组小鼠腹腔巨噬细胞数量及杀伤活性明显提高,联合应用Ad-IL-2,Ad-IL-3组小鼠抗白血病作用最为明显,骨髓中虽然仍见白血病细胞,但可见较多正常造血细胞,且肝、脾中未见白血病细胞浸润。表明腹腔内注射Ad-IL-2和Ad-IL-3可显著增强大剂量化疗对白血病的治疗效果。     

突变k-ras基因重组腺病毒的构建

目的　利用细菌内同源重组法构建含 1 2密码子点突变的k ras基因重组腺病毒。方法　用限制性内切酶kpnⅠ +xhoⅠ从载体pcDNA3 k ras1 2 (Val)中切出 1 2密码子点突变的k ras基因片断 ,亚克隆至经同样酶切的腺病毒穿梭质粒pAdTrack CMV中 ,形成转移质粒pAdTrack CMV/k ras 1 2 (Val) ,将之PmeⅠ酶切线性化后与腺病毒基因重组质粒pAdEasy 1共转化大肠杆菌BJ51 83 ,抽提经鉴定含目的基因的重组体质粒 ,PacⅠ酶切后用脂质体转染 2 93细胞 ,包装成重组体腺病毒Ad k ras1 2 (Val)。采用PCR方法对重组体腺病毒进行鉴定 ,利用穿梭质粒pAdTrack CMV中带有GFP报告基因 ,对病毒滴度和感染效率进行监测。结果　利用CaCl2 法由pAdTrack CMV/k ras 1 2 (Val)和pAdEasy 1共转化大肠杆菌BJ51 83 ,可获得 2 5%左右的阳性重组体细菌克隆。PCR检测表明重组腺病毒已含有目的基因 ,滴度为 1 .2× 1 0 1 2 pfu/ml。结论　细菌内同源重组法构建腺病毒相比于传统的细胞内同源重组法 ,具有成功率高、方法简便、快捷、实验周期短的优点 ,值得进一步推广使用     

重组腺病毒载体pAdBM5-GFP-hIL-2的构建及病毒滴度测定

目的:构建重组腺病毒载体pAdBM5-GFP-hIL-2,并测定病毒滴度.方法:从Jurkat细胞中提取mRNA,设计特异性引物,通过RT-PCR法扩增hIL-2基因全编码区序列.将测序正确的片段用Bgl II和Pme I双酶切定向插入到pAdBM5-GFP腺病毒载体中.通过磷酸钙共沉淀法将线性化重组质粒和腺病毒骨架共转染HEK293A细胞,扩增纯化重组腺病毒,TCID50法测定重组腺病毒滴度.结果:成功构建出表达hIL-2基因的重组腺病毒载体(pAdBM5-GFP-hIL-2),获得了高滴度表达hIL-2基因的重组腺病毒.结论:重组腺病毒表达载体(pAdBM5-GFP-hIL-2)的成功构建及重组腺病毒的获得有利于进一步开展肝癌的转基因治疗研究.     

共表达CD40L和IL-2的腺病毒对树突状细胞成熟和IL-12产生的影响

目的探讨共表达人CD40L和IL-2的5/F35嵌合型腺病毒载体(Ad5/F35 CD40L-IL-2),对人单核细胞来源的树突状细胞(Mo-DC)的感染效率及感染后对Mo-DC表型及IL-12产生的影响。方法提取人外周血单个核细胞(PBMCs)总RNA,应用RT-PCR方法克隆CD40L和IL-2,构建Ad5/F35 CD40L-IL-2腺病毒载体。分离和培养人Mo-DC后,应用流式细胞仪分析嵌合型腺病毒载体对Mo-DC的感染效率、CD40L基因表达及感染前后Mo-DC表型的变化;采用ELISA法测定Mo-DC培养上清中细胞因子IL-2和IL-12的含量。结果成功克隆CD40L和IL-2基因并构建成5/F35嵌合型腺病毒载体。Ad5/F35嵌合型腺病毒载体能高效感染Mo-DC,感染效率可达75%以上,Ad5/F35 CD40L-IL-2感染Mo-DC能有效地表达CD40L和分泌IL-2。感染前Mo-DC中CD80、CD86、CD40和HLA-DR呈一定水平表达,而CD83表达水平较低,感染24 h后,CD80、CD86、CD40和HLA-DR表达水平明显上调,特别是CD83。感染不同时间点测定Mo-DC上清IL-12水平,上清中IL-12水平升高呈时间依赖性。结论 Ad5/F35 CD40L-IL-2能高效感染人Mo-DC并表达相应的基因产物,促进Mo-DC成熟和刺激IL-12的分泌。     

复制缺陷型重组腺病毒介导mlFN-β基因治疗小鼠黑色素瘤的研究

目的：探讨人类复制缺陷型重组腺病毒载体介导mIFN-β基因治疗小鼠黑色素瘤的可行性和效果。方法：利用人类复制缺陷型重组腺病毒将目的基因mIFN-β经体外、体内两种途径导入小鼠黑色素瘤细胞（B16细胞）中，观察体外转mlFN-β基因的B16细胞的体内致瘤性和瘤苗作用，及通过腺病毒载体介导的mIFN-β对体内局部肿瘤治疗和抗肿瘤转移的作用。结果：1）携带目的基因的重组腺病毒感染B16细胞能获得较高的转移效率和目的基因的有效表达；2）将mIFN-β基因导入B16细胞对B16细胞的体外增殖能力无明显影响，但能显著提高细胞表面MHC-I类抗原的表达；3）将转mIFN-β基因的B16细胞接种小鼠，其体内致瘤性明显降低．且对对侧野生型B16细胞的致瘤性有抑制作用；4）瘤体内注射和经尾静脉注射途径给予AdCMV mIFN-β．对局部肿瘤和转移瘤有治疗作用。结论：利用人类复制缺陷型腺病毒载体介导mIFN-β基因治疗小鼠黑色素瘤是可行的，并具有较好疗效，提示用腺病毒载体携带有效的目的基因来开发瘤苗和治疗肿瘤具有良好的临床应用前景。     

重组survivin腺病毒的构建与鉴定

目的 构建人基因的重组survivin腺病毒载体,为喉癌的基因治疗研究提供实验基础.方法 聚合酶链反应(PCR)克隆survivin基因,PCR产物与克隆载体连接、转化,鉴定阳性克隆测序后再与腺病毒骨架质粒同源重组,对重组克隆行PCR鉴定和Xho Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切鉴定,并包装、纯化.结果 核酸序列分析证明,所克隆的survivin基因与文献报道一致,克隆成功,而且外源survivin基因正确地插入到腺病毒载体中,表明已成功构建腺病毒载体pLP-Ad-SUR.结论 重组survivin腺病毒载体构建成功.

Abstract：

Objective To construct a recombinant adenovirus of survivin vector and provid valuable reference for gene therapy of laryngeal cancer.Methods The survivin gene was cloned by PCR.After confirmation by enzyme restriction analysis and sequencing, the gene and the adenovirus vector were recombined together to construct the recombinant adenovirus vector.The recombinant adenovirus vector was confirmed via both sequencing and digestion restriction analysis, and then linearized and transfected into the HEK 293 cell line to generate recombinant adenovirus.Results The Sequence analysis demonstrated that the survivin gene sequence was the same as published in the literature, suggesting that a recombinant adenovirus vector has been successfully constructed.Conclusions A survivin recombinant adenovirus has been successfully constructed.     

白介素12重组腺病毒载体的构建及其抗肿瘤作用初步观察

[目的]构建携带小鼠白细胞介素12腺病毒载体(AdCMVmIL-12),并观察其对H22肿瘤的抑瘤效果。[方法]构建重组质粒pdlE1SP1BmIL-12,并用该质粒与质粒pJM17共转染293细胞后包装而成AdCMVmIL-12,并进行酶切法鉴定。同时制备肿瘤动物,通过肿瘤内局部注射AdCMVmIL-12,观察其抗肿瘤作用。[结果]酶切鉴定显示构建正确,其病毒滴度为1.3×109pfu/ml;当病毒滴度为100MOI时,mIL-12浓度达到3417ng/1×106细胞/24h。动物实验表明,注射AdCMVmIL-12的小鼠,肿瘤体积明显小于对照组(P<0.01),生存期显著延长。[结论]构建AdCMVmIL-12成功,肿瘤内局部注射可发挥抗肿瘤作用。     

CONSTRUCTION AND EXPRESSION OF THE REPLICATION-DEFI-CIENT ADENONIRUS VECTOR OF HUMAN GM-CSF

ＣＯＮＳＴＲＵＣＴＩＯＮＡＮＤＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮＯＦＴＨＥＲＥＰＬＩＣＡＴＩＯＮＤＥＦＩＣＩＥＮＴＡＤＥＮＯＮＩＲＵＳＶＥＣＴＯＲＯＦＨＵＭＡＮＧＭＣＳＦＺｈａｎｇＷｅｉｐｉｎｇ章卫平ＣａｏＸｕｅｔａ曹雪涛ＴａｏＱｕｎ陶群Ｈｉｒｏｆｕｍ...     

介导尤文肉瘤融合基因的重组腺病毒的构建及其在外周血单个核细胞(PBMC)中的表达

目的　构建尤文肉瘤融合基因EWS -FLI1重组腺病毒 ,并检测其在外周血单个核细胞(PBMC)中的表达 ,为进一步进行尤文肉瘤的免疫治疗奠定基础。方法　将质粒pEC1EWS/FLI1酶切 ,切出的EWS -FLI1cDNA片段克隆至腺病毒穿梭质粒padtrack -cmv的HCMV启动子下游。将连接后的穿梭质粒和骨架质粒Padeasy -1共同转化大肠杆菌BJ5 1 83菌株 ,获得同源重组后的腺病毒质粒pADEWS/FLI1。将此质粒转染 2 93细胞 ,包装产生腺病毒AdEWS -FLI1。扩增、纯化产生高滴度的AdEWS -FLI1。转染PBMC ,并通过RT -PCR和免疫组化法检测EWS -FLI1的表达。结果　同源重组后产生的pADEWS/FLI1经PCR鉴定构建成功 ,纯化后的滴度为 4× 1 0 10 /ml。转染PBMC后 ,RT -PCR证实有EWS/FLI1mRNA的转录 ,免疫检测法检测在PBMC中有EWS/FLI1的表达。结论　重组腺病毒AdEWS/FLI1构建成功 ,并能在PBMC中稳定有效地表达 ,为进一步进行尤文肉瘤的免疫治疗研究奠定了基础。     

COMBINED IL-2/IL-3 GENE THERAPY FOR G422 MOUSE GLIOBLASTOMA BY INTRATUMORAL INJECTION OF RECOMBINANT ADENOVIRUSES

ＣＯＭＢＩＮＥＤＩＬ２／ＩＬ３ＧＥＮＥＴＨＥＲＡＰＹＦＯＲＧ４２２ＭＯＵＳＥＧＬＩＯＢＬＡＳＴＯＭＡＢＹＩＮＴＲＡＴＵＭＯＲＡＬＩＮＪＥＣＴＩＯＮＯＦＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴＡＤＥＮＯＶＩＲＵＳＥＳ１ＨｏｎｇＢｏ２洪波ＣａｏＸｕｅｔａｏ３曹雪涛Ｙｕ...     

CONSTRUCTION OF THE DICISTRONIC ADENOVIRUS VECTOR EXPRESSING BIOACTIVE HUMAN INTERLEUKIN-12

ＣＯＮＳＴＲＵＣＴＩＯＮＯＦＴＨＥＤＩＣＩＳＴＲＯＮＩＣＡＤＥＮＯＶＩＲＵＳＶＥＣＴＯＲＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧＢＩＯＡＣＴＩＶＥＨＵＭＡＮＩＮＴＥＲＬＥＵＫＩＮ１２ＺｈａｎｇＷｅｉｐｉｎｇ章卫平ＣａｏＸｕｅｔａｏ曹雪涛ＨｉｒｏｆｕｍｉＨａｍａｄ...     

Construction of a recombinant adenovirus Vector of human papillomavirus type 16 L1_E7c

Human papillomaviruses (HPV) that infect thegenital tfact are associated with human anogenital tyactcancer, especially cervical cancer. HPVs are thought to bethe primary causative agent in more than >90% ofcervical cancers, with type 16 being the most frequentlyfound type in human cervical cancers.ll] Low-riskHPV6/ll infections can cause condylomata throughsexual transmission. The advance of research on acandidate prophylactic vaccine against papillomavirusinfection has been made. Expressi…     

CONSTRUCTION AND IDENTIFICATION OF RETROVIRAL VECTOR EXPRESSING HUMAN INTERLEUKIN-17 GENE

ＣＯＮＳＴＲＵＣＴＩＯＮＡＮＤＩＤＥＮＴＩＦＩＣＡＴＩＯＮＯＦＲＥＴＲＯＶＩＲＡＬＶＥＣＴＯＲＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧＨＵＭＡＮＩＮＴＥＲＬＥＵＫＩＮ１７ＧＥＮＥＣａｏＸｕｅｔａｏ曹雪涛ＨｕａｎｇＸｉｎ黄欣ＷａｎＴａｏ万涛ＺｈａｏＺｈｏｎｇｌｉａ...     

腺病毒E1A基因高效真核表达载体的构建与鉴定

目的构建真核高效表达该基因的载体,为进一步探讨运用高效表达Ｅ１Ａ的重组质粒进行肿瘤基因治疗及研究Ｅ１Ａ基因的作用机理和与其他基因的相互作用提供方法。方法运用分子克隆技术构建２套用较强启动子驱动的表达Ｅ１Ａ的真核重组质粒,并用多种限制性内切酶和ＤＮＡ测序对重组质粒进行鉴定。结果构建的重组质粒分别含有１．３４ｋｂ和１．７７ｋｂＥ１Ａ片段,分别命名为ｐＥ１Ａ１和ｐＥ１Ａ２,且插入的方向均为正向,无重排等异常现象,核苷酸序列无误。结论为人腺病毒５型（Ａｄ５）Ｅ１Ａ基因实验性抗肿瘤基因治疗包括放射增敏研究提供方法学及资料。     

表达抗血管内皮细胞生长因子核酶和白细胞介素24腺病毒载体的构建及其对结肠癌HT-29细胞的毒性作用

肿瘤的发生是一个多基因改变过程,因此,在肿瘤基因治疗过程中,以单一基因为靶点的治疗很难取得显著的抗肿瘤效果.我们构建了同时带有双基因抗血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)发夹状核酶(Rz)和白细胞介素24(interleukin-24,IL-24)的腺病毒载体,并初步观察了其对结肠癌HT-29细胞的毒性作用.     

CRT180基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的构建表达CRT180基因重组的腺病毒载体,为肿瘤的基因治疗奠定实验基础。方法采用腺病毒表达系统（Vira Power^TM Adenoviral Expression System）构建重组腺病毒表达载体。首先利用RT-PCR的方法在人肺腺癌细胞系A549细胞中扩增CRT180基因,以连接、转化等方法克隆入载体pENTR／D—TOPO以获得重组的入门克隆,经测序及PCR鉴定正确后,用重组酶（LRClonase^TMⅡ Enzyme Mix）进行入门克隆与腺病毒表达载体（pAd—CMV／V5-DEST）间的重组反应,以获得表达克隆（rAd．CRT180）质粒。重组表达克隆鉴定后,用限制性内切酶PacⅠ是使之线性化后转染HEK293A包装细胞得到重组腺病毒。用极限稀释法检测病毒滴度用Western Blot法检测rAd．CRT180载体是否能正确表达CRT180蛋白。结果用RT-PCR的方法扩增到CRT180基因;重组入门和表达克隆经酶切和PCR鉴定构建正确,重组表达克隆转染HEK293A细胞获得病毒原液并扩增后测定病毒滴度为1．8×10^11pfu／mL,且这个病毒能正确表达CRT180蛋白。结论成功构建了CRT180基因的重组腺病毒载体,可为此重组载体用于肿瘤基因治疗提供实验依据。