灭活仙台病毒Tianjin株诱导人乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡作用及其机制的研究

【目的】 研究紫外线灭活复制缺陷的仙台病毒Tianjin株致人乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡作用及其机制。 【方法】 首先制备并鉴定紫外线灭活仙台病毒Tianjin株,然后用不同剂量灭活病毒感染MDA-MB-231细胞,24 h后,MTT法检测灭活病毒对MDA-MB-231细胞增殖的影响;Hoechst染色及AnnexinⅤ-FITC/PI标记流式细胞仪检测MDA-MB-231细胞凋亡情况;JC-10染色流式细胞仪检测MDA-MB-231细胞线粒体膜电位变化;分光光度法测定MDA-MB-231细胞内caspase-9、-8和-3活性;蛋白质印迹法检测MDA-MB-231细胞中Bcl-2、Bax、Cyt c、caspase-9、Fas、FasL、caspase-8和caspase-3蛋白表达水平。 【结果】 MTT检测显示灭活Tianjin株能够抑制MDA-MB-231细胞增殖,且呈剂量依赖性;Hoechst染色发现灭活病毒感染的MDA-MB-231细胞有明显形态学改变,细胞核呈致密浓染或碎块状致密浓染;AnnexinⅤ-FITC/PI标记流式细胞仪检测显示灭活病毒组细胞凋亡率呈剂量依赖性升高,JC-10染色流式细胞仪分析显示灭活病毒组细胞线粒体膜电位呈剂量依赖性降低,且与对照组比较均有统计学差异(P<0.01);caspase 活性检测显示灭活病毒组caspase-9、-8和-3活性均呈剂量依赖性升高, 与对照组比较有统计学差异(P<0.01);蛋白质印迹结果显示高剂量灭活病毒组(MOI 80)Bcl-2表达下调,Bax、Cyt C、Fas、FasL、活化caspase-9、-8和-3表达上调。 【结论】 灭活仙台病毒Tianjin株能够诱导人乳腺癌MDA-MB-231细胞发生剂量依赖性凋亡,其机制与线粒体内源性途径和死亡受体外源性途径密切相关。     

4株蚊媒病毒多重RT-PCR快速检测方法的建立

目的建立登革1、2型病毒、黄热病毒及流行性乙型脑炎病毒的多重RT-PCR快速检测方法。方法参照病毒核酸序列设计多重RT-PCR引物,并检索GenBank国际基因序列数据库初步验证其特异性,随后对Mg2+、dNTP及引物浓度,RT-PCR反应条件进行优化,建立稳定、特异的多重RT-PCR快速检测4株病毒方法 ,并以同属于黄病毒科的登革3型病毒、登革4型病毒及甲病毒属基孔肯亚病毒、辛德毕斯病毒为对照,验证其特异性。结果应用多重RT-PCR反应体系,对引物的相关性实验结果表明引物之间不会因相互干扰而出现假阳性结果 ;采用多重RT-PCR引物对登革1、2型病毒、黄热病毒及流行性乙型脑炎病毒进行扩增,分别获得574、251、879、422 bp片段,与设计相符,而对照病毒组均无非特异性扩增条带。结论实验证明,所建立的多重RT-PCR方法能够快速地检测登革1、2型病毒、黄热病毒及流行性乙型脑炎病毒,为其检测提供了一种方便易行的方法 。     

双重实时荧光RT-PCR法检测肠道病毒方法的建立及应用

目的 建立检测肠道病毒(EV)和肠道病毒71型(EV71)的双重实时荧光RT-PCR法.方法 设计特异性引物和探针,建立双重实时荧光RT-PCR反应体系,绘制标准曲线,对该方法的灵敏度、精密度等进行评价.收集109例临床手足口病患者粪便和咽拭子标本用该法进行检测,并与EV71商品化试剂盒检测结果进行比较.结果 双重荧光PCR法建立的EV和EV71标准曲线相关系数(r)均为0.998;该法检测EV和EV71的灵敏度分别达到0.5 TCID50/mL和0.05 TCID50/mL;检测EV和EV71的批内精密度均小于3％,总精密度均小于或等于4％;对肠道病毒及其他人类非肠道病毒进行检测,显示了良好的特异性.109例临床样本用该法检测出84例EV病毒阳性样本,其中EV71阳性56例,EV71总阳性率为51.4％;与单重荧光PCR商品化试剂盒的检测结果完全一致(P=1.000).结论 建立的双重实时荧光RT-PCR法灵敏度高、稳定性好,对手足口病的早期高通量快速诊断具有重要意义.     

仙台病毒RT-PCR检测方法的建立及灰仓鼠中流行情况调查

目的建立仙台病毒(SV)RT-PCR检测方法,并对灰仓鼠仙台病毒感染情况进行调查。方法根据NCBI发表的SV(gi:9627219)基因组序列设计引物,建立RT-PCR方法,对方法的特异性和灵敏性进行验证,并用该方法检测60份灰仓鼠的肺脏样本。结果建立的SV RT-PCR方法显示有较好的敏感性和特异性:以仙台病毒为模板扩增产生197 bp的单一目的条带,经测序比对与NCBI数据库中SV相关序列的一致率为98%,而以猴副流感病毒(SV5)、犬瘟热病毒、小鼠肺炎病毒、呼肠孤病毒III型及腮腺炎病毒为对照无任何条带产生;能检出的SVcDNA最低浓度是96.8 ng/mL;用该方法检测60份灰仓鼠,SV的感染率为3.33%(2/60)。结论建立的SV RT-PCR方法可用于实验类啮齿动物动物SV的常规检测,自然条件下灰仓鼠感染SV的问题不容忽视。     

OGGl基因表达的半定量RT-PCR检测方法的建立

目的培养的犬肾细胞（MDCK）内8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶（OGGl）基因表达的半定量RT-PCR检测体系的建立。方法培养MDCK细胞后提取总RNA,经优化进行RT-PCR反应,检测细胞内OGGl基因的表达。扩增产物经测序同GenBank中OGGl基因序列比对验证产物的准确性,条带经ImageJ软件分析并与内参基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）相比,对体系的重复性进行分析。结果扩增产物证实与GenBank中该细胞的OGGl基因序列一致;重复性测定发现,MDCK细胞OGGl与GAPDH灰度值比值的均值为（0．84±0．025）,CV值为2．99％。结论本方法的准确性、重复性均较好,可用于半定量检测培养细胞尤其是MDCK细胞内OGGlmRNA的表达量。     

I型鸭肝炎病毒TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立及初步应用

目的 建立快速诊断I型鸭肝炎病毒的荧光定量RT-PCR方法。方法 根据NCBI下载的20个来自我国不同省份的的I型鸭肝炎病毒的基因序列,找出其保守序列,设计合成一对引物和一条TaqMan探针,进行条件优化,检测其特异性,敏感性,稳定性。结果 该方法敏感性达20拷贝,比常规PCR敏感性高。其特异性强,对番鸭细小病毒(MDPV),鹅细小病毒(GPV),新城疫病毒(NDV)和禽流感(AIV),鸭减蛋综合征病毒(EDSV),禽网状内皮组织增生症病毒(REV),鸭坦布苏病毒(DTMUV),禽呼肠弧病毒(ARV)8种病毒的检测均为阴性,I型鸭肝炎病毒检测结果为阳性。用建立的方法检测了江苏徐州采集100份样品,阳性率为92%。说明I型鸭肝炎病毒在江苏徐州地区的鸭群中普遍存在。结论 建立了I型鸭肝炎病毒荧光定量PCR方法。     

仙台病毒RT-PCR检测方法的建立与应用

目的建立仙台病毒的RT—PCR方法并应用于常规检测。方法根据仙台病毒（gi：9627219）F蛋白的基因序列，设计Ff和Fr引物，以仙台病毒总RNA逆转录的cDNA为模板扩增出约609bp预期条带；将建立的RT—PCR方法应用于人工感染小鼠和送检细胞样品检测。结果八份感染小鼠样品中全部扩增出约609bp目的条带，16份肿瘤细胞样品有12份扩增出609bp目的条带。结论建立的仙台病毒RT—PCR方法是一种灵敏、快速、特异的方法，能够用于常规检测。     

Hcmv-miR-UL112荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的建立一种能快速准确检测hcmv-miR-UL112的方法。方法根据miRBase网站中公布的hcmv-miRUL112基因序列,通过设计引物、探针及优化反应条件,建立了一种实时荧光定量PCR方法对hcmv-miR-UL112进行定量检测,并进行敏感度、重复性和特异性实验,同时对PCR产物进行测序验证。结果获得了1条特异性茎环反转录引物,一条特异性PCR正向引物和通用反向引物。PCR最佳反应条件为95℃10min,53℃2min;95℃15s,57℃40s,共40个循环。该方法的批内变异系数CV和批间CV均<5%,相关系数R2均>0.99,扩增效率均>90.0%。结论成功建立了一种敏感度高、特异性强、重复性好并且简便快速的hcmv-miR-UL112荧光定量qRT-PCR检测方法。     

牛病毒性腹泻病毒RT-PCR方法的建立及应用

目的建立用于牛源样本中牛病毒性腹泻病毒(BVDV)双重RT-PCR检测方法。方法选择已发表的BVDV 1型和BVDV 2型包含5’UTR区高保守区域基因作为靶基因,分别设计合成引物,建立双重BVDV RT-PCR方法,并对方法的特异性、敏感性、稳定性等进行方法学评价。同时用建立的RT-PCR方法检测了小牛血清、小牛血清去蛋白提取液、脾多肽注射液等41批次牛源性样本和64份牛血浆样本。牛源样本和64份牛临床样本。结果建立的BVDV RT-PCR检测方法与牛副流感病毒III型(BPIV3)、猪瘟病毒(CSFV)、乙型脑炎病毒(JEV)均无交叉反应;检测BVDV 1型和BVDV 2型DNA模板最低浓度分别为每微升8.87×10~2拷贝和6.31×10~2拷贝,BVDV 1型和2型c DNA在-30℃冰箱放置12个月仍可检测出目的条带。应用建立的BVDV RT-PCR方法检测41批次牛源样本和64份牛血浆样本,核酸阳性率分别为14.6%和29.7%。结论建立的BVDV RT-PCR检测方法具有快速、特异、敏感及稳定的特点,可用于牛源样本携带BVDV核酸的检测。     

MTH1基因表达的半定量RT-PCR检测方法的建立

目的建立一个检测培养MDCK细胞内MutT同源蛋白1(MTH1)基因表达的半定量RT-PCR体系。方法细胞培养后提取总RNA,经优化RT-PCR反应检测细胞内MTH1基因的表达量。条带经ScionImmage软件分析并与内参基因GAPDH相比,对体系的准确性、重复性和灵敏度进行分析,然后运用本体系检测流感病毒感染后MDCK细胞内MTH1的表达。结果扩增产物经测序分析证实与GenBank中该细胞的MTH1基因序列一致;灵敏度检测发现最低可从50ng总RNA中检出目的基因的表达;重复性测定发现,MDCK细胞MTH1与GAPDH灰度值比值的均值为(2.02±0.09,n=10),CV值为4.31%。结论本方法的准确性、重复性和灵敏度均较好,可用于半定量检测培养细胞尤其是MDCK细胞内MTH1 mRNA表达量。     

实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法与细胞培养法检测流行性感冒病毒的比较

目的：比较实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法与细胞培养法检测流行性感冒病毒的差异。方法采用实时荧光定量RT-PCR及经典的狗肾传代细胞病毒分离2种方法,同时对流感监测点送检的80份疑似流感标本检测流感病毒。结果细胞培养病毒分离的阳性数为26份,实时荧光定量RT-PCR的阳性数为36份,χ2=8.1, P<0.005。结论通过该实验,验证了实时荧光定量RT-PCR的确快速敏感,适用于实验室快速诊断。     

柯萨奇B组病毒逆转录聚合酶链反应检测方法的建立

根据柯萨奇Ｂ组病毒（ＣＢＶ）基因组５’非编码区核苷酸序列，选用了一对组特异性引物，用于逆转录聚合酶链反应检测ＣＢＶ－ＲＮＡ。结果显示该法可检出ＣＢＶ１～６型ＲＮＡ，灵敏度为１０ＰＦＵ，不能检出其他病毒ＲＮＡ。采用的碘化钠－异硫氰酸胍－氯仿法提取ＣＢＶ－ＲＮＡ与传统的蛋白酶Ｋ－酚－氯仿法及异硫氰酸胍－酚－氯仿法比较，具有快速、简便、稳定、可靠的特点。应用该法检测ＣＢＶ－５感染鼠外周血ＲＮＡ，第３ｄ即为阳性，提示本法可用于ＣＢＶ感染的早期诊断     

聚合酶链反应在诊断肺结核中的应用

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术对７８例患者的痰、支气管肺泡灌洗液（ＢＡＬＦ）和胸水标本进行结核菌检测；并同时进行涂片抗酸染色、皮肤结核菌素试验及血结核菌抗体检测。结果：ＰＣＲ阳性率为４６．１５％，与涂片镜检、结核菌素试验强阳性、血结核菌抗体阳性率（分别为３．８５％、１７．９５％、１１．５４％）相比均有显著性差异（Ｐ＜０．０５）。由此可见ＰＣＲ方法比传统方法具有更高的结核杆菌检出率。     

1型HIV感染多重PCR检测方法的建立及临床应用

目的建立检测人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的多重巢式PCR(nPCR)和多重反转录PCR(RT-PCR)方法。将其与已经上市的NASBA法试剂盒进行检测敏感性比较;探讨血浆RNA水平对PCR检测敏感性的影响;评价该方法用于我国HIV-1感染者诊断的价值。方法针对HIV-1的gag、pol和gp41区设计3套引物,建立检测HIV DNA的多重nPCR和检测HIVRNA的多重RT-PCR方法;分别以建立的PCR方法和NASBA法对119例HIV阳性患者进行检测,比较2者的检测敏感性;将患者分为不同的病毒载量组,比较PCR方法在各组患者中的检测敏感性差异;使用建立的PCR方法对10例可疑急性感染者进行检测;扩增HIV-1膜区C2-C3段,对nPCR检测阳性的43例DNA样本进行亚型鉴定。结果多重nPCR的检测敏感度为97.5%(116/119),多重RT-PCR的敏感度为78.2%(93/119),2者的特异度均为100%(50/50),多重nPCR和多重RT-PCR的阳性预测值分别为97.5%(116/119)和78.2%(93/119),阴性预测值均为100%(50/50),准确性分别为98.2%和84.6%。经比较,多重nPCR和多重RT-PCR的检测敏感度都高于NASBA法。在病毒载量<103copy/mL的患者,nPCR的检测敏感性高于RT-PCR,在病毒载量在(103～104)copy/mL的患者及病毒载量≥104copy/mL的患者,2者的敏感性比较相近,均接近100%;检测的10例可疑急性感染者中,有5例患者的nPCR和RT-PCR检测结果阳性,抗体在随访过程中阳转,证实为HIV急性感染者;检测的43例DNA样本分属于B’亚型(37例),AE亚型(5例)和BC亚型(1例)。结论本课题组建立的PCR检测方法可以对我国主要流行的B’、AE和BC亚型病毒株得到很好的扩增效果;nPCR的检测敏感性受血浆RNA水平的影响相对较小,RT-PCR的检测敏感性受血浆RNA水平的影响相对较大;PCR方法可以用于HIV急性感染者的早期诊断。     

用聚合酶链反应技术诊断结核病

用聚合酶链反应技术对结核杆菌特异性重复序列ＩＳ６１１０部分基因１２３ｂＰ的片段进行扩增。该法检测人型结核杆菌灵敏度可达到１０ｆｇＤＮＡ，对１４９份结核患者临床标本检测结果显示ＰＣＲ总阳性率（６９．１％）明显高于直接涂片荧光镜检（１５．４％）与细菌培养（１０．１％）的阳性率（Ｐ＜０．０１）。研究表明ＰＣＲ是一种特异、敏感、快速诊断结核病的好方法，值得推广。     

Wilms瘤基因WT1 mRNA的FQ-RT-PCR定量分析研究

[目的]探讨WT1mRNA在Wilms瘤表达的临床意义及其与Wilms瘤生物学性状的关系.[方法]对22例Wilms瘤、瘤旁肾组织及血液标本行WT1 mRNA FQ-RT-PCR定量检测.用SPSS软件进行统计学检验,分析.[结果]肿瘤组织中WT1mRNA表达显著高于肾组织和血液,与年龄、性别、BWT或UWT无关.UH型高于FH型,而肾组织表达又较血液高,BWT血中WT1mRNA表达高于正常对照组及UWT组,而UWT与正常表达无差别.[结论]Wilms瘤基因WT1mRNA表达与Wilms瘤发生发展存在关联,且与肿瘤的病理及预后相关,表达越高病理类型及预后越差,但与WT患儿的年龄、性别、BWT或UWT无关.血WT1mRNA表达水平可能作为BWT的诊断或高危筛选指标.     

聚合酶链反应及染色法在口腔念珠菌白斑诊断中的应用

【目的】探讨聚合酶链反应技术在检测口腔白斑中念珠菌感染的应用。【方法】应用组织化学染色法和聚合酶链反应技术对口腔白斑是否存在念珠菌进行检测。【结果】 10 7例口腔白斑 ,经PAS和六胺银染色 ,16 .8% (18/ 10 7)的口腔白斑检出念珠菌菌丝。念珠菌细胞色素P4 50 基因片段PCR检出率为 10 % (11/ 10 7) ,其中的白色念珠菌EO3 基因片段的PCR检出率为 6 .5 % (7/ 10 7)。【结论】组织化学染色法能直观显示口腔白斑中念珠菌形态分布特点以及所引起的组织学改变 ,而PCR特异性强 ,可区分不同种属的念珠菌感染     

广州地区扎幌样病毒的检出及基因型分析

目的 了解广州腹泻儿童是否存在扎幌样病毒(Sapporo-likevirus,SLV)感染。方法 在2003年秋冬季腹泻流行期间在南方医院儿科收集临床诊断为病毒性腹泻患儿的粪便标本,并采用半套式反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测。纯化阳性标本PCR产物并测序,然后将其同GenBank中的参比毒株序列比较。结果 收集的169份标本中有1份SLV(CH03354)PCR扩增阳性,检出率为0.59%,同源性分析表明该毒株属于SLVGⅠ-1群。结论 广州地区存在SLV所致感染,本次实验检出毒株基因型与安徽毒株不同,说明我国不同地区可能存在不同的SLV基因型。     

RT-PCR检测汉坦病毒的感染

目的：探讨逆转录-聚合酶链庄应（RT-PCR）检测汉坦病毒（Hantaviru，HV）感染的准确性和敏感性。方法：以陈株汉坦病毒感染培养的Vero-E6细胞和小鼠乳鼠，用RT-PCR和免疫荧光（immunofluorescence，IF）的方法分别予以检测。结果：RT-PCR和IF对病毒感染细胞的检测结果均为阳性，8只接种病毒的乳鼠肺组织RP-PCR检测均为阳性，而免疫荧光检测仅5例阳性。结论：RT-PCR是一种比较准确的检测汉坦病毒感染的方法，其敏感性高于IF。     

荧光定量-聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒DNA及其临床价值

目的:应用荧光定量聚合酶链反应(FQ PCR)技术检测血清乙型肝炎病毒(HBV)DNA,评价其临床应用价值。方法:用FQ PCR和酶联免疫吸法(ELISA)检测298份血清HBVDNA拷贝数和免疫学血清标志。结果:27份HBsAg、HBeAg、HBcAb均阳性的标本中,HBVDNA阳性率96.3%,平均拷贝数5.0×107mL;69份中检出率44.9%,平均拷贝数2.1×105mL;43份中检出率34.9%,平均拷贝数8.6×103mL。结论:FQ PCR可以准确、灵敏地判断HBV感染的实际情况及复制水平,可为选择治疗方案和评估药物疗效提供较可靠的理论依据。