miR-181a-5p通过HOXB4抑制骨肉瘤细胞HOS增殖和迁移

目的：研究miR-181a-5p对HOS骨肉瘤细胞增殖、周期和迁移的影响及其机制。方法 ：采用实时定量PCR检测hFOB1.19成骨细胞和HOS、U2OS、MG63骨肉瘤细胞系中miR-181a-5p及HOXB4的表达情况。利用Lipofectamine 2000将miR-181a-5p mimics和miR-181a-5p inhibitor分别转染至人骨肉瘤HOS细胞中（分别为过表达组和抑制剂组）,并设置miR阴性对照组;CCK-8法检测各组细胞的增殖能力变化,流式细胞术检测各组细胞的细胞周期变化,划痕愈合实验以及Transwell迁移实验检测各组细胞的迁移能力变化。Targetscan网站预测miR-181a-5p的靶向基因,并通过双荧光素酶报告基因系统及Western blot验证靶向关系。结果：与成骨细胞hFOB1.19相比,miR-181a-5p在骨肉瘤细胞HOS、U2OS和MG63中低表达（P<0.05）,而HOXB4在骨肉瘤中高表达（P<0.05）。与阴性对照组相比,过表达miR-181a-5p抑制骨肉瘤HOS细胞的增殖和迁移能力,并且处于细胞周期S期的细胞...     

Bim蛋白在骨肉瘤细胞株中的表达及其意义

目的 检测Bim蛋白在3种骨肉瘤细胞中和1种正常成骨细胞中的表达.方法 提取成骨肉瘤细胞Saos-2和成骨细胞hFOB 1.19中总RNA,通过全基因组表达谱芯片比较Bim基因在Saos-2和hFOB 1.19中表达;对骨肉瘤细胞MG-63、U2-OS、Saos-2及成骨细胞hFOB 1.19细胞进行细胞爬片免疫荧光、提取4种细胞中的总蛋白进行Western blot、提取4种细胞中的总RNA进行荧光定量聚合酶链反应(PCR),检测4种细胞内Bim的表达,观察骨肉瘤细胞与成骨细胞中Bim的差异,并通过查阅文献分析全基因组表达谱芯片中筛查出与Bim蛋白表达有关的基因.结果 全基因组表达谱芯片结果为Saos-2/hFOB 1.19=0.32,Saos-2中Bim基因表达比hFOB 1.19下调2倍以上;免疫荧光显示Bim在3种骨肉瘤细胞中的表达显著低于hFOB 1.19;Western blot条带结果表明Bim蛋白在hFOB1.19里面表达最多,定量分析条带灰度显示MG-63、U2-os、Saos-2及hFOB1.19细胞里面的表达值为0.04±0.02、0.15±0.01、0.12±0.02、0.39±0.02,3种骨肉瘤细胞Bim蛋白水平明显低于成骨细胞(P＜0.05);荧光定量PCR检测得出骨肉瘤细胞MG-63、U2-os、Saos-2及hFOB1.19里Bim mRNA的2-△△CT为:1.00±0.03、1.96±0.21、1.20±0.14、0.64±0.07,3种骨肉瘤细胞Bim mRNA明显低于成骨细胞,差异有统计学意义(P＜0.05);通过文献报道+基因芯片筛查出了10种可能跟Bim蛋白表达及生物学作用相关联的基因.结论 Bim在mRNA和蛋白水平下,骨肉瘤细胞中表达量明显少于成骨细胞.

Abstract：

Objective To examine the expression of Bim protein in three osteosarcoma cell lines and the osteoblasts. Methods Comparison of whole genome expression profiling chip in osteosarcoma cell Saos-2 expression and osteoblast hFOB 1. 19 expression; and then the Bim expression were detected and authenticated by immunofluorescence, Western blotting, quantitative polymerase chain reaction (PCR) on the MG-63, U2-OS, Saos-2 osteosarcoma cells and hFOB 1. 19 osteoblast to investigate the differences, and through literature review of whole-genome microarray screening for Bim expression of related genes. Results The gene expression microarray results of Saos-2/hFOB 1. 19 =0. 32,the Bim gene expression in Saos-2 is lower down than hFOB 1. 19 around 2 times; fluorescence signal of Bim in 3 osteosarcoma cells was significantly lower than hFOB 1. 19; Western blotting results show that Bim expression in hFOBl. 19 which is the most,quantitative analysis of band intensity showed MG-63, U2-os, Saos-2 and hFOBl. 19 expression is 0.04 ± 0. 02,0. 15 ± 0. 01,0. 12 ± 0. 02,0. 39 ± 0.02, Bim protein levels in osteosarcoma cells was significantly lower than osteoblast (P＜0. 05) ;fluorescence quantitative PCR detection of MG-63 ,U2-os,Saos-2 and hFOBl. 19 in Bim mRNA expression of 2-△△CT was:1. 00 ±0. 03,1. 96 ±0. 21,1. 20 ±0. 14,0. 64 ±0. 07, osteosarcoma cells Bim mRNA expression were significantly lower than that of osteoblast, the difference was significance (P＜0. 05) ;reviewed and gene chip screening came out of the 10 possible with Bim protein expression and biological function associated genes. Conclusion Bim mRNA and protein level expression in osteosarcoma cells were significantly lower than the osteoblast.     

铁调素干预成骨细胞(hFOB1.19)后细胞膜转铁蛋白1、铁离子、矿化及成骨基因变化研究

目的 探讨铁调素对成骨细胞铁代谢指标、骨代谢指标的影响和相互关系。方法 成骨细胞 （hFOB1.19）培养3d后,使用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测成骨细胞（hFOB1.19）的膜转铁蛋白1 （ferroportin1,Fpn1）的表达;再用不同浓度的铁调素（25noml/L,50noml/L,100noml/L）干预培养 环境,对照组加相同体积双蒸水,干预20h,MTT法检测细胞增殖情况;激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）检 测成骨细胞内铁离子荧光染色后荧光强度变化情况;Von Kossa染色检测成骨细胞矿化情况;RT-PCR检测 骨钙素（BGP）、I型胶原（COL1）、骨保护素（OPG）基因表达。结果 1、成骨细胞存在Fpn1表达;2、铁 调素对成骨细胞增殖无显著影响（P>0.05）;3、铁调素干预后,成骨细胞内铁离子含量增多,且与铁调 素干预存剂量依赖性关系（P<0.05）;4、铁调素干预后,成骨细胞矿化功能增强,且与铁调素干预存剂 量依赖性关系（P<0.05）;5、RT-PCR检测显示不同浓度铁调素干预后,各组COL1、OPG、BGP mRNA均有表 达;不同浓度组的COL1、OPG、BGP mRNA表达光密度比值不同,组间密度比值比较存在统计学意义 （P<0.05）,但铁调素在400nmol/L时抑制OPG的表达（P<0.05）。结论 成骨细胞存在铁调素作用的膜转 铁蛋白-1,所以铁调素干预成骨细胞培养环境后细胞内铁离子发生特异性变化,同时细胞矿化指标显著增 加、细胞COL1、OPG、BGP mRNA表达含量增加;研究提示：铁调素可能通过膜转铁蛋白影响成骨细胞铁离 子变化,细胞铁代谢变化可能引起细胞成骨指标上调改变。     

地塞米松在人骨髓基质细胞诱导成骨细胞中的作用

目的 通过对人骨髓基质细胞体外培养及检测，研究地塞米松在骨髓基质细胞体外增生并向成骨细胞定向分化过程中的应用。方 法骨折内固定术扩髓前收集髓腔内骨髓进行原代和传代培养，传代后改用条件培养基（含地塞米松）和基础培养基（不含地塞米松）分别进行培养，应用组织化学及von Kossa方法检测细胞碱性磷酸酶和细胞外基质矿化程度；半定量RT-PCR方法检测Cbfal mRNA和Osterix mRNA在细胞培养过程中不同时间点的表达。并观测地塞米松对上述成骨细胞相关基因表达的影响。结果 条件培养基组细胞Cbfal mRNA和Osterix mRNA的表达峰值高于基础培养基组细胞，并且峰值出现的时间提前。结论 地塞米松通过促进Cbfal mRNA和Osterix mRNA的表达而促进骨髓基质细胞向成骨细胞分化。     

过表达FOXO1对骨肉瘤细胞侵袭迁移能力的影响及机制研究

［摘要］ 目的 探讨FOXO1对骨肉瘤细胞侵袭迁移能力的影响及机制。方法 采用实时荧光定量PCR（qRT?PCR）的方法检测人正常成骨细胞hFOB 1.19和人骨肉瘤细胞U2OS、MNNG/HOS中FOXO1的mRNA表达水平。利用pcDNA3.1?FOXO1重组质粒建立FOXO1过表达的细胞模型,空载质粒（pcDNA3.1?vector）作为对照,qRT?PCR和蛋白质印迹法（Western blot）验证转染效率。确定成功过表达FOXO1基因后利用Cell Counting Kit?8（CCK?8）实验检测骨肉瘤细胞的增殖能力（吸光度值）,Transwell实验体外检测骨肉瘤细胞的侵袭和迁移能力,并采用qRT?PCR和western blot的方法检测基质金属蛋白酶9（MMP9）的表达变化。结果 人骨肉瘤细胞MNNG/HOS、U2OS中FOXO1的mRNA的表达水平显著低于人成骨细胞hFOB 1.19（P<0.05）,且骨肉瘤细胞U2OS的FOXO1的表达水平较低。重组质粒pcDNA3.1?FOXO1转染后,骨肉瘤细胞U2OS的FOXO1表达水平显著升高。与对照组（pcDNA3.1?vector）比较,U2OS?FOXO1过表达组的细胞的增殖能力降低（P<0.05）,侵袭迁移和迁移能力降低,MMP9较对照组表达水平明显降低（P<0.05）。结论 骨肉瘤细胞中FOXO1表达水平明显低于正常成骨细胞。过表达FOXO1可能通过下调MMP9抑制骨肉瘤细胞的侵袭和迁移能力。     

铁调素对成骨细胞内铁离子转运的影响

目的研究不同时间和不同浓度铁调素（Hepcidin）对人成骨细胞（hFOB 1.19）内铁离子影响。方法使用Hepcidin干预hFOB 1.19细胞后,采用激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）观察成骨细胞内的铁离子荧光强度。结果CLSM扫描细胞内不同时间组铁离子荧光强度显示：①瞬时组内,实验组与对照组荧光强度均出现缓慢下降,二者之间变化趋势无明显的差异。②长时间组内,在0-100 nmol/L范围内,细胞内铁离子荧光强度随着Hepcidin浓度增加而逐渐增强,当Hepcidin的浓度超过100 nmol/L时,细胞内的铁离子荧光强度不再随着Hepcidin浓度的增加而继续增强。结论①Hepcidin对hFOB1.19内铁离子瞬时转运的作用没有明显的影响。②Hepcidn干预hFOB 1.19细胞20 h后有升高细胞内的铁离子含量的作用,并且在0-100 nmol/L范围内具有剂量依赖性。     

miR-342-5p 调控靶基因Merlin 表达促进肝细胞癌侵袭转移的实验研究

目的：探讨miR-342-5p及其可疑靶基因Merlin在肝细胞癌（HCC）中表达及意义。 方法：用qRT-PCR检测miR-342-5p和Merlin mRNA在HCC组织与癌旁组织，以及正常肝细胞系与各种不同HCC细胞系中的表达；用重组慢病毒包装质粒pGCSIL-GFP-miR-342-5p或空载体（阴性对照）转染HCCLM3细胞，以无处理的HCCLM3细胞作为空白对照，划痕愈合及Transwell实验观察细胞侵袭运动能力；Western blot法检测细胞中Merlin蛋白的表达。采用双荧光素酶基因报告系统，将含野生型或突变型Merlin基因3''UTR质粒（psiCHECK-Merlin）分别与pGCSIL-GFP-miR-342-5p、空载体（阴性对照）共转染或单独转染（空白对照）HCCLM3细胞后，检测各组细胞荧光素酶活性。 结果：与癌旁组织比较，HCC组织中miR-342-5p表达明显上调，Merlin mRNA表达明显下调（均P<0.05）；HCC组织中，血管侵犯组较无血管侵犯组miR-342-5p表达明显上调，Merlin mRNA表达明显下调（均P<0.05），且miR-342-5p与Merlin mRNA表达呈负相关（r2=5.364，P<0.05）。各HCC细胞系中miR-342-5p表达均明显高于正常肝细胞系，且miR-342-5p的表达随HCC细胞系的侵袭性增高而上调，而Merlin mRNA表达则呈相反趋势（均P<0.05）。与空白对照组及阴性对照组比较，HCCLM3细胞转染pGCSIL-GFP-miR-342-5p质粒后，细胞侵袭运动能力明显下降（均P<0.05），而Merlin蛋白表达明显上调。psiCHECK-Merlin野生型与pGCSIL-GFP-miR-342-5p质粒共转染HCCLM3细胞后，细胞的荧光素酶活性较其阴性对照组或空白对照组明显降低（P<0.05），而psiCHECK-Merlin突变型与pGCSIL-GFP-miR-342-5p质粒共转染HCCLM3细胞后，细胞的荧光素酶活性与其空白对照组或阴性对照组无统计学差异（P>0.05）。 结论：Merlin是miR-342-5p的靶基因，miR-342-5p可能通过调控MerlinmRNA的表达促进肝细胞癌侵袭转移。     

人胸腺素β4 RNA干扰载体的构建及其对293T细胞目的基因表达的影响

目的探讨人胸腺素β4（thymosin β4,TMSB4）基因RNA干扰慢病毒载体的构建,观察病毒感染293T细胞后TMSB4 mRNA和蛋白表达,为进一步研究TMSB4基因的功能提供基础。方法设计特异性干扰人TMSB4基因的小发卡RNA序列,合成含有干扰序列的双链DNAoligo,与经AgeI和EcoRI双酶切后的pGCSIL-GFP载体连接产生慢病毒载体。转化感受态大肠杆菌DH5a并对阳性克隆进行PCR扩增测序鉴定。慢病毒载体、包装系统质粒共转染包装细胞293T细胞,产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度。将获得的慢病毒感染293T细胞,分别采用实时定量PCR和免疫细胞化学染色方法观察TMSB4 mRNA和蛋白的表达情况,利用生成的TMSB4 shRNA慢病毒感染原代成纤维细胞。结果感染重组慢病毒的293T细胞与空病毒转染阴性对照细胞的TMSB4 mRNA表达分别为0.56±0.11和1.00±0.06（P=0.0006）,实验组细胞的敲减率为44%。实验组TMSB4蛋白表达水平0.042±0.007比阴性对照组细胞0.093±0.009的表达降低55%（H=461.342,P〈0.001）。感染重组慢病毒的原代培养的成纤维细胞与空病毒转染的对照细胞相比,TMSB4蛋白表达水平亦明显降低。结论TMSB4基因干扰慢病毒构建成功并能显著降低TMSB4基因和蛋白在293T细胞中的表达,成功感染原代成纤维细胞使其目的基因蛋白减少,为进一步研究TMSB4基因的功能奠定研究基础。     

活性氧在铁过载影响成骨细胞生物活性中的作用

目的 观察铁过载对人成骨细胞（hFOB1.19）生物活性的影响,同时观察活性氧在这一实验变化过程中的作用。 方法 体外培养成骨细胞,一组运用200μmol/L枸橼酸铁铵（FAC）干预,一组运用2.5mmol/L抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）干预,一组NAC预处理1h后运用相同浓度FAC干预,一组为正常对照;细胞培养48h后,流式细胞仪检测各组细胞内活性氧(ROS)的水平;CCK-8法检测各组细胞活力;RT-PCR法检测各组细胞OPG、BGP和COL1 mRNA表达的变化;碱性磷酸酶活性试剂盒检测各组细胞碱性磷酸酶活性。 结果 不同干预组成骨细胞内活性氧含量差异显著不同（P<0.05）,FAC组显著高于对照组,FAC+NAC组低于FAC组、高于NAC组;各组间活性氧含量的变化与成骨细胞活力、OPG、BGP和COL1 mRNA表达光密度比值、碱性磷酸酶活性呈负相关性,组间比较有统计学差异（P<0.05）。 结论 铁过载降低成骨细胞生物活性可能与铁过载增加成骨细胞内活性氧水平有关。     

miR-17-92基因簇对骨肉瘤细胞增殖侵袭的影响

[目的]探究miR-17-92基因簇对骨肉瘤（osteosarcoma, OS）细胞增殖、侵袭的影响及可能机制。[方法] qRTPCR检测OS细胞MG-63转染前（MG-63细胞）、人成骨细胞hFOB1.19 (hFOB细胞)中的miR-17-92基因簇水平。分别对MG-63细胞行miR-17-92基因簇模拟物组转染（miR-17-92组）与阴性对照转染（miR-NC组）,比较两组miR-17-92基因簇水平、细胞增殖水平及侵袭能力,及转染后MG-63细胞转化生长因子-β1 (transforming growth factor beta 1, TGF-β1)、Smad3、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP）-2、MMP-9蛋白水平。[结果] MG-63细胞的miR-17 [(4.1±1.0) vs (1.2±0.3),P<0.05]、miR-18a [(2.3±0.5) vs (1.4±0.5), P<0.05]、miR-19a [(2.0±0.4) vs (1.3±0.4), P<0.05]、miR-19b [(2.1±0....     

铁调素对成骨细胞骨相关基因表达的影响

目的研究铁调素对人成骨细胞(hFOB1.19)Ⅰ型胶原(COL1)、骨保护素(OPG)、骨钙素(BGP)基因表达的影响。方法成骨细胞在34℃下进行体外培养,以不同浓度铁调素(50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L、400 nmol/L)干预72 h后,收集细胞,分别抽取总RNA,采用半定量RT-PCR法检测成骨细胞中COL1、OPG、BGP mRNA表达的变化。结果 RT-PCR检测显示不同浓度铁调素干预后,各组COL1、OPG、BGP mRNA均有表达;不同浓度组的COL1、OPG、BGP mRNA表达光密度比值不同,组间密度比值比较存在统计学意义(P0.05),但铁调素在400 nmol/L时抑制OPG的表达(P0.05)。结论 铁调素可上调成骨细胞(hFOB1.19)COL1、OPG、BGP mRNA表达,铁调素浓度增加转录水平逐渐增加,显示有浓度依赖性。     

过表达FOXO1对骨肉瘤细胞侵袭迁移能力的影响及机制研究

目的探讨FOXO1对骨肉瘤细胞侵袭迁移能力的影响及机制。方法采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的方法检测人正常成骨细胞hFOB 1.19和人骨肉瘤细胞U2OS、MNNG/HOS中FOXO1的mRNA表达水平。利用pcDNA3.1-FOXO1重组质粒建立FOXO1过表达的细胞模型,空载质粒(pcDNA3.1-vector)作为对照,qRT-PCR和蛋白质印迹法(Western blot)验证转染效率。确定成功过表达FOXO1基因后利用Cell Counting Kit-8(CCK-8)实验检测骨肉瘤细胞的增殖能力(吸光度值),Transwell实验体外检测骨肉瘤细胞的侵袭和迁移能力,并采用qRT-PCR和western blot的方法检测基质金属蛋白酶9(MMP9)的表达变化。结果人骨肉瘤细胞MNNG/HOS、U2OS中FOXO1的mRNA的表达水平显著低于人成骨细胞hFOB 1.19(P0.05),且骨肉瘤细胞U2OS的FOXO1的表达水平较低。重组质粒pcDNA3.1-FOXO1转染后,骨肉瘤细胞U2OS的FOXO1表达水平显著升高。与对照组(pcDNA3.1-vector)比较,U2OS-FOXO1过表达组的细胞的增殖能力降低(P0.05),侵袭迁移和迁移能力降低,MMP9较对照组表达水平明显降低(P0.05)。结论骨肉瘤细胞中FOXO1表达水平明显低于正常成骨细胞。过表达FOXO1可能通过下调MMP9抑制骨肉瘤细胞的侵袭和迁移能力。     

miR-7-5p通过靶向抑制成纤维生长因子受体 4影响胆囊癌细胞的增殖和迁移

目的:探讨miR-7-5p对胆囊癌细胞增殖和迁移的影响及作用机制。方法:选取胆囊癌细胞GBC-SD，检测miR7-5p和成纤维生长因子受体4(FGFR4)表达情况；通过TargetScan数据库检索调控FGFR4的miRNA，并用双重荧光素酶基因检测系统检测FGFR4与miR-7-5p结合情况；通过慢病毒将miR-7-5p转染GBC-SD细胞，检测FGFR4、miR-7-5p mRNA和FGFR4蛋白表达，MTT检测细胞活性，Transwell检测细胞侵袭。结果:在GBC-SD细胞中miR-7-5p低表达且FGFR4高表达(P＜0.05)；TargetScan预测FGFR4特异结合miR-7-5p，并在双重荧光素酶基因检测系统得到验证；GBCSD细胞慢病毒转染miR-7-5p后，FGFR4 mRNA和蛋白表达水平下调，细胞增殖率下降，穿膜细胞数减少，差异有统计学意义(P＜0.05)；沉默miR-7-5p后，FGFR4 mRNA和蛋白表达水平上升，细胞增殖率升高，穿膜细胞数增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。结论: miR-7-5p通过靶向抑制FGFR4而抑制胆囊癌细胞的增殖和迁移。     

葛根素通过NF-κB通路抑制地塞米松诱导的 hFOB1. 19人成骨细胞凋亡

目的 探索葛根素抑制地塞米松诱导的hFOB1.19人成骨细胞凋亡机制的实验研究。方法 MTS检测葛根素对 hFOB1. 19细胞增殖活性影响,免疫荧光检测DEX诱导hFOB1. 19细胞凋亡及葛根素抑制DEX诱导的细胞凋亡的细胞核改变。Western blot检测p-p65、p-IκB的蛋白表达情况。Realtime PCR检测Caspase-3、Caspase-9的基因表达情况。ELISA检测加人NF-kB抑制PDTC后对凋亡的影响。结果 10-8 M和10-9M葛根素明显增加细胞的增殖活性,10-5 M和10-6 M浓度的 DEX作用72h后诱导细胞凋亡,加人10-8M葛根素后细胞凋亡受到抑制。Western blot结果显示,加人DEX后,p-NF-κB4,p- IkB的表达上调,DEX和PUE共同处理后,DEX诱导的NF-κB和IkB的磷酸化受到抑制。Realtime PCR显示DEX处理后 caspase3、caspase8的mRNA基因表达明上调,而DEX和PUE共同作用后,caspase3、caspase8的mRNA基因表达下调。ELISA 显示PUE抑制DEX诱导的细胞凋亡。PDTC、DEX、PUE共同处理后,PUE对DEX诱导的细胞的保护作用受到部分抑制。结论 葛根素抑制地塞米松诱导的hFOB1. 19细胞凋亡通过依赖于Caspase调节NF-κB通路。     

miR-451a对人胰腺癌BxPc3细胞增殖和凋亡的影响及其分子机制研究

目的分析miR-451a对人胰腺癌BxPc3细胞增殖及凋亡的影响并探究其分子机制。方法以BxPc3细胞为研究对象,建立脂质体转染miR-451a模拟物并分别设不同浓度(25、50、100和200μmol/L)miR-451a组及空白对照组。实时荧光定量PCR法检测各组细胞内miR-451a mRNA表达情况;然后用MTT法、平板克隆实验、流式细胞术及Western blot法分别检测不同浓度miR-451a转染对BxPc3细胞的增殖能力、细胞克隆数、细胞周期及凋亡变化的影响以及BxPc3细胞中巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、钙结合蛋白39(CAB39)、磷酸化磷脂酰肌醇-3激酶(p-PI3K)和磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)蛋白的表达情况。结果各浓度转染组Bx Pc3细胞中mi R-451a m RNA表达量高于空白对照组(P0.050);转染mi R-451a可显著抑制Bx Pc3细胞增殖且呈时间及浓度依赖性(P0.050);200μmol/L miR-451a转染组细胞克隆数明显少于空白对照组(P0.050);miR-451a转染后可使BxPc3细胞分化停滞于G0/G1期并可诱导细胞凋亡且具有浓度依赖性(P0.050);miR-451a转染后BxPc3细胞内MIF、CAB39、p-PI3K和p-AKT蛋白表达较空白对照组下调并呈现浓度依赖性(P0.050)。结论从本研究实验结果看,mi R-451a可抑制BxPc3细胞增殖、诱导细胞凋亡并呈现浓度依赖性,其机制可能与抑制PI3K/AKT信号通路有关。     

大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性和示踪标记

目的 建立大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离和培养方法,观察绿色荧光蛋白(GFP)基因通过慢病毒载体感染MSCs的表达.方法 采用原代贴壁法获得骨髓MSCs,观察细胞形态和生长变化,流式细胞仪鉴定细胞表面标志,体外诱导MSCs向脂肪细胞和成骨细胞分化.采用含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因慢病毒载体感染培养的MSCs,比较细胞感染前后生物学特性.结果 原代贴壁筛选结合差异传代培养的MSCs表面标志阳性率分别为CD44 94.81%,CD90 99.53%,CD106 76.34%,MSCs在pH值稳定于7.2～7.4的环境可传20代.体外MSCs诱导分化后特异性染色显示脂质沉淀和骨结节,表达脂肪细胞和成骨细胞特异基因.慢病毒载体可有效感染大鼠MSCs,加入聚凝胺感染效率达到80%,EGFP在MSCs感染后1个月仍持续表达.结论 骨髓MSCs可长期培养,具有良好的多向分化能力.携带EGFP基因慢病毒载体能高效感染MSCs,EGFP可作为MSCs体内研究的示踪标记.     

MiR-29a通过调节HuR影响前列腺癌细胞的生物学行为

目的 研究前列腺癌中miR-29a 对HuR表达的调节，进而影响细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡。方法 通过实时荧光定量（qRT-PCR）和免疫印迹法（Western blot）检测在正常前列腺上皮细胞RWPE-1和激素非依赖性前列腺癌细胞PC-3内miR-29a、人抗原R(HuR) mRNA和蛋白的表达水平；miR-29a mimics(模拟剂)、inhibitor（抑制剂）和NC miRNA(对照剂)转染PC-3细胞48 h后检测miR-29a、HuR mRNA和蛋白的表达水平。细胞增殖试剂盒(CCK-8)、迁移和侵袭实验（Transwell小室）、流式细胞术分别检测PC-3细胞被转染后细胞增殖、迁移侵袭、凋亡的改变。结果 与RWPE-1细胞相比，PC-3细胞中miR-29a的表达下调，HuR mRNA和蛋白的上升（P<0.05）。与对照组相比，miR-29a mimics(模拟剂)、inhibitor（抑制剂）转染PC 3细胞后HuR mRNA无改变，但是能够改变HuR蛋白的表达（P<0.05）。MiR-29a能够抑制细胞增殖、迁移、侵袭，促进细胞凋亡（P<0.05）。结论 在前列腺癌PC-3细胞中，miR-29a通过调节HuR蛋白的表达，进而对细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡产生影响。     

miR-21调节缺血缺氧诱导的大鼠肝卵圆细胞自噬的研究

目的探讨miR-21在缺血缺氧诱导的大鼠肝卵圆细胞自噬中的作用。方法体外培养肝卵圆细胞,慢病毒转染肝卵圆细胞构建稳定的细胞株,分别提取各组细胞RNA逆转录后行SYBR Green实时荧光定量PCR,检测各组miR-21的表达,以转染好的稳定的细胞建立缺血缺氧模型,共分为3组:miR-21空载体慢病毒转染HOC自噬组,miR-21增强慢病毒载体转染HOC自噬组,miR-21-inhibition慢病毒载体转染HOC自噬组。Hoechst 33258染色观察细胞凋亡;应用丹(磺)酰戊二胺(Monodansylcadaverine,MDC)染色荧光定位法、观察各组细胞的自噬;免疫印迹法(Western blotting)检测各组细胞LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达情况。结果与空载体组比,增强组miR-21基因水平表达增强,而MDC染色减弱(自噬减少),蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值减少;而抑制组miR-21基因水平表达减少,MDC染色增强(自噬增强),蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值增多。结论抑制miR-21过表达可以增强缺血缺氧引起的肝卵圆细胞的自噬,有利于肝卵圆细胞在缺血缺氧微环境中稳定细胞内环境,维持细胞的存活。     

miR-21在TGF-β1引起的肝卵圆细胞上皮间质转化中的作用

[摘 要] 目的 探讨microRNA-21（miR-21）在TGF-β1引起的肝卵圆细胞（hepatic oval cell,HOC）上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition,EMT）中的作用。方法 体外培养大鼠肝卵圆细胞,用10 ng/mL TGF-β1刺激HOC 1、3、5、7 d后,Western blotting检测EMT相关蛋白（E-cadherin、N-cadherin和Vi-mentin）表达情况;用10 ng/mL TGF-β1刺激HOC 5 d后,实时荧光定量PCR检测miR-21的表达情况;分别用miR-21增强和抑制慢病毒转染HOC构建稳定的细胞株,PCR检测miR-21的表达情况;接着用TGF-β1刺激miR-21抑制慢病毒转染的HOC 5 d,Western blotting检测E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表达;用miR-21增强慢病毒转染HOC后,Western blotting检测E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表达。结果 TGF-β1刺激HOC 1、3、5、7 d后,E-cadherin逐渐减低,N-cadherin和Vimentin逐渐升高。TGF-β1刺激HOC 5 d后miR-21的表达增强了4.32倍。分别用增强和抑制慢病毒转染HOC后,miR-21的表达增强了3.82倍和抑制了0.22倍。下调miR-21表达后,TGF-β1致HOC的EMT作用减弱。miR-21过表达后,HOC发生了EMT。结论 抑制miR-21的表达可以减少TGF-β1引起的HOC的EMT作用,从而减轻肝纤维化。     

miR-567在胰腺癌细胞中的表达及其作用机制

目的:探讨miR-567在胰腺癌细胞中的表达及其作用。方法:采用qRT-PCR检测正常胰腺导管上皮细胞系HPDE6-C7及胰腺癌细胞系Panc-1、AsPC-1、HPAC、BxPC-3中miR-567表达。Panc-1细胞转染miR-567过表达慢病毒载体后,分别用CCK-8法、流式细胞术、划痕愈合实验、qRT-PCR、Western blot法检测细胞增殖、凋亡及迁移能力,以及KPNA4 mRNA与蛋白的表达、凋亡相关蛋白表达的变化。结果:miR-567在胰腺癌细胞系Panc-1、AsPC-1、HPAC、BxPC-3中的表达水平均明显低于正常胰腺导管上皮细胞系HPDE6-C7(均P0.05);miR-567慢病毒转染Panc-1细胞后,增殖能力明显减弱,凋亡率明显增加,划痕愈合率明显降低、KPNA4 mRNA与蛋白表达明显下调、而caspase-3及Bax蛋白表达明显上调(均P0.05)。结论:miR-567在胰腺癌细胞中表达降低,升高其表达可抑制胰腺癌细胞的生长与迁移能力,其机制可能与下调KPNA4并上调凋亡相关蛋白表达有关。