自杀基因ePNP的克隆及在人肝癌细胞HepG_2的表达

目的构建含大肠杆菌的嘌呤核苷酸磷酸化酶（ePNP）DNA的重组逆转录病毒载体,观察ePNP基因在人肝癌细胞株HepG2的表达。方法用PCR法获得ePNP亚克隆,构建重组逆转录病毒载体pDsRed-ePNP,鉴定测序。脂质体法将逆转录病毒载体pDsRed-ePNP转染AmphoPackTM-293包装细胞,获得高滴度病毒并感染HepG2细胞。流式细胞术和荧光显微镜检测红色荧光蛋白（RFP）的表达。RT-PCR法检测ePNPmRNA的表达。ATP-生物荧光体外检测实验（ATP-TCA法）检测不同浓度Fludarabine对HepG2、HepG2/pDsRed和HepG2/ePNP细胞的杀伤作用。结果克隆的ePNP基因与文献报道一致,成功构建重组逆转录病毒载体pDsRed-ePNP。病毒包装后滴度为5E＋4TU/mL。表达RFP的HepG2/ePNP阳性细胞率为97.1%。HepG2/ePNP细胞稳定表达ePNP。低浓度Fludarabine对HepG2/ePNP细胞毒效应明显。结论成功构建重组逆转录病毒载体pDsRed-ePNP,并且获得稳定表达ePNP基因的HepG2/ePNP人肝癌细胞株。     

腺病毒介导的HSV-tk/GCV系统对肺癌细胞的杀伤作用

目的：用含HSV-tk重组腺病毒载体转染Lewis肺癌细胞,探讨其对肺癌细胞的杀伤作用。 方法：利用同源重组技术构建含HSV-tk基因的重组腺病毒载体(AdCMVtk),将含LacZ基因的腺病毒载体(AdCMVLacZ)转染Lewis肺癌细胞,X-gal染色后,测定腺病毒对该细胞的转染率,并观察AdCMVtk/GCV系统对Lewis肺癌细胞存活率的影响。 结果：随着AdCMVLacZ的病毒量（MOI）增加,对Lewis细胞转染率也增加,当MOI为500时,转染率可达100%。AdCMVtk/GCV系统可明显杀伤Lewis细胞, 且随着AdCMVtk的MOI增加,或GCV浓度的增加,细胞存活率减少,但单独使用AdCMVtk或GCV时,对Lewis细胞无杀伤作用。AdCMVtk/GCV系统对该细胞的杀伤作用具有明显的旁观者效应,20%Lewis细胞被AdCMVtk转染可引起74%细胞死亡。 结论：AdCMVtk/GCV系统杀伤肿瘤细胞既有效又安全。     

PNP—TK融合自杀基因及PNP单自杀基因对肝癌细胞杀伤效率

目的分析PNP—TK融合自杀基因系统及PNP单自杀基因系统对肝癌细胞的杀伤作用及二者对肝癌细胞潜在的杀伤机制。方法构建融合基因表达我体pcDNA3．0／PNP—TK。经酶切、PCR及测序鉴定重组体。G418筛选获得稳定转染了pcDNA3．0／PNP-TK的HepG2细胞克隆。RT—PCR和Western Blotting检测融合基因在HepG2细胞中的表达。台盼兰排斥法检测细胞的生长曲线,MTT法检测细胞对相应前药的敏感性及分别在一种和两种前药作用下所导致的旁观者效应。结果融合基因片段PNP—TK正确插入了pcDNA3．0载体中,pcDNA3．0,PNP-TK在肝癌细胞株HepG2中实现了表达。抗性细胞克隆对相应的前药十分敏感。在两种前药的联合作用下。pcDNA3．0／PNP-TK所导致的旁观者效应明显强于只给予MeP-dR一种前药以及pcDNA3．0／PNP单基因系统所致的旁观者效应。结论具有双自杀基因功能的表达载体pcDNA3．0／PNP-TK对肝癌细胞的杀伤效果优于PNP单自杀基因系统。     

胞嘧啶脱氨酶和胸苷激酶融合双自杀基因系统对膀胱癌细胞体外杀伤作用

目的探讨胞嘧啶脱氨酶(CD)和胸苷激酶(TK)融合双自杀基因系统对膀胱癌细胞的杀伤作用。方法利用含有CD-TK双自杀融合基因及绿色荧光蛋白(GFP)基因的复制缺陷腺病毒感染膀胱癌细胞株Mb49细胞,RT-PCR检测CD及TK表达,MTT法测定感染病毒Mb49细胞对GCV和/或5-FC敏感性及旁观者效应。结果RT-PCR可检测到腺病毒感染的Mb49细胞中CD及TK表达,腺病毒感染的Mb49细胞对GCV和/或5-FC敏感性增强,且细胞存活率随前药浓度增加而明显降低,联合应用杀伤效果更强。在混合培养细胞中转染细胞为10%时,GCV组、5-FC组、GCV 5-FC组细胞存活率分别为(79.55±0.88)%、(77.17±3.38)%、(49.21±1.78)%,有较强的旁观者效应。结论腺病毒载体能有效转导CD-TK融合双自杀基因在膀胱癌细胞中表达,CD-TK融合双基因系统对膀胱癌细胞有更强杀伤效果和更明显的旁观者效应,优于单基因系统,值得进一步研究。     

E2F-1在胃癌细胞中高表达的意义

目的通过转染实验观察E2F-1高表达对胃癌细胞株的影响,了解E2F-1与胃癌之间的联系。方法构建E2F-1真核表达载体,转染MKN-45人胃癌细胞株,建立E2F-1高表达的胃癌细胞株模型;并通过克隆形成实验及绘制细胞生长曲线,观察E2F-1高表达对MKN-45细胞的影响。结果与转染空质粒组相比,转染并表达了E2F-1的MKN-45细胞生长受到明显抑制。结论E2F-1高表达能够抑制胃癌细胞MKN-45生长。     

自杀基因联合放射治疗食管癌细胞实验研究

目的　克隆大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶 (CD)基因 ,构建真核载体并转染食管癌细胞系 EC1 0 9,观察大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶 / 5 -氟胞嘧啶 (CD/ 5 - FC)自杀基因系统杀伤肿瘤细胞以及对放射治疗的增敏效应。　方法　根据 Genbank数据库提供的 CD基因核苷酸序列 ,设计并合成一对引物 ,采用PCR方法 ,从大肠杆菌基因组 DNA中扩增出 CD基因 ,与pc DNA3.1定向连接 ,构建受控于人巨细胞病毒启动子的重组真核载体 pc DNA3.1 - CD,并用限制性内切酶、PCR和DNA测序进行鉴定 ,用脂质体转染法转染食管癌细胞系EC1 0 9细胞 ,用 G4 1 8筛选后获得阳性克隆株 EC1 0 9- CD,经PCR进行鉴定 ,CD/ 5 - FC体系对 EC1 0 9细胞的杀伤效应和杀伤时的旁观者效应以及对放射治疗的增敏效应 ,MTT法检测细胞存活比率。　结果　克隆大肠杆菌 CD基因 ,构建真核表达载体 ,经限制性内切酶酶切、PCR扩增和 DNA测序证实其正确性 ,CD基因转染 EC1 0 9细胞后 ,经 G4 1 8筛选后获得阳性克隆株 EC1 0 9- CD,经 RTP- CR分析表明 CD基因已转入 EC1 0 9细胞并开始转录。体外实验表明 ,CD/ 5 - FC体系的旁观者效应及对放射治疗增敏效果明显。　结论　pc DNA3.1 - CD真核表达载体构建及转染 EC1 0 9细胞成功 ,CD/ 5 - FC体系的旁观者效应和放射治疗增敏效果明     

腺病毒介导的HSV-tk体外抗喉癌作用

目的 :观察 HSV- tk/ GCV系统对喉癌细胞的杀伤作用。方法 :将带有报告基因 Lac Z的 5型缺陷性腺病毒载体 Ad CMVL ac Z感染喉癌细胞 Hep- 2 ,X- gal染色 ,测定腺病毒的转染率。利用同源重组技术构建含 HSV- tk基因的重组腺病毒载体 Ad CMVtk。Ad CMVtk感染 Hep- 2细胞后 ,加入 10 mg/ LGCV,观察瘤细胞存活率及旁观者效应。结果 :随着腺病毒感染复数量 (multiplicity of infection,MOI)增加 ,对 Hep- 2细胞转染率亦增加 ,10 0 %转染所需的 MOI为 2 0 0。 Ad CMVtk/ GCV对 Hep- 2细胞的杀伤强度与 Ad CMVtk量呈正向关系 ,即有浓度依赖性。此杀伤作用存在旁观者效应 ,但较弱。结论 :腺病毒介导的 HSV- tk/ GCV具有杀伤喉癌细胞作用     

细菌内同源重组法制备腺病毒介导TK基因对肝癌细胞的杀伤作用

目的 探讨用细菌内同源重组法制备含TK自杀基因腺病毒对肝癌细胞的杀伤作用.方法 将TK基因自载体中切出,亚克隆至腺病毒穿梭质粒中,形成质粒pAdTrack-GFP-TK,将其PmeⅠ酶切线性化后与腺病毒基因组质粒pAdEasy-1共转化BJ5183菌,抽提重组体腺病毒基因组质粒DNA,PacⅠ酶切后转染293细胞包装成腺病毒颗粒,观察其对肝癌细胞的感染效率和目的 基因表达情况及肝癌细胞SMMC-7721感染含TK自杀基因腺病毒后加入丙氧鸟苷(GCV)的生存率和旁观者效应的体外观察.结果 纯化所得腺病毒滴度约为2×1012 efu/mL,当病毒感染复数(MOI)=100时,腺病毒感染SMMC-7721细胞的效率＞90%,实验证实在感染重组体腺病毒的细胞中有相应基因产物的表达,SMMC-7721/Ad-TK细胞对GCV高度敏感,半杀伤浓度(IC50)仅为0.2 μmol/L,HSV-TK/GCV系统在SMMC-7721细胞中存在明显的旁杀伤效应.结论 细菌内同源重组法制备重组腺病毒介导的HSV-TK基因能够成功地在体外整合到肝癌细胞SMMC-7721中,并能高效表达,使其对GCV高度敏感.旁观者效应极大地提高了TK基因抗肿瘤活性,使TK基因制剂实际应用于临床治疗恶性肿瘤成为可能.     

端粒酶启动子调控tk基因靶向性杀伤鼻咽癌细胞的实验研究

目的 探讨端粒酶催化亚单位启动子/胸腺嘧啶脱氧核苷激酶(hTERTp/tk)基因特异载体在体外靶向性杀伤鼻咽癌细胞的效应.方法 通过细胞转染将hTERTp/tk转染鼻咽癌细胞株中,采用RT-PCR及MTT法检测hTERTp/tk/pGL3体外特异性杀伤鼻咽癌细胞的效应及其tk基因、端粒酶表达.结果 转染hTERTp/tk/pGL3后可见tk基因表达,端粒酶及其hTERT表达较对照组下降.hTERTp/tk/pGL3能特异性杀伤鼻咽癌HNE1细胞,而对正常成纤维细胞无杀伤作用,hTERTp/tk/pGL3杀伤细胞的效应比阳性对照CMV/tk/pGL3的无选择性杀细胞作用略低.结论 hTERTp/tk基因特异表达系统具有靶向性杀伤鼻咽癌细胞的作用及抑制肿瘤细胞端粒酶活性.     

腺病毒介导的HSV—tk体外抗喉癌作用

目的：观察HSV－tk/GCV系统对喉癌细胞的杀伤作用。方法：将带有报告基因LacZ的5型缺陷性腺病毒载体AdCMVLacZ感染喉癌细胞Hep-2,X-gal染色，测定腺病毒的转染率。利用同源重组技术构建含HSV－tk基因的重组腺病毒载体AcCMVtk。AdCMVtk感染Hep-2细胞后，加入10mg/LGCV,佼 活率及旁观者效应。结果：随着腺病毒感染复数量（multiplicity of infection,MOI)增加，对Hep-2细胞转染率亦增加，100％转染所需的MOI为200。AdCMVtk/GCV对Hep-2细胞的杀伤强度与AdCMVtk量呈正向关系，即有浓度依赖性。此杀伤作用存在旁观者效应，但较弱。结论：腺病毒介导的HSV－tk/GCV具有杀伤喉癌细胞作用。     

Experimental Studies on PNP Suicide Gene Therapy of Hepatoma

To investigate the killing effect of PNP/MeP-dR suicide gene system on hepatoma cells, pcDNA3. O/PNP, an eukaryotic expression vector harboring E. coli PNP gene, was transfected into human hepatoma HepG2 cells by liposome-mediated method. A HepG2 cell line with stable PNP gene expression, HepG2/PNP, was established with presence of G418 selection. The cell growth curves were determined with trypan blue staining. The sensitivity of HepG2/PNP to MePdR and bystander effects were assayed by MTT and FCM methods. The enzymatic activity of the product of PNP gene was determined by HPLC method. The cytotoxic effects of MeP-dR on HepG2/PNP cells were obvious (IC50 =4.5 μmol/L) and all HepG2/PNP cells were killed 4 days after the treatment with 100μmol/L MeP-dR. In mixed cultures containing increasing percentages of HepG2/PNP cells, total population killing was demonstrated when HepG2/PNP cells accounted for as few as 5 % of all HepG2 cells 8 days after the treatment with 100μmol MeP-dR. Highpressure liquid chromatography (HPLC) demonstrated that the PNP enzyme could convert MePdR into 6-MP. PNP/MeP-dR suicide gene system had an advantage over traditional suicide gene systems for hepatoma gene therapy. Our e results suggest that high-level bystander effects of this system result in significant anti-tumor responses to hepatoma gene therapy, especially in vivo.     

FHIT基因过表达对人胃癌细胞系MKN-45增殖和粘附的影响

目的探讨FHIT基因过表达对人胃癌细胞系MKN-45增殖和粘附能力的影响。方法将载有人外源性FHIT基因的真核表达质粒pcDNA3.1-FHIT转染FHIT基因mRNA阴性表达人胃癌细胞系MKN-45,分别用MTT法、平板克隆形成实验、黏附实验检测转染前后细胞增殖活性、克隆形成能力及粘附能力的变化。结果FHIT基因的过表达可降低MKN-45细胞的增殖和克隆形成能力(P<0.05),但是对MKN-45细胞与内皮细胞的粘附能力无明显影响。结论FHIT基因过表达可抑制人胃癌细胞系MKN-45的增殖和克隆形成,对于MKN-45细胞与内皮细胞的粘附能力无明显影响。     

潜在抑癌基因TXNIP对胃癌MKN-45细胞生物学特性的影响

目的:探讨硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)基因对胃癌MKN-45细胞生物学特性的影响,阐明TXNIP与胃癌发生发展的关系。方法:将TXNIP基因插入载体pcDNA3.1构建PC-TXNIP真核表达载体,并将其转染胃癌MKN-45细胞建立稳定转染细胞系(MKN-TXNIP),利用RT-RCR法、免疫细胞化学法检测转染细胞中的TXNIP基因及细胞原位蛋白表达。每种检测实验均分为MKN-TXNIP组、MKN-PC组和MKN-45组(空白对照组)。采用生长曲线法、平板克隆形成实验法、流式细胞术和Transwell小室实验法等检测稳定表达TXNIP胃癌细胞株生长、增殖状态、细胞周期和侵袭能力等生物学特性。结果:与MKN-PC组和MKN-45组比较,MKN-TXNIP组中TXNIP基因可稳定表达。与MKN-PC组和MKN-45组比较,MKN-TXNIP组稳定表达的细胞株生长速度明显减慢(P<0.05)。平板克隆形成实验,MKN-TXNIP组细胞平均克隆形成率明显低于其他2组(P<0.05)。细胞周期检测,与MKN-45组比较,MKN-TXNIP组处于G₀/G₁期的细胞百分比明显升高(P<0.05),而处于G₂/M期的细胞百分比明显降低(P<0.05)。流式细胞术,各组细胞的凋亡率均约为2.0%,各组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。Transwell小室实验,MKN-TXNIP组MKN-45细胞穿膜率低于其他2组(P<0.05)。结论:TXNIP基因对胃癌细胞增殖、分裂及侵袭转移能力可能具有抑制作用,并可同时影响胃癌细胞的细胞周期,但其对细胞凋亡的影响作用较小。     

黄连素联合胞嘧碇脱氨酶自杀基因对直肠癌细胞的抑制作用

目的 探讨黄连素联合胞嘧碇脱氨酶自杀基因(Ad-CD)对直肠腺癌细胞的体外杀伤作用.方法 培养人直肠腺癌细胞株HR-8348细胞,将重组腺病毒自杀基因转染人直肠癌细胞株HR-8348后,用四甲基偶氮唑盐(MTT法)检测黄连素联合Ad-CD基因对HR-8348细胞存活率的影响.结果 构建pcDNA3.1( )-CD真核表达载体成功,CD基因序列分析表明:重组子pcDNA3.1( )-CD含有完整的CD基因.RT-PCR表明CD基因在HR-8348细胞中表达,成功筛选出稳定表达CD基因的HR-8348细胞.HR-8348-CD细胞对浓度为100μg/ml以上的5-FC敏感,随着药物浓度升高和作用时间的延长,杀伤作用增强,但在250μg/ml以上浓度变化时,细胞杀伤率变化不大.分别以0.1、0.3、3.0、30.0μm浓度的黄连素联合5-FC对直肠癌细胞作用,细胞抑制作用随黄连素浓度升高而上升,但3.0、30μm浓度作用变化不大.在250μg/ml 5-FC浓度下,0.1、0.3、3.0、30.0μm浓度的黄连素联合5-FC对直肠癌细胞生长抑制率分别为:27.7%、42.4%、52.3%、56.3%.结论 黄连素联合5-Fc作用HR-8348-CD细胞能够增强对直肠癌细胞的抑制作用.     

AdKDR-CDglyTK融合基因系统对胃癌MGC-803细胞体的外杀伤作用

目的探讨腺病毒介导血管内皮生长因子第二受体,亦即酪氨酸激酶受体(kinase domain-containing receptor,KDR) 启动子驱动的CDglyTK融合基因体系对人胃癌细胞株MGC-803的杀伤作用。方法将质粒pAdEasy-KDR-CDglyTK 在293细胞内包装、扩增后,体外感染表达KDR的MGC-803细胞株,并给予不同浓度的前药5-FC和／或更昔洛韦,观察该体系对MGC-803细胞株的杀伤效应及其旁观者效应;并以流式细胞仪检测细胞周期的变化,电镜观察细胞的病变。结果所得病毒滴度为2．0×1012pfu／ml。MGC-803细胞株感染率随腺病毒滴度的递增而增加。融合基因的疗效优于任一单自杀基因(P<0．001)。将感染腺病毒的细胞与未感染细胞以不同比例混合培养,观察到该体系明显的旁观者效应。流式细胞术检测表明该体系抑制MGC-803细胞DNA的合成,表现为G1期细胞比率增多及S期细胞减少(P<0．001)。同时,电镜下可见MGC-803细胞有凋亡和坏死改变。结论腺病毒介导KDR启动子驱动的CDglyTK融合基因体系可以有效地杀伤人胃癌细胞。     

pEGFP—AFP—TK真核表达载体的构建及其抗肝癌细胞效应

目的 构建AFP启动子介导的HSV／TK重组真核表达载体,并研究其荷瘤效应。方法PCR扩增AFP基因启动子、HSV—TK基因,将上述片断插入EGFP—N1载体的多克隆位点,从而构建甲胎蛋白启动子调控下HSV—TK基因重组表达载体pEGFP—AFP—TK。将其注射移植性H22肝癌模型C57BL／6J小鼠,并设转染空质粒pcDNA3．1组,观察两组的抗肿瘤效应。结果肝癌特异性真核表达载体pEGFP—AFP—TK构建成功,该真核表达载体免疫荷瘤小鼠后,pEGFP—AFP—TK组肿瘤细胞生长受到抑制,且该组生存期长于pcDNA3．1组（P〈0．05）。结论在受试动物体内可有效的诱导特异性抗肿瘤免疫应答。     

人硫氧还蛋白-1基因克隆及其重组载体的构建与鉴定

目的 克隆人硫氧还蛋白-1（human thioredoxin-1, hTrx1）基因,并构建含有该目的基因的重组载体。方法 以人胃癌细胞系BCG823、MNK45的总RNA为模板,设计含有酶切位点的特异性引物,用逆转录PCR的方法,扩增hTrx1编码蛋白的cDNA片段,连接至EZ-T载体,形成EZ-T-hTrx1。对EZ-T-hTrx1进行双酶切后将目的片段连接至pcDNA3.1myc-His,形成pcDNA3.1myc-His-hTrx1,并进行双酶切、测序鉴定。结果 双酶切鉴定显示hTrx1 cDNA成功连入pcDNA3.1myc-His质粒;测序结果显示目的片段连入质粒,且与GenBank（NM003329）完全一致。该实验成功构建出含hTrx1的重组载体pcDNA3.1myc-His-hTrx1。结论 hTrx1基因的克隆以及重组载体pcDNA3.1myc-His-hTrx1的成功构建,为进一步探讨hTrx1的生物学活性及其对肿瘤发生的作用机制奠定了基础。     

干扰CTPS基因促进川楝素诱导的人胃癌MKN-45细胞凋亡

目的 探讨干扰CTPS基因对川楝素诱导的胃癌MKN-45细胞凋亡的影响。方法 通过生物信息学分析CTPS基因在人胃癌组织中的表达情况以及CTPS基因高表达的胃癌患者的总生存期。以人胃癌MKN-45细胞为实验材料,构建CTPS基因干扰载体,转染MKN-45细胞48 h后,采用qRT-PCR和Western blot检测CTPS基因mRNA和蛋白表达情况。用80 nmol/L的川楝素处理干扰CTPS基因的MKN-45细胞48 h,使用MTT实验法检测细胞存活率,激光共聚焦显微镜观察细胞形态,免疫荧光法检测γH2AX的表达。结果 生物信息学分析发现CTPS在人胃癌组织中高表达,CTPS基因高表达的胃癌患者总生存期短。向MKN-45细胞中分别转染Sh-ctrl空载体和Sh-CTPS干扰载体,qRT-PCR和Western blot检测显示,与转染Sh-ctrl空载体相比,转 染Sh-CTPS干扰载体的MKN-45细胞中CTPS mRNA和蛋白表达均降低,其中转染ShCTPS-3干扰效果最显著,分别降低了85.21%和53%（P<0.001）。检测细胞存活率及形态变化显示,与Sh-ctrl组相比,ShCTPS-3组细胞存活率降低（P<0.01）,细胞皱缩,形态不规则,呈现凋亡特征,细胞凋亡率升高（P<0.05）;在此基础上用80 nmol/L的川楝素处理转染Sh-ctrl和ShCTPS-3的MKN-45细胞48 h,与Sh-ctrl+川楝素组相比,ShCTPS-3+川楝素组细胞存活率降低（P<0.001）,细胞出现凋亡小体,细胞凋亡率升高（P<0.05）。结论 干扰CTPS基因促进川楝素诱导的胃癌MKN-45细胞凋亡。