口蹄疫病毒VP1基因真核表达载体的构建及其在树突状细胞的表达

目的:构建口蹄疫病毒VP1基因的真核表达载体, 转染并筛选稳定表达VP1的树突状细胞(dendritic cell, DC).方法:将pMD-18-VP1克隆于pcDNA3.1(+)中, 构建重组质粒, 酶切鉴定, DNA测序证实序列正确后, 利用脂质体将重组质粒转染DC, 经含G418培养基筛选获得抗G418细胞克隆, 用Western blot鉴定FMDV VP1基因在DC中的表达.结果:构建的pcDNA3.1-VP1真核表达载体经限制性内切酶酶切鉴定及序列分析证实了其序列的正确性, SDS-PAGE和Western blot结果显示G418筛选获得DC稳定表达VP1.结论:成功地构建了重组质粒pcDNA3.1- VP1真核表达载体, 并在DC中得到稳定表达.     

树突状细胞靶向性DNA疫苗的构建及其在CHO细胞的表达

目的 构建含OVA-Fc融合基因的真核表达质粒，证明其能在真核细胞CHO细胞表达。方法通过PCR从OVA-pcDNA3．1质粒中扩增出全长的小鼠OVA cDNA，酶切后克隆到含有小鼠IgG2a Fc cDNA的真核载体pMIgV，然后将OVA-Fc酶切后亚克隆入pcDNA3．1，构建真核表达载体OVA-Fc-pcDNA3．1；脂质体转染法将其导入CHO细胞，流式细胞仪、Western blot、ELISA法检测融合蛋白OVA-Fc的表达。结果酶切鉴定和序列测定证明真核表达载体OVA-Fc-pcDNA3．1构建正确；流式细胞术、Western blot、ELISA法均检测到转染的CHO细胞能表达OVA-Fc融合蛋白。结论OVA-Fc-pcDNA3．1真核表达质粒构建正确并能在真核细胞中表达，该质粒的成功构建与表达为进一步将其作为DNA疫苗治疗肿瘤、哮喘等疾病奠定了基础。     

CD40突变体融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的:构建CD40突变体(muCD40)融合蛋白的真核表达载体pIRES2-EGFP/muCD40Ig,并在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达,以获得muCD40Ig融合蛋白,为检测体内可溶性muCD40分子建立实验基础。方法:从L929/muCD40基因转染细胞中通过RT-PCR扩增出人muCD40胞外段基因序列,从人脾脏细胞中扩增出人IgG1恒定区基因,分别插入真核表达载体pIRES2-EGFP,采用Superfectin转染CHO细胞,G418筛选出能稳定分泌muCD40Ig蛋白的基因转染细胞并亚克隆。筛选出的阳性克隆经无血清培养后,收集上清进行Western blot检测;并收集细胞进行RT-PCR鉴定,同时用流式细胞仪分析muCD40Ig蛋白与CD40L的结合能力。结果:成功构建了人pIRES2-EGFP/muCD40Ig重组真核表达载体,PCR及Western blot结果显示该CHO基因转染细胞能够稳定分泌人muCD40Ig蛋白;流式检测muCD40Ig融合蛋白能够与CD40L分子结合。结论:获得了能稳定分泌人muCD40Ig的CHO基因转染细胞株,muCD40Ig融合蛋白具有与CD40L结合的能力。     

CD80-IgG1 Fc段融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的：构建人CD80-IgG1 Fc段融合蛋白的真核表达载体CD80-IgG1 Fc／pcDNA3．1（＋），并住CHO细胞中进行表达。方法：应用T—A克降技术和亚克降技术，构建人CD80膜外段-IgG1 Fc段融合蛋白的真核表达载体CD80-IgG1 Fc／pcDNA3．1（＋），并将其转染人CHO细胞株并筛选，进行稳定表达：通过Western blot及ELISA法，检测融合蛋白的表达。结果：成功地构建了真核表达载体CD80-IgG1 Fc／pcDNA3．1（＋），并建立CHO细胞稳定表达株。Western blot及ELISA法检测到细胞培养上清中有融合蛋白的表达。结论：成功地构建了人CD80膜外段-IgGI Fc段融合蛋白的真核表达载体CD80-IgGI Fc／pcDNA3．1（＋），并在CHO细胞中稳定表达，为下一步抗肿瘤的研究奠定了基础。     

CD80/IgG融合基因真核表达载体的构建及在CHO细胞中的表达

目的：构建CD80/IgG真核表达载体，使其在中国仓鼠卵巢细胞（CHO）中呈分泌型表达，为白血病免疫基因治疗的研究奠定基础。 方法： 采用多聚酶链反应（PCR）技术分别从小鼠脾细胞和含小鼠CD80全长互补DNA（cDNA） 的质粒pcDNA/B7中扩增出免疫球蛋白IgG1的Fc段和CD80胞外区，以定向克隆的方法将其串联至真核表达载体pcDNA3.0中，获得重组表达载体pcDNA/CD80-IgG；采用脂质体转染技术转染CHO细胞,G418筛选得到稳定表达细胞株；免疫印迹、斑点ELISA及流式细胞术鉴定融合蛋白的表达,并初步检测其活性。 结果： DNA测序证明两段基因正确克隆至pcDNA3.0的多克隆位点，CHO细胞的培养上清中可检测到融合蛋白的表达，其分子量大小和预期的基本一致，该融合蛋白可提高白血病细胞表面CD80的表达。 结论： 成功构建pcDNA／CD80-IgG真核表达载体，并在CHO细胞中分泌性表达有活性的CD80-IgG融合蛋白。     

人白细胞介素21在真核细胞中表达及其体外促T细胞增殖作用

目的：构建人细胞因子IL-21表达载体并在Hela细胞中稳定表达，分析rhIL-21体外促T细胞增殖作用。方法：以已构建的pMD-1121为模板，PCR扩增成熟IL-21 cDNA的编码框序列并构建到真核表达载体pCDNA3．1／hismye-B中。挑出阳性克隆进行扩增，脂质体转染入Hela细胞中并以G418加压筛选。有限稀释法、RT-PCR及Western blot筛选出稳定表达的细胞株。培养上清液经金属离子螯合层析分离纯化后，SDS-PAGE、Westem blot鉴定。MIT法测定其与抗CD3单克隆抗体共刺激T细胞增殖活性。结果：SDS-PAGE、Western blot显示Mr为18000的带有myc重组人IL-21融合蛋白(rhIL-21)；并成功地获得hIL-21稳定表达细胞株。rhIL-21融合蛋白具有与抗CD3抗体共刺激T细胞增殖作用。结论：获得具有生物学活性的rhIL-21细胞因子，为进一步研究其功能奠定基础。     

重组GPI-B7胞外段在中华仓鼠卵巢癌细胞膜上的表达

目的 通过从衰变加速因子(DAF)来源的GPI修饰性信号序列克隆到PCI-dhfr真核表达载体,利用GPI信号序列对B7-1基因胞外段序列进行修饰,实现GPI-B7-1锚定蛋白在中华仓鼠卵巢癌细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO)膜表面的表达。方法 应用RT-PCR方法从B淋巴细胞瘤细胞系(Raji细胞系)总RNA中钓取B7-1(CD80)全长基因,扩增B7-1胞外段分子并克隆到已含有GPI修饰性信号序列的真核表达载体pCI-dhfr上,应用脂质体方法转染到CHO-dhfr-细胞中,用氨甲喋呤(Methotrexate,MTX)进行筛选。重组蛋白的表达用细胞免疫荧光进行鉴定。结果 成功地克隆了B7-1全长基因,并扩增了胞外段基因构建到含有GPI修饰性信号序列的真核表达载体pCI-dhfr上,实现了GPI-B7-1锚定蛋白在CHO细胞膜的表达。结论GPI信号序列能够通过其脂质性尾部将GPI-B7-1锚定蛋白整合到细胞膜表面,本研究结果为将来应用GPI-B7-1分子于肿瘤细胞膜表面的修饰做了技术准备,可作为肿瘤免疫治疗的手段。     

甘露聚糖结合凝集素相关蛋白19(MAp19)在HeLa细胞的表达

目的构建甘露聚糖结合凝集素相关蛋白19(MAp19)真核表达载体并表达MAp19。方法应用PCR技术扩增得到MAp19基因,利用基因克隆技术构建真核表达载体pc DNA3.1/Myc-His A-MAp19,酶切及测序对其进行鉴定;将构建成功的重组载体通过脂质体转染He La细胞,并采用G418筛选已获得整合有pc DNA3.1/Myc-His A-MAp19的阳性细胞克隆,用荧光显微镜观察MAp19融合蛋白在He La细胞的定位;Western blot法检测MAp19融合蛋白的水平。结果构建了具有筛选特征和能够稳定表达的pc DNA3.1/Myc-His A-MAp19重组质粒,测序结果与NCBI数据库比对完全一致;采用G418筛选后获得表达外源性MAp19蛋白的He La细胞,该蛋白定位于细胞质中;Western blot结果确定MAp19为分泌性蛋白。结论 MAp19真核表达载体构建成功,并能在真核细胞中表达出目的蛋白。     

人TIM-3在真核细胞的表达及稳定转染细胞株的建立

目的：构建人TIM-3真核表达载体，在真核细胞中表达人TIM-3，建立稳定转染细胞株。方法：设计特异性引物，利用PCR技术扩增出TIM-3全编码区基因片段，插入到真核表达载体plRES2EGFP中，重组质粒pIRES2EGFP-hTIM-3用脂质体转染法转染哺乳动物细胞，以流式细胞术（FCM）和Western blot分析蛋白质的的表达，借助FCM和选择性培养基筛选建立稳定转染细胞株。结果：成功构建了pIRES2EGFP—hTIM-3真核表达载体，转染哺乳动物细胞COS-7和CHO后，FCM和Westernblot分析证实TIM-3高效表达于细胞膜表面，建立了稳定转染的CHO细胞株。结论：成功构建了人TIM-3真核表达载体，TIM-3高效表达在转染的哺乳动物细胞表面，并建立了稳定转染的细胞株。为进一步研究TIM-3及其配体的生物学功能以及制备和筛选抗人TIM-3 mAb提供了条件，     

重组人平足蛋白基因在中国仓鼠卵巢细胞的稳定表达

目的构建平足蛋白(PDPN)真核表达质粒PDPN-pEGFP-N1,建立稳定高表达重组人PDPN的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株并对其进行生物学活性研究。方法通过反转录PCR和DNA重组技术从HEK293细胞中克隆PDPN cDNA,插入带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的真核表达载体pEGFP-N1中。通过PCR、酶切及测序等方法鉴定重组载体;进而将该重组载体转染至CHO细胞中,通过荧光显微镜检测EGFP的表达,Western blot法检测PDPN在CHO细胞中的表达,流式细胞术分选高表达PDPN的CHO细胞,运用血小板聚集实验检测分选后细胞株的生物学活性。结果 DNA测序和酶切鉴定证明PDPN基因正确克隆至pEGFP-N1载体中,重组载体稳定转染CHO细胞后,在荧光显微镜下观察到绿色荧光,流式细胞术分选后的细胞高表达PDPN;Western blot结果显示转染后CHO细胞膜表面表达PDPN蛋白;过表达PDPN的CHO细胞可以诱导人血小板聚集。结论成功构建了稳定高表达PDPN蛋白的CHO细胞株,该细胞株可表达PDPN,并诱导血小板聚集。     

糖基化磷脂酰肌醇锚定型人B7-1融合蛋白在CHO/DHFR-细胞的稳定表达

目的建立稳定表达糖基化磷脂酰肌醇锚定型人B71(GPIB71)的CHO/DHFR-细胞表达体系。方法用Lipofectin介导法将真核细胞高效表达载体pCDNA3GPIB71和pSV40DHFR共转染CHO/DHFR-细胞,经免疫荧光流式细胞术检测,并提取膜蛋白进行Westenblot检测。结果经G418筛选和MTX加压扩增,获得高效表达目的蛋白的细胞株。膜蛋白经WesternBlot检测具有生物活性。结论GPIB71在CHO/DHFR-细胞中高效表达,为临床应用与研究奠定了基础。     

小鼠4-1BB-Fc分子的真核表达及其体外抑制T细胞增殖的效应

目的 克隆并构建含小鼠4-1BB胞外段和人IgG Fc融合基因的真核表达质粒，表达具有生物学活性的4-1BB-Fc融合蛋白，初步探讨其体外生物学效应。方法 借助RT-PCR技术，从小鼠脾脏总FLNA中扩增4-1BB全长编码基因，并导入克隆载体pGEM-T Easy。经测序证实，用PCR扩增其膜外区cDNA，酶切后与hIgG1 Fc基因一起装入真核表达载体pcDNA3．1中。应用脂质体将重组子pcDNA3．1-4-1BB-Fc转染COS-7及CHO细胞，经G418筛选，获得稳定表达4-1BB-Fc融合蛋白的CHO细胞株。双抗体夹心ELISA检测融合蛋白表达，经蛋白A亲和层析纯化，借助免疫印迹进行鉴定。应用FACS检测融合蛋白与DC细胞系DC2．4表面4-1BBL结合情况。采用MTT及CFSE（羧基荧光素乙酰乙酸）标记法检测4-1BB-Fc融合蛋白对同种异基因小鼠T细胞增殖的抑制作用。结果 经测序证实，所克隆和构建的小鼠4-1BB-Fc cDNA阅读框及连接部位序列正确；ELISA与免疫印迹证实4-1BB-Fc蛋白的表达及其对T细胞增殖具有明显抑制作用。结论 成功构建4-1BB-Fc融合基因并获稳定表达，可望用于探讨4-1BB参与移植排斥的作用及其机制。并为研究4-1BB-Fc的其他生物学作用奠定初步基础。     

人睾丸精子结合蛋白-His6融合蛋白在真核细胞中的表达及亲和纯化

目的:构建含有人睾丸精子结合蛋白基因(testisspermbindingprotein,tsbp)的真核表达载体pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp,并进行表达和纯化。方法:以克隆有tsbp全长cDNA序列的原核表达载体pGEX5X1/tsbp为模板,用PCR扩增tsbp,并通过DNA重组构建真核表达载体pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp。以重组体稳定转染HEK293细胞后,应用RTPCR、Westernblot和细胞免疫荧光技术检测His6tsbp融合蛋白的表达。选择高表达量的细胞克隆,扩增并用Ni2 NTA金属亲和层析柱(IMAC)从细胞裂解液中纯化融合蛋白His6tsbp,纯化产物的纯度用SDSPAGE和Westernblot进行鉴定。结果:成功地构建了真核表达载体pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp。以重组体转染HEK293细胞后,用RTPCR检测到tsbpmRNA的表达。细胞免疫荧光染色呈阳性反应,Westernblot检测到培养细胞中有融合蛋白His6tsbp的表达。经Ni2 NTA金属亲和层析柱分离纯化,得到纯化的重组蛋白His6tsbp。结论:构建了pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp真核表达载体,并在HEK293细胞中表达和亲和层析纯化,为下一步的研究奠定了基础。     

人CD40-Ig融合蛋白在CHO细胞中的表达与纯化研究

目的 建立稳定表达CD40－Ig融合蛋白的工程细胞株,获得大量融合蛋白以研究靶向阻断CD40：CD40L途径防治移植物抗宿主病（GVHD）策略的应用潜力。方法 自真核瞬时表达载体pIG／40Ig中切下CD40－Fc融合基因,插入pcDNA3．1载体中构建稳定表达载体。利用脂质体Lipo-fectamine将该载体转染CHO细胞,G418筛选抗性克隆;夹心ELISA法检测上清中CD40－Ig融合蛋白的表达;Westem blot法鉴定其免疫学活性。利用有限稀释法对筛选出的混合克隆单克隆化。滚瓶法无血清大批培养工程细胞,ProteinA亲和层析法纯化,SDS－PAGE后薄层扫描分析纯度。利用流式细胞术检测该蛋白与Jurkat细胞表面CD40L的结合功能。结果 CD40－Fc融合基因插入pcDNA3．1载体后构建成功稳定表达载体p3．1／40Ig,转染CHO细胞后经2次克隆化获得稳定表达CD40－Ig融合蛋白的基因工程细胞株,命名为p3．1／40Ig,转染CHO细胞后经2次克隆化获得稳定表达CD40－Ig融合蛋白的基因工程细胞株,命名为B2。ProteinA亲和层析纯化融合蛋白纯度达95％以上,该融合蛋白可特异结合Jukat细胞表面的CD40L。结论 CD40－Ig融合蛋白可模仿天然分子与其配基结合,为研究靶向CD40：CD40L途径的治疗制剂在防治GVHD中的潜在应用提供了有用的工具。     

CD80/IgG融合基因重组表达载体的构建及在CHO细胞中功能性表达的研究

目的 构建CD80/IgG真核表达载体,使其在中国地仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovurm,CHO）中功能性表达,寻找消除白血病细胞免疫逃逸的有效方法.方法 采用定向分子克隆技术将小鼠CD80胞外段和IgG1 Fc段的cDNA串联至真核表达载体pcDNA3.0中,运用脂质体将所得的重组子转染CHO细胞,经免疫印迹、斑点ELISA检测其表达,免疫亲和层析法纯化其表达产物,用流式细胞术、MTT比色法及ELISA在体外检测该产物的生物学活性.结果 两段目的基因按预期设想克隆入空载体中并得到了表达,亲和层析纯化获得了高纯度目的蛋白,该蛋白能够将白血病细胞表面CD80分子密度提高5倍,并可显著增强同种异体小鼠淋巴细胞的增殖、对白血病细胞的杀伤以及Ⅱ-2的分泌.结论 成功构建了融合基因真核表达载体,其表达产物在体外具有相应的生物学功能,有希望成为消除白血病细胞免疫逃逸的有力工具.     

LKB1基因转染对人肺腺癌细胞生物学行为的影响

目的:探讨外源性LKB1基因表达对人肺腺癌细胞生物学行为的影响。方法:应用巢式PCR方法扩增LKB1基因编码区,利用脂质体转染技术将真核表达重组体pcDNA-LKB1质粒和空载体pcDNA3.1质粒分别导入A549细胞,经G418筛选后获得稳定转染细胞克隆,Western blot检测LKB1和STAT3在A549细胞中的表达变化。通过绘制生长曲线和克隆形成试验检测获得性表达LKB1基因后肺癌细胞的增殖变化,流式细胞术(FCM)分析其细胞周期及其凋亡的变化。结果:成功获得了稳定表达外源性LKB1基因的A549细胞系,与转染空白载体组比较,转染LKB1基因的细胞生长速度明显减慢,细胞周期中G1/G0期比例明显增加,S期比例减少,细胞凋亡率升高;同时STAT3蛋白的磷酸化水平明显降低。结论:LKB1可能通过下调STAT3蛋白磷酸化水平的表达从而抑制A549细胞的恶性生物学行为。     

小鼠FasL基因真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的构建含有小鼠Fas Ligand(FasL)基因的重组真核表达载体,并检测FasL蛋白在其稳定转染的HEK293细胞中的表达情况,为构建表达小鼠Fas L的树突状细胞(DC)模型,深入研究DC联合T细胞防治移植物抗宿主病(GVHD)的新方法奠定基础。方法从小鼠脾脏中提取RNA并逆转录为cDNA,以该cDNA为模板扩增FasL基因,插入pcDNA3.1(+)载体中构建pcDNA3.1(+)-FasL重组质粒,利用脂质体将其转染HEK293细胞,用G418筛选稳定表达细胞系,Western blot确定重组蛋白的表达。结果通过酶切及测序证实FasL序列正确插入表达载体pcDNA3.1(+),Western blot检测证实转染重组质粒的细胞能正确表达FasL蛋白,G418筛选后能够得到稳定表达FasL的抗性细胞株即FasL-HEK293。结论重组质粒pcDNA3.1(+)-FasL和稳定表达FasL的HEK 293细胞成功构建,为后续FasL-DC细胞的研究打下了坚实基础。