海藻酸钠-氯化钡微囊对大鼠胰岛体外胰岛素分泌功能的影响

目的　观察海藻酸钠 -氯化钡微囊对大鼠胰岛体外胰岛素分泌功能有无影响。方法　以海藻酸钠和氯化钡为材料 ,采用气体吹喷制囊法将新鲜分离纯化的大鼠胰岛制成微囊化胰岛 ,取空微囊、微囊化大鼠胰岛与未微囊化大鼠胰岛各 5 0 0只 ,分为 10份 ,置于培养板中培养 ,用放免法测定并比较第 2、4、6 d培养液中基础胰岛素浓度。结果　空微囊组第 2、4、6 d的基础胰岛素平均浓度均为 0 nm ol/ 1/ 5 0 ,微囊化大鼠胰岛组第 2、4、6 d的基础胰岛素平均浓度为 5 .179、5 .80 6、5 .5 5 8nm ol/ 1/5 0只 ,未微囊化大鼠胰岛组第 2、4、6 d的基础胰岛素平均浓度为 5 .4 4 1、6 .0 80、5 .4 6 8nmol/ 1/ 5 0只 ,后两者差异无显著性意义 (P>0 .0 5 )。结论　海藻酸钠 -氯化钡微囊对大鼠胰岛体外胰岛素分泌功能无影响     

微囊化人胎胰岛移植治疗小鼠实验性糖尿病的观察

目的 :探讨微包囊技术在解决胰岛移植免疫排斥问题中的作用。方法 :将用链脲霉素 (STZ)制备的合格糖尿病模型鼠 2 1只随机分为 3组 ,每组 7只。空囊组腹腔内植入 5 0 0～ 6 0 0个空囊 ,游离胰岛组植入经胶原酶消化制备的人胎胰岛细胞 10 0 0± 10 0个 ,微囊组植入 10 0 0± 10 0个微囊包裹的胰岛细胞。结果 :游离胰岛组和微囊组小鼠在完全停用胰岛素的情况下 ,术后血糖分别降至 7.94± 2 .36mmol.L-1和 7.0 7± 1.15mmol.L-1,与空囊组比较差异有统计学意义 (t=13.170　P <0 .0 0 1,t=2 4 .999　P <0 .0 0 1) ,分别持续 7.4 3± 3.4 2天和 78.4± 2 1.2 7天 (t =8.6 5P <0 .0 0 1)。结论 :该微囊化人胎胰岛移植具有良好的组织相容性和免疫隔离作用 ,明显延长移植胰岛的存活时间     

胰岛的微包囊与体外培养研究

目的　研究以纯化海藻酸钠制成的大鼠微囊化胰岛在体外培养中的分泌功能和细胞活力。方法　 9～11d龄Lewis大鼠摘取胰腺后 ,剪碎组织至 0 .5～ 1.0mm3大小 ,胰岛分离后微包囊在海藻酸钠钡囊中 ,置培养液中培养 ,1周后行葡萄糖刺激胰岛素释放试验 ,同时行组织学检查 ,镜下观察细胞活力。结果　微囊化和非微囊化胰岛均具有良好的糖刺激反应性 ,2组刺激反应率分别为 (2 0 1.0 6±83 .3 9) %和 (2 2 6.3 8±89.83 ) % ,细胞活力分别为 (86.3 6± 8.3 1) %和 (91.72± 9.91) % ,差异均无显著性 (P >0 .0 5 )。结论　纯化海藻酸钠和一步法制囊技术对胰岛的体外分泌功能和细胞活力无损害作用。     

HOE 077对胰岛细胞微囊外纤维化反应及其活力的影响

目的　研究抗肝纤维化药物HOE 0 77对胰岛微囊外纤维化反应及细胞活力的影响。方法　猪胰岛分离后包裹在海藻酸钡微囊内 ,移植于Balb/c小鼠肝内。术后HOE 0 77通过溶解于饮用水中给药 ,对照组饮水中不含HOE 0 77。 1个月后处死动物 ,病理检查观察包囊外的纤维化反应程度 ,评价囊内细胞的存活情况。结果　对照组显示了明显的纤维化反应 ,纤维包裹层厚度平均为(6 2 .12± 3.84) μm ,细胞活力为 (15 .16± 2 .32 ) % ;而HOE 0 77治疗组纤维包裹厚度为 (4 1.44±2 .45 ) μm ,活力为 (2 3 .0 8± 2 .45 ) %。统计学分析表明 ,两组在囊外纤维包裹层的厚度及细胞活力上差异均有显著性 (P <0 .0 0 0 1和P <0 .0 1)。结论　抗肝纤维化药物HOE 0 77的应用为减轻微包囊的纤维化反应提供了一个新的途径     

微囊化新生猪胰岛细胞体外培养的研究

目的 探讨海藻酸钠－聚赖氨酸－海藻酸钠生物微胶囊（ＡＰＡ微胶囊）微囊化新生猪胰岛细胞作为异种移值供体来源的可能。方法 利用微囊技术包膜新生猪胰岛细胞本外培养，放免疫法检测培养液中胰岛素含量，比较微囊化及未微囊化新生猪胰岛素分泌能力和胰岛素刺激释放试验、组织学检查。结果 二者差异无显著意义，均具有良好的生物活性。结论 微囊包膜后胰岛细胞的生物活性和分泌功能良好，微囊包膜新生猪胰岛细胞可能是临床异种胰     

胰岛素样生长因子Ⅰ和Ⅱ对体外培养人胎胰岛细胞的增殖作用

本文研究了胰岛素样生长因子－Ⅰ与ＩＧＦ－Ⅱ对组织培养中的人胎胰岛细胞增殖与功能的作用。结果表明ＩＧＦ－Ⅰ与ＩＧＦ－Ⅰ均可明显促进人胎胰岛细胞ＤＮＡ合成与Ｂ细胞复并能促进人胎胰Ｂ细胞的胰岛素合成与分泌。     

人胎胰岛体外预处理和我国的临床胰岛移植

本文报道了多种体外预处理（３７℃培养、２４℃培养与冷冻保存）对人胎胰岛免疫原性的影响，并对我国８３５例Ⅰ型糖尿病胰岛移植临床资料进行了分析。结果显示胰岛的刺激指数较未预处理者显著减低（Ｐ＜０．０５－０．０１）ＨＬＡ－ＤＲ阳性细胞计数与淋巴样细胞计数均较未预处理者显著减少，提示各种预处理均使人胎胰岛免疫原性明显降低。     

微囊化新生猪胰岛细胞体外培养的研究

海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠生物微胶囊(简称APA微胶囊),具有生物半透膜性,葡萄糖与胰岛素能通过该膜,而抗体与淋巴细胞则不能,避免了机体对移植物的排异反应,使移植物体内生存时间延长。此项技术是目前最具前景的免疫隔离技术。本文利用胶元酶消化和体外培养的方法制备新生猪胰岛细胞,用微囊包膜技术,将胰岛细胞包裹,体外培养。放射免疫法测定培养液中胰岛素的含量,比较微囊化及未微囊化新生猪胰岛细胞胰岛素分泌能力和胰岛素刺激释放试验、组织学检查。证实二者差异不显著,均具有良好的生物活性。胰岛细胞团在微囊内分化发育良好,并不断分泌胰岛素,囊内外均未见纤维细胞生长。APA微囊及其制备技术对胰岛细胞活性和分泌功能无明显影响。微囊包膜后胰岛细胞的活性和分泌功能良好,微囊包膜新生猪将为临床异种移植提供良好的供体来源。     

微囊化胰岛移植的研究进展

免疫隔离膜微囊化胰岛移植，通过一个人造屏障将胰岛与宿主的免疫系统隔离开业，为解决排斥反应开辟了新的思路和途径。在糖尿病动物模型上获得了令人鼓舞的效果，本文就海藻酸钠微囊的制备、免疫屏障作用、移植数量和移植后纤维化进行了探讨。     

西罗莫司和FTY720对成人胰岛细胞毒性作用的体外研究

目的 探讨西罗莫司（SRL）和FTY720在体外培养试验中对成人胰岛细胞的毒性作用。方法 取成人尸体胰腺，用Liberase胶原酶消化，采用Ficoll密度梯度法纯化胰岛细胞。再将其分别与不同浓度的FTY 720（3、6、15μg／L）和SRL（3、6、15μg／L）共同培养，并设不用任何药物的对照组。各组用低糖和高糖刺激胰岛素分泌，以酶联免疫（ELISA）法检测各培养液中胰岛素的含量，并进行比较分析。结果 各组在高糖刺激下的胰岛素分泌量均大于低糖刺激下的胰岛素分泌量（P〈0．05）。在低糖和高糖刺激时，FTY720和SRL之间及同一免疫抑制剂不同浓度之间的胰岛素分泌量相比较，差异均无统计学意义（P〉0．05）；各组与对照组比较，差异亦无统计学意义（P〉0．05）。结论 FTY720和SRL对成人胰岛细胞无明显的毒性作用。FTY720和SRL可作为临床胰岛细胞移植后的主要免疫抑制剂。     

源于体外培养胰岛中表达Ngn3的细胞是胰腺内分泌前体细胞的新证据

目的 评估表达Ngn3的细胞对成体胰岛维护和更新的作用及其意义。方法 用6—8周龄的C57BL／6小鼠分离胰岛。胆总管内插管成功后,切除胰腺组织并用浓度为2．5mg／ml胶原蛋白酶V灌注消化。手工拣取胰岛后,置于60mm培养皿内,每个培养皿内含10—12个胰岛,用RPMI-1640(12．5mmol／L HEPES,5．2mmol／L葡萄糖和2％胎牛血清)培养液培养。用A6抗体,胰岛素抗体,胰高血糖素抗体,Nestin抗体,Ngn3抗体和5′—溴—2—脱氧尿嘧啶(5-bromo-2′-deoxy-uridine,Brdu)抗体进行胰岛细胞免疫荧光染色。结果 在增殖的胰岛细胞中,只有不到15％的细胞表达Ngn3,其中约有30％以上的细胞同时表达A6。在培养的胰岛细胞中存在表达Ngn3的细胞,这一结果与其他在胚胎发育和成体胰岛中的研究结果一致。本研究发现培养的胰岛细胞中存在同时表达A6和Ngn3的细胞。A6被认为是可分化为胆管上皮细胞的肝脏前体细胞的标记物。胰岛内表达A6的细胞可能来源于成体胰管,并迁移至胰岛内。细胞表达A6的同时表达Ngn3,表明这些细胞在胰岛内可分化为内分泌细胞。结论 培养的胰岛细胞中发现共同表达Ngn3和A6的细胞,表明胰岛内的4种内分泌细胞可能来源于成体胰岛中的同一内分泌细胞系。A6和Ngn3是对胰岛内成体干细胞研究很有帮助的标记物。这可以让我们进一步了解IPC的增殖和分化,并且有可能通过胰岛内成体干细胞来治疗糖尿病。     

成人胰岛大容量分离技术的改进及胰岛功能检测

目的 通过对人胰岛分离技术的改进以获得大量高活力胰岛并检测其功能,为利用同种异体胰岛移植治疗1型和部分2型糖尿病提供理论依据和技术基础。方法 采用改良的自动分离技术连续分离28例人胰岛,然后用连续性密度样度离心法纯化胰岛。胰岛收获量以国际标准的胰岛当量(islet equivalent,IEQ)表示。胰岛功能的测定分别为体外测定胰岛的胰岛素／DNA比率;静止葡萄糖刺激试验(SGS)及将胰岛移植至糖尿病裸小鼠的体内胰岛功能鉴定并随后进行腹腔糖耐量试验,连续测定移植鼠血糖水平及其体内C肽浓度。结果 28例成人胰腺分离的胰岛收获量为5000～1030000IEQ／胰腺,平均为291635IEQ／胰腺,前13例平均每个胰腺收获49123IEQ,平均每克组织收获846IEQ。平均纯度为87％,随着技术的改进后15例的分离结果则分别为：平均每个胰腺501813IEQ,平均每克组织7003IEQ,平均纯度89％。体外胰岛素刺激试验结果表明分离纯化后的人胰岛有正常功能,将12次分离得到的胰岛分别移植至34只糖尿病裸鼠肾包膜下,其中29只糖尿病裸鼠于12h内血糖恢复正常且糖耐量试验接近正常鼠,血中C肽水平亦接近正常鼠。结论 采用改进的人胰岛分离方法,可以获得大量高活力的具有正常功能的胰岛,为同种异体胰岛移植用于临床奠定了必要的实验基础。     

霉酚酸、雷帕霉素及FTY720在体外对成人胰岛功能的影响

目的探讨霉酚酸、雷帕霉素及FTY720对体外培养的成人胰岛功能的影响。方法将分离、纯化后获得的成人胰岛细胞分别与不同浓度的霉酚酸、雷帕霉素和FTY720混合培养24h,然后测定经各药物作用后的胰岛细胞在低糖(2.8mmol/L)和高糖(16.7mmol/L)刺激下胰岛素的释放量,并计算刺激指数。结果对照组(未添加药物)的胰岛细胞在低糖和高糖刺激下胰岛素的释放量分别为(7.37±1.74)ng/ml和(15.15±5.39)ng/ml,刺激指数为2.06±0.46。与对照组相比,添加霉酚酸的胰岛细胞在低糖和高糖刺激下胰岛素的释放量均明显下降(P<0.01),刺激指数亦明显下降(P<0.05);添加雷帕霉素组,低糖和高糖刺激时胰岛素的释放量均有下降(P<0.05),但刺激指数仅在雷帕霉素浓度为1.0ng/ml时明显下降(P<0.05);添加FTY720组,低糖刺激时胰岛素的释放量明显低于对照组(P<0.05),高糖刺激时,胰岛素释放量仅在FTY720高浓度组有明显下降(P<0.05),刺激指数也有明显下降。结论相对来说,在体外雷帕霉素和FTY720对成人胰岛细胞的毒性作用较小;胰岛移植后,选择免疫抑制方案应遵循低剂量原则。     

转染人VEGF165基因对大鼠胰岛移植物再血管化及生物学功能的影响

目的探讨转染人血管内皮生长因子（VEGF）基因对大鼠胰岛移植物再血管化和生物学功能的影响。方法实验分二步进行，首先构建携带人血管内皮生长因子165（hVEGF165）基因的重组腺病毒载体AdhVEGF165，用其按病毒／细胞的感染倍数（MOI）分别为10、100、500的比例在体外转染新鲜分离、纯化的近交系Lewis大鼠胰岛，检测体外培养的胰岛表达hVEGF165基因的情况；然后按MOI为10的比例在体外用AdhVEGF165转染Lweis大鼠胰岛，再经门静脉注射至近交系Lewis大鼠的肝脏内（VEGF组），并设不含hVEGF165基因的空载体转染对照组（GFP组）和磷酸盐缓冲液处理对照组（PBS液组），术后测定受鼠的血糖变化，进行静脉糖耐量试验（IVGTT），并观察受鼠肝脏中移植胰岛的组织学变化。结果体外转染hVEGF165基因的大鼠胰岛分泌至细胞外的hVEGF165的浓度显著高于未转染者（P〈0．01）。糖尿病大鼠移植转染hVEGF165基因的胰岛后，静脉注射葡萄糖后40、60、120min时的血糖水平显著低于GFP组和PBS液组（P〈0．05）；40min时体循环中胰岛素的浓度，VEGF组显著高于GFP组和PBS液组（P〈0．05）；VEGF组移植胰岛内CD34和胰岛素免疫组化染色的强度均高于GFP组和PBS液组。结论转染hVEGF165基因对胰岛移植物的再血管化和生物学功能有促进作用。     

血红素加氧酶-1诱导性高表达保护异种移植胰岛功能的研究

目的 探讨通过钴原卟啉(cobalt protoporphyrin,CoPP)诱导供体胰岛血红素氧化酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)高表达对异种胰岛移植物的保护作用.方法 采用大鼠对小鼠胰岛移植模型,分为对照组、体内诱导组、体外诱导组、体内阻断组及体外阻断组5组,改良Gotoh法提取胰岛,移植于糖尿病模型小鼠的肾包膜下.比较各组受体移植后血糖维持正常时间,糖刺激试验检测胰岛功能,PCR和ELISA法分别检测移植物内和血清IL-10、TNF-α、IL-1β及INF-γ及其mRNA表达.分别以PCR和Western印迹法检测胰岛组织内HO-1mRNA及蛋白表达.病理学检查移植物淋巴细胞浸润情况.结果 对照组小鼠血糖维持正常时间为(9.33±1.37)d,与体内诱导组的(16.33±1.51)d及体外诱导组的(14.33±1.51)d相比差异有统计学意义(P<0.05),体内诱导组优于体外诱导组(P<0.05).受体阻断的两组血糖控制时间则与对照组相近,分别为:体内阻断组(9.67±1.03)d,体外阻断组(9.17±1.47)d.体内、外诱导组及对照组胰岛于低糖刺激下胰岛素分泌量差异无统计学意义(P>0.05),而高糖刺激下,体内诱导、体外诱导及对照组分别为:(187.68±19.93)、(137.22±11.73)及(91.25±12.64)μIU·ml~(-1)·10islets~(-1)·45 min~(-1),差异有统计学意义(P<0.05).移植后,接受经诱导处理的胰岛的两组小鼠血清IL-10含量[体内诱导(72.97±9.74)pg/ml、体外诱导(70.84±3.56)pg/ml]明显高于未处理组[(30.57±3.93)pg/ml]及阻断两组[体内阻断:(39.78±3.00)pg/ml、体外阻断:(35.42±4.30)pg/ml].两诱导组胰岛移植物的IL-10 mRNA表达强于对照及阻断两组.IFN-γ、TNF-α及IL-1β在各组间差异无统计学意义.体内、体外诱导两组HO-1mRNA、蛋白表达高于对照组,其中体内诱导组HO-1mRNA高于体外组,但两组HO-1蛋白表达相当.体内、外阻断组HO-1mRNA、蛋白表达与对照组相当.病理学检查示两诱导组移植物内淋巴细胞浸润少于对照及阻断两组. 结论 CoPP体内、外诱导He-1高表达可促进胰岛功能,延长移植物生存时间,体内诱导对异种移植胰岛保护效应强于体外诱导.     

经腹腔镜微囊化猪胰岛异种移植术

目的：探讨腹腔镜技术应用于海藻酸钠－聚赖氨酸－海藻酸钠（APA）微囊包裹猪胰岛小网膜腔内异种移植术的可行性。方法：采用腹腔镜技术对5例6人次I型糖尿病患者进行了APA微囊新生猪胰岛小网膜腔内异种移植治疗，观察患者移植前后空腹血糖、C肽和胰岛素用量变化。结果：全部病例均未出现手术并发症。术后受体C肽较术前升高3－23倍，胰岛素用量减少，基中1例完全停用胰岛素，成为胰岛素不依赖者达31个月。结论：腹腔镜技术用于临床微囊化新生猪胰岛小网膜腔移植术治疗I型糖尿病安全可行。     

微囊化大鼠胰岛异种移植的实验研究

目的　通过动物实验明确微囊化胰岛是否具有免疫隔离作用。方法　SD大鼠胰腺原位消化 ,Ficoll间断密度梯度离心法纯化、分离胰岛 ,气流吹喷制作海藻酸钠 /聚赖氨酸 /海藻酸钠(APA)微囊化大鼠胰岛 ,比较微囊化与未微囊化胰岛的胰岛素释放试验 ;将微囊化 (实验组 )与未微囊化 (对照组 )大鼠胰岛植入链脲佐菌素 (STZ)诱导的I型糖尿病小鼠中 ,作两组间血糖正常持续时间比较。结果　实验组与对照组的胰岛素释放试验差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ;实验组血糖正常持续时间为 2 3～ 6 5d(平均 48d) ,对照组为 3～ 6d(平均 5d) ,两组差异有极显著性 (P <0 .0 1)。已排斥的实验组小鼠腹腔灌洗发现部分微囊化胰岛存活 ,部分已坏死 ,但微囊膜皆完整 ,囊壁无纤维化。结论　微囊具有良好的免疫隔离作用 ,可使胰岛移植物存活时间明显延长。同时推测微囊内移植物死亡与细胞因子、自由基作用或营养不足等有关。     

成人胰腺干细胞转分化为胰岛的研究

目的：通过对成人胰腺干细胞转分化为胰岛过程的研究以便更深入了解及改进胰腺干细胞分离、培养、鉴定方法。方法：成人胰腺组织经胶原酶消化后,用密度梯度离心法将胰腺外分泌细胞、导管上皮细胞和胰岛分离、纯化,导管上皮细胞即具有转分化潜能的干细胞,在体外先后以CMRL1066和无血清DMEM／F12培养液共培养27d,在培养的不同时间点取样本于光镜和电镜下观察细胞形态学变化及干细胞特异性转录基因PDX－1,CK－19蛋白等单抗的免疫组化染色,并测定培养液中的淀粉酶和胰岛素含量。结果：上述方法可获得大量以往在胰岛分离时丢弃的胰腺导管上皮细胞。经体外一定条件的培养后,第1天即可见PDX－1,CK－19阳性细胞,胰腺导管上皮细胞迅速分裂增殖并转变为有分化能力的干细胞继而转分化为三维结构的胰岛细胞。培养27d后,平均每克胰腺组织可生成760个胰岛。结论：成人胰腺的导管上皮具有干细胞潜能并可在体外转分化为大量具有内分泌功能的胰岛,用此方法获得大量的胰岛可能为克服胰岛移植的供体短缺提供一条新的途径。