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1.
目的:构建含TCRγV1基因的真核表达质粒并检测其存小鼠骨骼肌中的表达。方法:从人淋巴瘤Jurkat细胞中提取RNA,用RT-PCR法扩增含BamH Ⅰ与Hind Ⅲ酶切位点的TCRγV1基因序列,将TCRγV1基因PCR产物插入pcDNA3后转化到大肠杆菌DH5α,阳性克隆酶切鉴定后测序分析。大量提取质粒,股四头肌注射法免疫小鼠,RT—PCR法检测小鼠肌肉巾TCRγV1 mRNA的表达。结果与结论:pcDNA3/TCRγV1重组质粒构建成功,并能在小鼠骨骼肌中表达。 相似文献
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小鼠干扰素γ基因克隆、测序及辐射诱导表达质粒pIRESEgr-IFNγ的构建 总被引:1,自引:1,他引:0
目的:克隆小鼠干扰素γ(IFN-γ)编码区cDNA序列并构建含Egr-1启动子的辐射诱导表达质粒pIRESEgr-IFNγ。
方法:利用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)法,以小鼠脾细胞mRNA为模板,扩增获得全长IFNγcDNA,与pGEMT载体连接做全自动测序,并利用基因重组技术构建含Egr-1启动子的辐射诱导表达质粒pIRESEgr-IFNγ。
结果:经测序证实获得的小鼠IFNγ cDNA序列与文献报道完全一致,并构建了含Egr-1启动子的辐射诱导表达质粒pIRESEgr-IFNγ。结论:成功克隆了小鼠IFNγ的cDNA序列,构建了辐射诱导表达质粒pIRESEgr-IFNγ。 相似文献
4.
目的:构建含MAGE—1基因的重组真核表达质粒。方法:用RT—PCR方法从人肝细胞肝癌组织中扩增出MAGE-1基因cDNA序列,克隆至pGEM—T载体,测序证实基因碱基序列无误后,再克隆至真核表达载体pcDNA3.1( ),构建了pcDNA3.1—MAGE—1重组质粒。结果与结论:RT—PCR获得长度为927bp的阳性产物,经T载体和pcDNA3.1( )真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后。证实真核表达质粒pcDNA3.1—MAGE—1构建成功。 相似文献
5.
含人乳癌DF3/MUC1启动子转录调控序列和白喉毒素A链基因表达载体的构建 总被引:7,自引:0,他引:7
目的:构建含人乳癌DF3/MUC1启动子转录调控序列和白喉毒素A链(DTA)基因的重组表达载体。方法:利用PCR技术从人乳癌细胞MCF-7中扩增出DF3/MUC1启动子的转录调控序列并克隆入pMD18T载体中,再从pMD18T-DF3重组质粒中切下DF3/MUC1启动子的转录调控序列并亚克隆入pGL3-Basic载体,构建重组质粒pGL3-DF3。从质粒pIBI30-DTA中切下DTA片断,以DTA基因替换重组质粒pG13-DF3中的虫荧光素酶基因,构建重组质粒pGL3-DF3-DTA。结果:构建了含人乳癌DF3/MUC1启动子转录调控序列和DTA的表达载体,酶切和测序结果与预期完全相符。结论:重组质粒pGL3-DF3-DTA构建成功。 相似文献
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hTERT片段真核表达质粒的构建 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)片段的真核表达质粒,方法:从肿瘤组织中提取总RNA.采用RT—PCR法扩增hTERT基因并克隆人PGEM—T Easy载体中,然后再亚克隆于pcDNA3.1真核表达载体,用PCR扩增及限制性酶切法筛选重组真核表达质粒,并以DNA测序鉴定。结果:PCR扩增及限制性酶切法证实重组真核表达质粒的构建成功。测序表明,hTERT基因片段与GenBank公布的相应基因同源性比较,核苷酸序列的同源性为98.73%,氨基酸序列的同源性为99.68%。结论:成功构建了hTERT真核表达质粒,为进一步研究与hTERT相关的抗肿瘤免疫治疗奠定了基础。 相似文献
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小鼠内皮抑素基因克隆、测序及pEgr-IFNγ-mEndostatin 重组双基因表达质粒的构建 总被引:8,自引:6,他引:2
目的:克隆小鼠内皮抑素(mEndostatin)编码区cDNA序列并构建含Egr-1启动子的IFNγ和mEndostatin双基因表达载体。
方法:利用逆转录多聚酶链反应法(RT-PCR),以小鼠肝细胞mRNA为模板,扩增获得全长mEndostatin,与pMD18T载体连接作全自动测序,并利用基因重组技术构建含Egr-1启动子的IFNγ和mEndostatin双基因表达质粒。
结果:经测序证实获得的mEndostatin序列与文献报道完全一致,并构建了含Egr-1启动子的IFNγ和mEndostatin双基因表达质粒pEgr-IFNγ-mEndostatin。
结论:利用RT-PCR法成功克隆了mEndostatin的cDNA序列,构建了pEgr-IFNγ-mEndostatin重组双基因表达质粒。 相似文献
8.
鼠连接蛋白43基因真核表达重组质粒的构建和鉴定 总被引:1,自引:0,他引:1
目的 构建含鼠连接蛋白43基因的真核表达重组质粒。方法 从胎鼠中提取总RNA,经RT-PCR方法获得并扩增含全部编码序列的连接蛋白43cDNA片段,将其克隆到pBudCE4.1真核表达载体上,并进行酶切鉴定和测序分析。结果 RT-PCR技术扩增出约1.1kb的连接蛋白43基因全部编码序列的片段。测序分析证实所插入连接蛋白43基因片段的序列完全正确。结论 鼠连接蛋白43基因真核表达重组质粒成功构建。 相似文献
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目的:构建含有cdx2全长基因的真核表达质粒并在人胃上皮细胞系中表达。方法:从人结肠上皮组织中提取总RNA,RT-PCR获得全长人cdx2基因的cDNA,测序证实序列正确后亚克隆入pcDNA3.1来构建重组真核表达载体pcDNA3.1/cdx2。使用脂质体将该重组质粒转染入人胃上皮细胞GES-1中,RT-PCR证明该细胞中出现人cdx2基因的表达。结果:酶切鉴定和测序显示靶基因cdx2克隆到pcDNA3.1质粒中,RT-PCR证实转染的人胃上皮细胞中有人cdx2基因的表达。结论:成功构建含有人cdx2基因的真核表达质粒。并在人胃上皮细胞中表达。 相似文献
10.
目的:构建人膜联蛋白V基因真核表达载体,探讨人膜联蛋白V的生理功能。方法:PCR方法扩增含EcoRI及BamHI酶切位点的膜联蛋白V基因序列,对真核表达载体pcDNA3.1(-)和膜联蛋白V基因扩增产物进行双酶切,用连接酶将二者连接并转化到大肠杆菌BL21,重组质粒经测序鉴定,称为pcDNA3.1(-)AxV。结果:酶切琼脂糖电泳分析pcDNA3.1(-)AxV中含有膜联蛋白V基因,序列分析表明与文献报道的序列完全一致。结论:成功地构建了人膜联蛋白V基因的真核表达载体,为研究其生理作用奠定了基础。 相似文献
11.
目的:构建脂氧素A4受体样蛋白(LRLP)基因的真核表达载体,克隆后转染Hela细胞,观察LRLP基因在Hela细胞中的表达。方法:应用PCR方法.以小鼠睾丸cDNA为模板,扩增出LRLP基因片段,插入质粒pGEM—T中,转化人大肠杆菌JM109。扩增阳性重组质粒,经酶切后纯化并测序鉴定目的片段。构建含绿色荧光蛋白基因的真核表达载体pEGFP/LRLP,转化人大肠杆菌JM109扩增.酶切后再测序鉴定目的片段,抽提质粒后瞬时转染Hela细胞,置激光共聚焦显微镜下照像。结果:测序鉴定表明.克隆的LRLP序列与GenBank中LRLP原序列100%.符合,激光共聚焦显微镜下见Hela细胞中LRLP基因表达。结论:成功地构建了真核表达载体pEGFP/LRLP,并转染了Hela细胞。 相似文献
12.
HCV core真核表达质粒pcDNA3.1(-)/core的构建 总被引:1,自引:0,他引:1
目的构建HCV core基因真核表达质粒,为进一步研究和解析HCV诱发人不死化肝细胞癌化的机制,HCV感染的检测及疫苗和药物研发做好前期基础。方法将含HCV全长基因的pBRTM/HCV1-3011质粒于大肠杆菌JM109内扩增;提取pBRTM/HCV1-3011质粒;从pBRTM/HCV1-3011质粒中PCR扩增出HCV core片段并将其插入pGEM—T克隆载体;再与表达栽体pcDNA3.1(-)重组,以得到重组的真核表达栽体pcDNA3.1(-)/core;最后限制性酶切鉴定HCV core表达载体。结果从pBRTM/HCV1-3011质粒中扩增出的HCV core片段大小正确,经测序证明其碱基序列为编码目的基因的正确序列;凝胶电泳结果证明已将此片段克隆到pcDNA3.1/core内。结论成功的构建了HCV core基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)/core。 相似文献
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人中性粒细胞多肽1,3真核表达载体的构建与鉴定 总被引:3,自引:3,他引:0
目的:扩增人中性粒细胞多肽1,3(HNP1,3)基因片段,构建真核表达载体pcDNA3.1/V5-His-TOPO/HNP1,3。方法:从健康人中性粒细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增出HNP1,3基因完整的cDNA片段,应用TA克隆插入pMD18-T载体,经酶切鉴定及序列分析确证后,将其亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1/V5-His-TOPO中。结果:从人中性粒细胞中克隆出人HNPl1,3基因,经测序分析与GenBank公布的人HNP1,3核苷酸序列同源性为100%,成功地构建了真核表达载体pcDNA3.1/V5-His-TOPO/HNP1,3。结论:真核表达载体pcDNA3.1/V5-His-TOPO/HNP1,3的成功构建,为后续重组基因的真核/表达及其对HIV-1抑制作用的研究奠定了实验基础。 相似文献
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人NKG2D真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的瞬时表达 总被引:2,自引:0,他引:2
目的:构建人NKG2D重组真核表达载体,并研究其在COS-7细胞中的表达。方法:应用RT-PCR,自健康人外周血单个核细胞(PBMC)中获取NKG2D cDNA,应用基因重组技术构建含目的基因的T载体克隆后,构建含目的基因的真核细胞表达质粒,并经酶切和测序证实。然后应用脂质体介导将重组真核表达质粒转染COS-7细胞.用RT-PCR和流式细胞术(FCM)检测转染细胞NKG2D表达。结果:重组真核表达载体中插入片段序列与GeneBank登录的cDNA序列一致。NKG2D在COS-7细胞中获得表达。结论:成功地构建了重组表达栽体pcDNA3.1-NKG2D,并实现了在COS-7细胞中的瞬时表达,为研究NKG2D的生物学活性奠定了基础。 相似文献
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目的:构建编码弓形虫RH株三磷酸核苷水解酶(NTPase-Ⅱ)重组真核表达载体PVAX1-NTPase-Ⅱ。方法:采用PCR从弓形虫基因组DNA中扩增NTPase-Ⅱ基因,克隆入pGEM-T Easy载体,并对重组入外源基因的质粒通过PCR、酶切和测序鉴定;采用亚克隆将NTPase-Ⅱ基因克隆至真核表达载体PVAX1,筛选阳性重组质粒PVAX1-NTPase-Ⅱ,进行PCR、酶切和测序鉴定。结果:NTPase-Ⅱ的重组真核表达载体经PCR、酶切和测序鉴定,大小为1 887 bp,与预期大小一致;重组真核表达载体的核苷酸序列,与GenBank中的相应序列100%同源。结论:成功构建重组真核表达载体PVAX1-NTPase-Ⅱ,为弓形虫核酸疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
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目的:构建含人CCR5Delta32基因的重组慢病毒载体并鉴定其表达性能。方法:从CCR5Delta32突变个体外周血单个核细胞(PBMCs)内提取人基因组DNA,利用PCR技术扩增CCR5Delta32全长基因,经EcoRI单酶切后与pUCm-T载体连接,随后转化感受态E.coliDH5α,提取质粒进行酶切鉴定及DNA测序。再将鉴定正确的CCR5Delta32基因亚克隆至慢病毒载体pLenti6/V5-D-TOPO并进行酶切鉴定及DNA序列分析。最后用pLP1、pLP2、pLP/VSVG及pLenti-CCR5Delta32四种质粒共转染293T细胞,产生重组慢病毒并通过Western blot鉴定目的基因在靶细胞内的表达。结果:经PCR扩增获得约650bp的DNA片段,测序结果与发表于GenBank上的序列完全一致。经酶切鉴定,克隆的目的基因已经正确插入到慢病毒载体pLenti6/V5-D-TOPO中。四种质粒共转染293T细胞,产生出5×105TU/ml高滴度的重组慢病毒。用其感染靶细胞,Western blot结果显示有目的蛋白表达。结论:成功构建了含人CCR5Delta32基因的重组慢病毒载体并将其在293T细胞内表达,为进一步AIDS基因治疗研究奠定基础。 相似文献
18.
目的获取人可溶性血管内皮生长因子受体-1(sFlt-1)基因,构建sFlt-1基因真核表达载体,为进一步研究sFlt-1抗肿瘤血管生成的基因治疗奠定基础。方法提取人胎盘组织总RNA,利用RT-PCR方法扩增获得sFlt-1基因cDNA,将其克隆到pUCm-T载体中,测序证实后,用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切pUCm-T-sFlt-1重组载体,胶回收sFlt-1基因,再将其定向亚克隆到真核表达载体pCMV-Script中,提取质粒作双酶切和测序鉴定。结果构建的重组sFlt-1基因真核表达载体pCMV-Script-sFlt-1分别作双酶切和测序鉴定,证实其中含有sFlt-1基因,测序结果经BLAST分析与预期设计的编码区cDNA序列完全一致。结论成功克隆了人sFlt-1基因的真核表达载体。 相似文献
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目的:构建α1,3-半乳糖基转移酶的重组真核表达质粒pcDNA3.1/V5-HisAα1,3GT,为进一步利用其进行胃癌的基因治疗奠定基础。方法:从BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞中提取总RNA,行RT-PCR扩增出编码α1,3-半乳糖基转移酶的全长cDNA,并克隆入pUCm-T测序载体。经DNA测序证实序列无误后,将α1,3-半乳糖基转移酶基因片段亚克隆入pcDNA3.1/V5-HisA真核表达载体。结果:经RT-PCR扩增出大小约为1.2kb的基因片段,成功克隆入pUCm-T载体。经DNA测序证实为α1,3-半乳糖基转移酶(α1,3-galactosyltransferase,3GT),大小为1221bp,编码序列及读框均正确。经亚克隆酶切鉴定,获得携有α1,3GT基因的重组质粒pcNDA3.1/V5-HisAα1,3GT。结论:成功地构建α1,3GT真核表达载体,为进行肿瘤基因治疗奠定了基础。 相似文献
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高迁移率蛋白A2基因真核表达载体构建与表达鉴定 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:构建高迁移率蛋白A2(HMGA2)基因的真核表达载体,观察其在真核细胞中的表达,为进一步研究HMGA2 基因功能奠定理论基础。方法:采用RT-PCR 方法从人乳腺上皮HBL-100 细胞中扩增HMGA2 基因全长cDNA,扩增产物经双酶切及凝胶回收后,直接克隆至黄绿色荧光真核表达载体YFP-C1中,构建YFP- C1-HMGA2重组质粒。将YFP-C1-HMGA2真核表达载体转染到人前列腺癌PC3细胞中,通过RT-PCR方法验证所构建的真核表达质粒YFP-C1-HMGA2的正确性。结果:RT-PCR获得长度为351 bp的HMGA2全长cDNA,经YFP-C1真核表达载体克隆、酶切鉴定及测序分析,测序结果示基因序列与GenBank序列一致,证实真核表达质粒YFP-C1-HMGA2构建成功,并且能够在真核细胞中表达。结论:成功克隆了HMGA2基因,构建了YFP-C1-HMGA2重组质粒。 相似文献