构建人突变型p27基因重组腺病毒在结肠癌细胞SW480中的表达

背景大肠癌的发病率呈明显上升趋势.以往的治疗主要为手术治疗、化学治疗和放射治疗.目前基因疗法已应用于大肠癌治疗的临床实践中.目的构建复制缺陷型重组hp27mt基因腺病毒并检测其在SW480细胞中的表达,探讨腺病毒载体用于基因治疗的可行性及突变p27的抗肿瘤特性.设计非随机对照实验.单位郧阳医学院附属人民医院消化内科,郧阳医学院临床医学研究所,武汉大学中南医院消化内科.材料实验于2002-01/2003-09在郧阳医学院临床医学研究所完成.AgeⅠ,NheⅠ,KpnⅠ,PacⅠ和PmeⅠ等限制性内切酶;Tag酶,¨DNA连接酶;Western blot检测试剂盒;鼠抗人p27kip1多抗,辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG单抗;pORF9-hp27mt质粒,腺病毒骨架质粒pAdeasy-1,穿梭质粒pShuttle-CMV,LacZ重组腺病毒,脂质体,结肠癌细胞株SW480.方法①hp27mt自载体pORF9-hp27mt中切出,经2次亚克隆,插入到穿梭质粒pShuttle-CMV中,形成转移质粒pShuttle-CMV-hp27mt;然后再用PmeI线性化的pShuttle-CMV-hp27mt转化含腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的超感受态BJ5183,使其在细菌内发生同源重组.重组质粒鉴定正确后经PacI酶切,转入Ad293细胞,包装成重组腺病毒Ad-hp27mt.采用聚合酶链反应方法对重组腺病毒进行鉴定,用紫外分光光度计进行滴度测定.②用重组p27mt的腺病毒Ad-p27mt感染大肠癌细胞SW480,应用Western Blot检测p27蛋白的表达.主要观察指标①腺病毒在Ad293细胞中的包装过程.②Ad-p27mt的聚合酶链反应检测Ad-p27mt转染大肠癌细胞后的p27mt的表达.结果①用含pShuttle-CMV-hp27mt转化含pAdeasy-1的超感受态BJ5183后,可获得约30%的阳性重组质粒.②聚合酶链反应检测表明重组腺病毒DNA中含有目的基因.重组腺病毒滴度为7.95×1015pfu/L.③转染大肠癌细胞后,p27在SW480中获得了高表达,而未转染细胞和LacZ重组腺病毒转染的细胞中仅有低表达.结论复制缺陷重组腺病毒能有效介导突变p27基因在肿瘤细胞内表达,为观察突变p27基因对大肠癌的治疗作用提供了有效的基因转移载体.     

构建人突变型p27基因重组腺病毒在结肠癌细胞SW480中的表达

背景：大肠癌的发病率呈明显上升趋势。以往的治疗主要为手术治疗、化学治疗和放射治疗。目前基因疗法已应用于大肠癌治疗的临床实践中。目的：构建复制缺陷型重组hp27mt基因腺病毒并检测其在SW480细胞中的表达，探讨腺病毒载体用于基因治疗的可行性及突变p27的抗肿瘤特性。设计：非随机对照实验。单位：郧阳医学院附属人民医院消化内科，郧阳医学院临床医学研究所，武汉大学中南医院消化内科。材料：实验于2002-01／2003-09在郧阳医学院临床医学研究所完成。AgeⅠ，NheⅠ，KpnⅠ，PacⅠ和PmeⅠ等限制性内切酶；Tag酶，T4DNA连接酶；Western blot检测试剂盒；鼠抗人p27kip1多抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG单抗；pORF9-hp27mt质粒，腺病毒骨架质粒pAdeasy-1,穿梭质粒pShuttle-CMV，LacZ重组腺病毒，脂质体，结肠癌细胞株SW480。方法：①hp27mt自载体pORF9-hp27mt中切出，经2次亚克隆，插入到穿梭质粒pShuttle-CMV中，形成转移质粒pShuttle-CMV-hp27mt；然后再用PmeI线性化的pShuttle-CMV-hp27mt转化含腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的超感受态BJ5183，使其在细菌内发生同源重组。重组质粒鉴定正确后经PacI酶切，转入Ad293细胞，包装成重组腺病毒Ad-hp27mt。采用聚合酶链反应方法对重组腺病毒进行鉴定，用紫外分光光度计进行滴度测定。②用重组p27mt的腺病毒Ad-p27mt感染大肠癌细胞SW480，应用Western Blot检测p27蛋白的表达。主要观察指标：①腺病毒在Ad293细胞中的包装过程。②Ad-p27mt的聚合酶链反应检测Ad-p27mt转染大肠癌细胞后的p27mt的表达。结果：①用含pShuttle-CMV-hp27mt转化含pAdeasy-1的超感受态BJ5183后，可获得约30％的阳性重组质粒。②聚合酶链反应检测表明重组腺病毒DNA中含有目的基因。重组腺病毒滴度为7．95&;#215;10^15pfu／L。③转染大肠癌细胞后，p27在SW480中获得了高表达，而未转染细胞和LacZ重组腺病毒转染的细胞中仅有低表达。结论：复制缺陷重组腺病毒能有效介导突变p27基因在肿瘤细胞内表达，为观察突变p27基因对大肠癌的治疗作用提供了有效的基因转移载体。     

腺病毒介导p27基因转染对HeLa细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察p27基因对人宫颈癌细胞HeLa增殖及凋亡的影响.方法 将已构建成功的腺病毒载体Ad-p27转染至宫颈癌细胞系HeLa细胞,Western blotting法检测病毒转染后p27蛋白在不同时间点表达;噻唑兰(MTT)法检测其对肿瘤细胞增殖的影响;流式细胞术检测其对肿瘤细胞凋亡的影响.结果 HeLa细胞成功转染进Ad-p27;在各观察的时间点内,与对照组比较,同一时间点的细胞中p27蛋白水平均显著增加(P<0.01),细胞增殖能力显著降低(P<0.01),细胞凋亡率则显著增加(P<0.01).结论 p27基因抑制肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡,腺病毒构建p27基因有望成为宫颈癌治疗的一个新方法.     

三元复合因子Net对人胰腺癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用

目的:探讨三元复合因子Net对人胰腺癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用。方法:以聚合酶链反应(PCR)扩增Net基因全长片段,应用基因重组技术构建Ad5/F35-Net重组腺病毒载体。建立24只人胰腺癌裸鼠移植瘤模型,并随机分为PBS组、绿色荧光蛋白(GFP)组和Net组,3组分别注射0.1 mL的PBS、Ad5/F35-GFP(1×108PFU)和Ad5/F35-Net(1×108PFU),干预3周后,测定各组的移植瘤体积和质量,并应用免疫组化法检测各组移植瘤增殖细胞核抗原(PCNA)表达及移植瘤组织原位细胞凋亡情况。结果:本研究成功构建了表达Net的重组腺病毒载体。与PBS组及GFP组相比,Net组裸鼠移植瘤体积和质量明显减小(P均<0.05),而其PCNA表达显著降低(P<0.01),原位细胞凋亡明显增加(P<0.01)。结论:Net可明显抑制人胰腺癌裸鼠移植瘤的生长,抑制移植瘤细胞的增殖,促进移植瘤细胞原位凋亡。     

重组TRAIL抑制7402肝癌细胞生长的实验研究

目的　重组TRAIL对BALB/c裸鼠肝癌细胞皮下移植模型的抑瘤作用。方法　建立裸鼠 740 2肝癌细胞皮下移植瘤模型 ,纯化后的质粒DNA与PEI混合后经肌肉注射进行基因转染 ,体内验证重组蛋白的抑瘤活性 ,采用原位缺如末端标记 (TUNEL)法 ,进行肿瘤组织凋亡检测。结果　肿瘤体积测定显示TRAIL对肝癌生长有明显抑制作用 ,凋亡检测表明实验组镜下有蓝紫色凋亡细胞。结论　荷瘤小鼠经肌肉注射TRAIL质粒DNA后 ,能引起肿瘤细胞的凋亡 ,有效抑制 740 2肝癌细胞在裸鼠体内的生长。     

抑癌基因PTEN在大肠癌中的功能及机制

目的研究抑癌基因第十号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源基因(PTEN)在大肠癌中的功能及作用机制。方法收集结肠癌细胞HT-29转染各组质粒后细胞,调整各组细胞悬液浓度至5×10~4cells/ml,设立实验组和对照组共5组,即过表达空载体组(转染NC-oe)、过表达组(转染PTEN-oe)、干扰空载体组(转染NC-sh)、干扰表达组(转染PTEN-sh)、空白对照组(不作任何处理)。qPCR检测PTEN基因在结肠癌细胞系样本中的含量;MTT检测PTEN对结肠癌细胞增殖能力的影响;流式细胞术检测PTEN对结肠癌细胞周期和细胞凋亡的影响;PTEN重组子种植于裸鼠腋部背侧皮下成瘤部位,成瘤后定期测量裸鼠体重及瘤体大小。结果与空载体对照组和空白对照组比较,过表达组PTEN mRNA水平显著升高,干扰表达组PENT mRNA表达水平显著降低;过表达组细胞增殖速度减慢,干扰表达组细胞增殖速度加快;过表达组细胞周期S期细胞数量减少,干扰表达组细胞周期S期细胞数量明显增多;过表达组细胞凋亡率升高,干扰表达组细胞凋亡率降低;干扰组肿瘤生长迅速,提前使裸鼠致死,过表达组肿瘤生长缓慢。结论抑癌基因PTEN能够明显抑制大肠癌细胞增殖,抑制大肠癌细胞DNA合成,促进大肠癌细胞凋亡。增强PTEN基因可为临床瘤体内注射PTEN基因药物治疗提供新途径。     

重组腺病毒ADV-TK对肝癌抑制作用的实验研究

目的观察已构建的含胸苷激酶（TK）自杀基因的重组腺病毒（ADV-TK）对肝癌细胞的体外杀伤作用和对肝癌裸鼠移植瘤的治疗效果。方法将ADV-TK体外感染人肝癌细胞株SMMC-7721,噻唑蓝（MTT）法检测受感染的SMMC-7721细胞被不同浓度更昔洛韦（GCV）作用后的细胞存活率情况。构建肝癌SMMC-7721裸鼠移植瘤模型,观察肿瘤注射重组腺病毒ADV-TK结合GCV治疗移植瘤的变化。结果相同滴度的重组腺病毒与不同浓度的GCV作用于肝癌细胞株SMMC-7721后,MTT法检测到细胞的存活率随着GCV浓度的增加而不断降低。动物实验中ADV-TK治疗组肿瘤体积明显小于对照组（ADV-null及NS）（P〈0.01）。结论重组腺病毒ADV-TK对肝癌SMMC-7721细胞的体外增殖和裸鼠体内的移植瘤生长均有明显的抑制作用。     

利用siRNA沉默VEGF对膀胱癌生长的影响

目的研究VEGF特异性RNA干扰对膀胱癌细胞体内外增殖的影响。方法针对VEGF构建siRNA真核表达载体Psilencer^TM -VEGF-siRNA，并转染至膀胱癌细胞T24。RT-PCR观察VEGF的基因沉默效果；MTT比色分析检测细胞体外增殖能力；流式细胞计数检测细胞的凋亡。同时，通过裸鼠移植瘤模型观察VEGF基因沉默效果及对膀胱癌体内治疗的效果。结果转染siVEGF后膀胱癌细胞的VEG基因的表达显著被抑制（最高抑制率达79％）。与对照组比较，转染siVEGF组T24细胞的增殖活性明显低于转染阴性对照质粒组和空白对照组（P〈0．01）；流式细胞计数结果显示细胞发生凋亡。裸鼠体内致瘤实验显示，转染siVEGF组T24细胞在裸鼠体内增殖显著降低，肿瘤生长减慢。结论siVEGF能够有效的抑制膀胱癌中VEGF的表达，从而有效抑制膀胱癌细胞的生长。     

反义miR-21对荷人宫颈鳞癌裸鼠移植瘤生长和凋亡的影响

目的 构建荷人宫颈鳞癌裸鼠移植瘤模型,探讨干扰miR-21 表达对移植瘤生长、凋亡的影 响.方法 将人工合成的反义寡核苷酸ASODN(AS-miR-21)转染SiHa 细胞(抑制组),同时设阴性对照组和 空白对照组,对数生长期的SiHa 细胞分别接种于裸鼠皮下,绘制肿瘤生长曲线并计算肿瘤生长率.当肿瘤 体积达0.2 cm3 时采用AS-miR-21 多点瘤周注射,观察其对移植瘤的影响.应用免疫组化技术、荧光TUNEL 检测移植瘤细胞增殖活性和凋亡情况.结果 (1)成功构建人宫颈鳞癌裸鼠皮下移植瘤模型,抑制组、阴性 对照组及空白对照组成瘤率分别为37.5%、75.0%、100.0%,瘤体平均体积为(732.80 ±56.32 ) mm3 、(1228.46 ±78.53)mm3 、(1301.26 ±80.63)mm3,平均生长率为18.32%、30.71%和32.53%,瘤重为(0.73 ± 0.05)g、(1.26 ±0.12)g 和(1.35 ±0.25)g,抑制组与阴性、空白对照组比较差异均有统计学意义(P <0.05); (2)免疫组化显示抑制组裸鼠瘤体Ki67 表达显著下降;荧光TUNEL 凋亡检测显示抑制组裸鼠肿瘤细胞凋亡 率明显增多;(3)注射治疗剂量AS-miR-21 两周后观察肿瘤组织局部坏死严重,胞核裂解、消失,凋亡明显增 加.结论 AS-miR-21 可下调裸鼠人宫颈鳞癌移植瘤中miR-21 的表达,抑制移植瘤生长和促进其凋亡.     

携带TRAIL的溶瘤腺病毒治疗三阴性乳腺癌的研究

目的：构建携带肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand,TRAIL）基因的溶瘤腺病毒p55-hTERT-HRE-TRAIL,评估该病毒在体外和体内对三阴性乳腺癌的杀伤能力.方法：将质粒p55-hTERT-HRE与pPE3-TRAIL通过Lipofectamine 2000共转染至人胚肾293细胞,获得溶瘤腺病毒p55-hTERT-HRE-TRAIL;采用病毒体外增殖实验观察乳腺癌细胞株MDA-MB-231和人正常乳腺细胞株MCF-10A中的增殖情况;采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法比较不同感染复数（multiplicity of infection,MOI）的病毒对两种细胞的抑制效应;采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测病毒感染细胞后上清液中TRAIL的含量,采用蛋白质印迹（Western blotting）法检测细胞内TRAIL蛋白的表达.建立三阴性乳腺癌的原位成瘤模型及左心室注射模拟转移瘤裸鼠模型,应用“活体内光学成像系统”动态观察肿瘤的生长及转移情况.结果：p55-hTERT-HRE-TRAIL感染乳腺癌细胞株后表现出强大的增殖、复制能力,而在人正常乳腺细胞株内增殖并不明显;很低浓度的p55-hTERT-HRE TRAIL就对乳腺癌细胞产生明显的杀伤效应,而对正常乳腺细胞没有明显的杀伤作用;p55-hTERT-HRE-TRAIL感染乳腺癌细胞后,TRAIL蛋白的表达明显增多,而感染正常乳腺细胞后表达的TRAIL维持在较低的水平.乳腺癌原位成瘤模型中,空白对照组的光子数多于其他各组,肿瘤体积大于其他各组（P＜0.05）.左心室注射模拟转移瘤模型中,对照组活体内光学成像与TRAIL治疗组差异有统计学意义,TRAIL治疗组的生存天数延长（P＜0.05）.结论：成功构建高滴度的溶瘤腺病毒p55-hTERT-HRE-TRAIL,该病毒在乳腺癌细胞中具有特异性增殖并杀伤肿瘤细胞的能力.     

热疗联合组织因子靶向治疗对人大肠癌细胞增殖及凋亡的影响

目的 探讨热疗联合组织因子(TF)靶向治疗在体内和体外对人大肠癌细胞增殖及凋亡的影响.方法 用RNA干扰的方法 敲低大肠癌LOVO细胞系中TF的表达,MTT法、流式细胞术、Western blot方法 测定热疗联合TF敲低对LOVO细胞体外增殖抑制及细胞凋亡的影响.将人大肠癌细胞注射到裸鼠腹股沟皮下建立裸鼠皮下移植瘤模型,观察不同治疗方法 对肿瘤生长的影响.结果 用RNA干扰的方法 可以有效降低大肠癌LOVO细胞系中TF的表达.与单独热疗和单独TF敲低相比,联合治疗能够明显抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的发生(P<0.05).热疗联合TF敲低能够有效抑制裸鼠体内的肿瘤生长.结论 热疗和TF敲低联合应用能够抑制大肠癌细胞增殖并且诱导其凋亡,热疗联合TF靶向治疗是一个潜在的治疗大肠癌的新策略.     

抑制Smac基因表达对胰腺癌裸鼠移植瘤生长影响的研究

[目的]探讨Smac基因对人胰腺癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用.[方法]于裸鼠腋下接种200 μL 107/mL的PANC-1细胞悬液,建立人胰腺癌裸鼠移植瘤模型,将其分为三组：注射PBS液（A组）、转染空载体（B组）、转染Smac基因（C组）,比较三组移植瘤的大小、移植瘤细胞的凋亡率,移植瘤中Smac蛋白表达和微血管密度（MVD）.[结果]与A、B组比较,C组裸鼠移植瘤体积、质量和MVD显著减小;移植瘤细胞的凋亡指数和Smac蛋白的表达率均明显增高,其差异均有统计学意义（P〈0.05）.[结论]脂质体转染Smac基因能抑制人胰腺癌裸鼠移植瘤的生长,可能与该基因诱导胰腺癌细胞凋亡和抑制肿瘤血管形成有关.     

重组人p53腺病毒注射液联合泰索帝对人肺腺癌细胞生长的抑制作用

目的探讨基因治疗药物重组人p53腺病毒注射液(Ad-p53)联合化疗药物泰索帝(多西紫杉醇,Docetaxel)对人肺腺癌GLC-82(含突变型p53基因)及A549(含野生型p53基因)细胞的增殖抑制、凋亡诱导作用。方法将重组腺病毒载体所携带的野生型p53基因导入人肺腺癌细胞株GLC-82及A549,并联合应用化疗药物多西紫杉醇,通过Western blot法分析外源野生型p53基因在细胞内的表达,MTT法和流式细胞术观察对细胞生长抑制及细胞周期、凋亡的影响。结果通过West-ern blot证实了外源p53基因能在GLC-82及A549细胞中高效表达。MTT法观察到Ad-p53对肺癌细胞的抑制作用呈时间依赖性、剂量依赖性效应,100 MOI的Ad-p53与Docetaxel 5 mg/L联合应用后72 h,对A549细胞生长的抑制率达(51.96±0.76)%,单用的抑制率分别为(23.44±0.54)%、(40.53±1.37)%;对GLC-82细胞生长的抑制率达(62.42±1.43)%,单用的抑制率分别为(41.51±0.59)%、(48.39±0.88)%。流式细胞术检测结果显示,Ad-p53与Docetaxel联合应用能使细胞阻滞于G0~G1期,S期细胞比例明显减少,引起的A549细胞凋亡率为(23.35±0.64)%,单用的凋亡率分别为(15.35±1.31)%、(0.93±0.35)%;GLC-82细胞凋亡率为(47.73±1.17)%,单用的凋亡率分别为(20.88±0.71)%、(1.16±0.52)%。结论Ad-p53与化疗药物Docetaxel联用能显著协同抑制肺腺癌细胞的生长,增加化疗敏感性。     

介入导入Ad-p53基因联合超声辐照治疗兔VX2肝癌

目的 探讨介入导向下联合超声辐照对兔VX2肝癌模型Ad-p53转染效率及该基因对VEGF、MMP2的影响.方法 青紫蓝兔42只,直视下手术,将VX2肿瘤细胞种植于肝左叶,以超声检测肿瘤生长情况.根据第14天超声检测结果,将建模成功的30只动物随机分为3组,每组各10只,分别给予介入导向肝动脉灌注Ad-p53(Ad-p53组)及介入导向联合超声辐照Ad-p53给药(Ad-p53+US组)或等量生理盐水(对照组).治疗后第4天超声检测肿瘤大小,之后处死动物,以ELISA法检测血清中VEGF含量,免疫组化法检测瘤组织内p53、MMP2、VEGF的表达水平,蛋白质印迹法检测Ad-p53不同给药方法对野生型p53表达水平的影响.结果 治疗前3组动物瘤体直径差异无统计学意义,治疗后各组瘤体均有增加,但Ad-p53+US组瘤体相对较小.治疗后第4天,野生型p53水平在Ad-p53组明显高于对照组,而Ad-p53+US组p53的表达水平明显高于Ad-p53组.Ad-p53+ US组血清中VEGF含量显著降低.Ad-p53组和Ad-p53+ US组肿瘤组织中VEGF及MMP2表达均减低,但以Ad-p53+US组更为明显.结论 Ad-p53基因对肝癌生长具有抑制作用.Ad-p53经载瘤动脉介入给药联合超声辐照的治疗作用优于单纯Ad-p53灌注.     

下调组织蛋白酶B对人食管鳞癌EC9706细胞裸鼠移植瘤的抑制作用及其机制

目的:研究下调组织蛋白酶B(cathepsin B,CB)对人食管鳞癌EC9706细胞裸鼠移植瘤的抑制作用并探讨其体内抗肿瘤机制.方法:建立裸鼠荷瘤模型,利用CB siRNA和对照siRNA注射荷瘤裸鼠,监测肿瘤生长变化,采用RT-PCR及Western blot法检测治疗前后瘤体内CB及黏附分子Syndecan-1表达的变化.结果:成功构建了CB siRNA转染荷瘤裸鼠模型.与对照siRNA组和空白对照组相比,CB siRNA组荷瘤裸鼠肿瘤体积下降,组间比较差异具有统计学意义(F=483.992,P＜0.05).转染CB siRNA后,CB蛋白及mRNA表达均显著下调,组间比较差异具有统计学意义(F=733.255及932.681,均P＜0.01),Syndecan-1蛋白及mRNA表达则均显著升高,组间比较差异具有统计学意义(F=404.234及1 509.951,均P＜0.01).结论:CB siRNA可以有效抑制人食管鳞癌EC9706细胞裸鼠移植瘤的生长,并下调CB的表达和上调Syndecan-1的表达,本研究为食管鳞癌的分子治疗提供了一定的理论依据.     

RNAi沉默CDC25a基因对人肝癌细胞HepG2裸鼠移植瘤的影响

目的:研究细胞分裂周期素25a(cell division cycle 25a,CDC25a)基因RNAi(RNA干扰)的重组慢病毒载体对人肝癌细胞Hep G2 CDC25a基因表达和裸鼠移植瘤生长的影响。方法:实验组以CDC25a基因重组慢病毒颗粒感染Hep G2细胞;阴性对照组以RNAi-NC慢病毒颗粒感染Hep G2细胞;空白对照组常规培养。三组细胞分别接种至裸鼠皮下,建立人肝癌裸鼠移植瘤模型。连续28 d观察裸鼠成瘤情况及移植瘤生长情况,28 d后测定肿瘤体积和重量。用RT-PCR、Western blot及免疫组织化学法检测移植瘤中CDC25a的表达情况。结果 :各组裸鼠接种Hep G2细胞后第7天均有肿瘤形成,实验组的肿瘤生长速度、体积和重量明显低于空白对照组和阴性对照组(P<0.05)。实验组瘤体中CDC25a的m RNA及蛋白表达与阴性对照组及空白对照组相比明显下降(P<0.05)。结论:LV-CDC25a-RNAi重组体沉默Hep G2细胞的CDC25a基因后能有效抑制人肝癌裸鼠移植瘤的生长,提示CDC25a基因可被认为是肝癌治疗的关键靶点。     

沉默ATF5对卵巢癌裸鼠成瘤的影响

目的研究沉默人转录激活因子5（ATF5）后对卵巢癌SKOV-3细胞体外增殖、凋亡及体内成瘤的影响,探讨人类卵巢癌基因治疗的新途径。方法将慢病毒携带的小干扰RNA感染卵巢癌SKOV-3细胞（实验组）,空载体转染的卵巢癌SKOV-3细胞（空载体对照组）和卵巢癌SKOV-3细胞（空白对照组）进行对照,对比观察细胞的生长状态;MTT法检测细胞的增殖生长情况;罗氏凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡情况;分别于裸鼠皮下接种3组卵巢癌SKOV-3细胞,观察各组裸鼠的存活状态、种植瘤生长情况;RT-PCR检测瘤组织中ATF5mRNA的表达;Western-Blot方法检测瘤组织中ATF5蛋白的表达;苏木素-伊红染色（HE染色）观察瘤组织生物学形态变化。结果经转染ATF5基因的小干扰RNA后,在相同培养时间内3组细胞的增殖和生物学形态没有明显差异,但实验组细胞凋亡数量较其他两组明显增多。皮下接种成瘤后,3组裸鼠的成瘤率没有明显区别,实验组与空载体对照组和空白对照组相比,肿瘤成瘤时间晚,生长缓慢;移植瘤ATF5mRNA表达及蛋白表达降低;细胞分裂象明显减少,凋亡现象明显。结论沉默ATF5对人上皮性卵巢癌裸鼠移植瘤生长有抑制作用,这可能成为卵巢癌基因治疗的新靶点。     

介导hyrdC基因重组腺病毒对胃癌SGC-7901细胞生长影响的实验研究

目的观察介导hyrdC基因重组腺病毒对胃癌细胞生长的影响。方法将已构建的Ad-hyrdC重组腺病毒转染人胃癌SGC-7901细胞,并设置Ad-LacZ组以及空白对照组,免疫组化法检测hyrdC蛋白在胃癌SGC-7901细胞中的表达情况,采用绘制生长曲线法和MTT法观察和比较各组胃癌细胞的生长差异,将各组胃癌细胞接种裸鼠皮下构建裸鼠荷瘤模型以比较各组瘤体大小的差异。结果绘制生长曲线显示Ad-hyrdC组胃癌SGC-7901细胞生长显著增快,从48h后其细胞数与空白组以及Ad-LacZ组均有统计学差异(P<0.05),而Ad-LacZ组细胞与空白组无统计学差异(P>0.05);Ad-hyrdC组细胞MTT值显著高于Ad-LacZ组以及空白组(P<0.05),Ad-LacZ组与空白组无统计学差异(P>0.05);而Ad-hyrdC组胃癌瘤体与Ad-LacZ组及空白组胃癌荷瘤模型瘤体大小之间无统计学差异(P>0.05)。结论 hyrdC基因具有促进胃癌细胞生长的功能,hyrdC基因有可能成为胃癌基因治疗领域的新靶点。     

逆转录病毒介导Fcy::Fur融合基因联合5-FC治疗胶质瘤的体内试验研究

目的构建含融合自杀基因Fcy::Fur重组逆转录病毒,用自杀基因治疗系统Fcy::Fur/5-氟胞嘧啶(5-FC)对裸鼠胶质瘤进行体内抑瘤作用的实验研究。方法扩增Fcy::Fur基因并构建Fcy::Fur基因重组逆转录病毒载体;载体转染包装细胞获得高滴度病毒并转染鼠胶质瘤细胞C6,筛选并鉴定阳性转基因克隆;构建裸鼠荷胶质瘤动物模型,腹腔注射5-FC,观察裸鼠肿瘤重量变化及电镜、流式细胞仪(FCM)检测肿瘤的凋亡。结果PCR法扩增出全长Fcy::Fur基因,经测序证实序列正确;构建了PLXSN-Fcy::Fur逆转录病毒载体,载体转染包装细胞PT67,获得滴度为3.5×106CFU/mL的逆转录病毒;转染C6获转基因阳性克隆C6-Fcy::Fur,检测C6-Fcy::Fur有Fcy::Fur基因的mRNA表达;裸鼠前肢背部接种转基因细胞,成瘤后腹腔注射5-FC,转基因肿瘤的生长较对照组明显抑制。FCM法检测到凋亡峰,电镜观察到转基因肿瘤细胞有凋亡小体。结论AdE1CMVCD与5-FC联合在体内对胶质瘤有明显的抑制作用,为临床胶质瘤基因治疗提供了可靠的理论及应用依据。     

抑制MDC1基因蛋白表达对裸鼠食管癌细胞移植瘤大小及放疗敏感程度的影响

目的分析抑制MDC1基因蛋白表达对裸鼠食管癌细胞移植瘤大小及放疗敏感程度的影响。方法取54只SPF级BALB/C雄性裸鼠,构建食管癌动物模型。通过MDC1 mRNA序列,对有效的干扰序列与阴性对照序列进行设计并合成,且与载体p SIH1-H1-cop GFP生成重组质粒。裸鼠随机分为6组,分别为空白对照组(Eca109细胞未进行任何处理)、阴性转染组(转染阴性Eca109细胞)、单一照射组(Eca109细胞仅进行放射线照射)、阳性转染组(转染阳性ECA09细胞)、阴性转染+照射组(转染阴性Eca109细胞联合放射线照射)、阳性转染+照射组(转染阳性ECA09细胞联合放射线照射),每组各9只。采用蛋白印迹法与实时荧光定量PCR法对MDC1蛋白及mRNA表达量进行检测,取MDC1阳性转染Eca109细胞、阴性转染的Eca109细胞,分别将其接种于裸鼠。记录各组裸鼠移植瘤照射后1周、2周、3周、4周的体积变化情况,并用流式细胞仪对裸鼠移植瘤组织中细胞周期分布及细胞凋亡情况进行检测,且根据蛋白印迹法对各组裸鼠移植瘤组织中CHK2、CHK2-T68、CHK1表达情况进行检测,并将所得数据纳入统计学分析。结果p MDC1-shRNA质粒成功构建,且Eca109细胞得以转染,取得MDC1稳定转染的Eca109细胞。接种的裸鼠均成活,且于接种后7 d左右裸鼠爪下移植瘤形成。经15 Gy照射后,单一照射组、阴性转染+照射组裸鼠移植瘤生长速度较空白对照组明显减缓(P 0. 05),阳性转染+照射组裸鼠移植瘤生长速度较其它各组均明显减缓(P 0. 05),生长抑制率明显增高(P 0. 05)。照射前,各组裸鼠移植瘤体积的比较,并无显著差异(P 0. 05);照射后1周、2周、3周、4周,空白对照组裸鼠移植瘤增长较明显,阳性转染+照射组裸鼠移植瘤增长较缓慢,与单一照射组、阴性转染+照射组裸鼠移植瘤体积明显缩小(P 0. 05)。各组裸鼠移植瘤组织中细胞周期分布及细胞凋亡率的比较,并无显著差异(P 0. 05)。与对照组、单一照射组比较,阳性转染+照射组裸鼠移植瘤组织中CHK2-T68磷酸化水平显著下降(P 0. 05),而CHK2与CHK1蛋白表达水平较接近(P 0. 05)。结论 RNA干扰下调MDC1基因蛋白表达具有提高裸鼠食管癌细胞放疗敏感程度的作用,主要体现在阻滞放射线照射后裸鼠移植瘤的肿瘤体积增长方面。