新世纪医学分子生物学的历史使命

目的 分离、克隆人泛素结合酶基因,并初步研究组织表达谱。方法 根据与鼠泛素结合酶有较高一致性的人表达序列标签（ＥＳＴ）设计筛库引物。筛选人胎脑ｃＤＮＡ文库,采用生物信息学方法分析筛选到的阳性克隆;设计探针,应用人多组织杂交膜分析该基因的组织表达谱。结果 从文库中筛选到两个互为剪接异构体的长度分别为１ ４７１和１ ３１５ｂｐ的ｃＤＮＡ克隆,其开放读码框分别编码１４７和１０９个氨基酸,与鼠、果蝇、线虫     

人染色体8p11.2亚带ANK1位点附近区域表达序列的分离与克隆

目的分离人染色体８ｐ１１．２亚带ＡＮＫ１位点附近区域基因的表达序列。方法采用ｃＤＮＡ选择法从定位于该区域的人工酵母染色体（ＹＡＣ）中分离基因的表达序列，并从分离的表达序列中选取１个序列用于筛选人胎脑ｃＤＮＡ文库。结果获得７个表达序列，其中５个可与目的ＹＡＣ反杂交。所得的表达序列ＢＨＬＣ１５２与鼠的ＣＡｒＧ盒结合因子基因高度同源，ＢＨＬＣ７４与编码心室肌肌球蛋白的碱性轻链１（ＭＬＣ１）基因高度同源，表明ＢＨＬＣ７４可能编码一种ＭＬＣ１的同工蛋白。分离的其它表达序列与数据库内一些位置和功能尚不清楚的表达序列标签（ｅｘｐｒｅｓｅｄｓｅ－ｑｕｅｎｃｅｔａｇ，ＥＳＴ）仅有部分同源性。用表达序列ＢＨＬＣ１１９筛选人胎脑ｃＤＮＡ文库，获得１个插入片段长１９５１ｂｐ的克隆，序列分析表明它编码１７４个氨基酸，该序列与所有已知的蛋白质序列无同源性。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹分析结果显示，在人胎脑总ＲＮＡ中呈现１条约３．５ｋｂ带；组织表达分析表明，此系一广泛表达的基因。结论ＢＨＬＣ７４可能作为与８ｐ相关的心脏病候选基因，其它序列至少可以作为定位在ＡＮＫ１位点附近区域的肿瘤抑制基因的初筛基因。     

免疫筛选日本血吸虫成虫cDNA文库基因的亚克隆与鉴定

目的 亚克隆免疫筛选日本血吸虫ｃＤＮＡ文库得到的基因。方法 在体外将血吸虫ｃＤＮＡ文库基因的ＰＣＲ产物和ｐＧＥＭ－Ｔ载体连接,转染大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ,经抗生素及呈色底物Ｘ－ｇａｌ粗筛,再用限制性内切酶及ＰＣＲ方法进一步鉴定。结果 成功地将文库中４个大小不同的日本血吸虫基因片段连接到载体中,获得４个重组子。结论 为可能编码保护性抗原的血吸虫基因测序和将其亚克隆入真核表达质粒奠定基础。     

国人 ICA69 基因 cDNA 的克隆及序列分析

目的：克隆国人胰岛细胞自身抗原６９ｋＤ蛋白基因（ｈｉＩＣＡ６９）并经序列分析予以确证。方法：采用聚合酶链式反应技术,从中国人胰岛细胞瘤ｃＤＮＡ文库中扩增出ｈｉＩＣＡ６９编码序列ｃＤＮＡ,将基因片段插入ｐＳＰＯＲＴ１质粒,进一步亚克隆到ｐＵＣ１８载体中,经蓝白斑和限帛性酶谱分析得以初步筛选后,双脱氧末端终止法对其全部核苷酸序列予以确定。结果：证实了ｈｉＩＣＡ６９基因全长为１４４９ｂｐ、编码４８３个氨     

以PAC和BAC克隆为探针筛选cDNA文库

目的 建立噬菌体Ｐ１衍生的人工染色体（ＰＡＣ）和细菌人工染色体（ＢＡＣ）筛选人正常肝ｃＤＮＡ文库的方法,并期望分离到与肝癌相关的新基因。方法 用位于１７ｐ１３．３肝癌杂合性缺失区内的ＰＡＣ５７９和ＢＡＣ１５２９克隆为探针,以噬菌斑杂交筛选人正常肝ｃＤＮＡ文库,并对分离出的ｃＤＮＡ阳性克隆进行部分测序和计算机序列比较及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析,进一步确定可能与肝癌相关的新基因。结果 以ＰＡＣ５７９为     

人树突状细胞cDNA质粒文库的构建及其大规模随机测序体系的建立

建立人树突状细胞（ＤＣ）的ｃＤＮＡ文库,通过大规模随机测序克隆免疫新分子。方法：来源于正常人外周血的单核细胞,体外经ＧＭ－ＣＳＦ和ＩＬ－４培养,扩增出高纯度的ＤＣ,抽取纯化ｍ ＲＮＡ,转录成ｃＤＮＡ,定向插入ｐＳＰＯＲＴ２．０载体,建立人ＤＣ的ｃＤＮＡ 质粒文库;用ＡＢＩ３７７全自动测序仪对该文库进行同源性比较,筛选出代表未知基因ＥＳＴ,然后在ＧＣＧ 软件中进行分析,对重要的未知ＥＳＴ克隆其全长ｃＤＮＡ。结果：所扩增的ＤＣ经流式细胞仪分析高表达ＭＨＣ－Ⅰ,ＭＨＣ－Ⅱ,Ｂ７,ＣＤ１ａ 和ＣＤ８３等表面标志,能强烈刺激同种异体Ｔ淋巴细胞的体外增殖反应;建立的ＤＣｃＤＮＡ 文库９２％ 以上克隆有平均１．６ ｋｂ 大小的插入片段;从所测的１２ ０００余条ＥＳＴ中筛选出代表未知基因的３ ０００余条,克隆到１０９条全长新基因,包括属于细胞因子、细胞因子受体、趋化因子和粘附分子等家族的免疫新分子,部分全长基因已在Ｇｅｎｅｂａｎｋ 中登录。结论：成功建立了人ＤＣ的ｃＤ－ＮＡ 基因文库及其大规模随机测序体系,并克隆到免疫分子。建立人树突状细胞（ＤＣ）的ｃＤＮＡ文库,通过大规模随机测序克隆免疫新分子。方法：来源于正常人外周血的单核细胞,体     

中山医科大学博士后吴忠道发现新的日本血吸虫基因

中山医科大学基础医学博士后吴忠道在站研究发现新的日本血吸虫基因，已被ＧｅｎＢａｎＫ接受进入新序列号。吴博士在站２年间由余新炳教授指导下开展研究工作。通过对已构建的日本血吸虫（中国大陆株）成虫ｃＤＮＡ文库（ＳｊｃＤＮＡ）的免疫学筛选分离和鉴定血吸虫重组抗原ｃＤＮＡ克隆，应用对再感染具有抵抗力的个体混合血清，从ＳｊｃＤＮＡ文库中筛选到５个日本血吸虫抗原基因（ｃＤＮＡ）克隆，１个为ＳｊＧＳＴ基因克隆，另４个为日本血吸虫未知基因重组克隆，其ＥＳＴ序列均已被ＧｅｎＢａｎＫ接受并获得进入新序列号，经初步的免…     

饰胶蛋白（Decorin）基因的cDNA克隆与表达

目的 通过基因克隆技术获得饰胶蛋白基因ｃＤＮＡ克隆并表达。为研究饰胶蛋白的生物学功能及应用打基础。方法 应用ＰＣＲ技术从Ｔ细胞ｃＤＮＡ文库获得饰胶蛋白全长基因ｃＤＮＡ片段。并克隆到ｐＵＣ１９载体中,采用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧末端终止法测定全部ｃＤＮＡ序列,将测序正确的饰胶蛋白ｃＤＮＡ序列插入ｐＧＥＸ－４Ｔ－１表达载体中,经ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ双酶切后１．２％凝胶电泳鉴定,ＩＰＴＧ诱导表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。结果 克隆的饰胶蛋白ｃＤＮＡ序列与ＧｅｎＢａｎｋ中ＡＦ１３８３００记载的序列完全一致,所表达的融合蛋白质分子量与理论计算值（６５．６ＫＤ）也一致并为可溶性蛋白。结论 本研究成功地克隆了饰胶蛋白基因和表达了ＧＳＴ－Ｄｅｃｏｒｉｎ融合蛋白。     

用差别显示法寻找细胞凋亡的相关基因

目的 寻找参与细胞凋亡的相关基因。方法 天花粉蛋白诱导Ｕ９３７细胞凋亡后,用锚定引物和随机引物进行差别显示ＰＣＲ,回收差异条带,进行ＲＮＡ点杂交。用细胞凋亡时高表达的差异片段筛选胎肝ｃＤＮＡ库,阳性克隆测序,并与凋亡细胞ＲＮＡ行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交。结果 用细胞凋亡时高表达的差异片段筛选胎肝ｃＤＮＡ文库,获得一个１．４ｋｂ的ｃＤＮＡ克隆,该ｃＤＮＡ序列中部分碱基与人Ｂｒｕｔｏｎ酪氨酸激酶高度同源。     

人胃癌组织基因组文库中异常高表达基因及c－myc阳性克隆的筛选

目的：为了研究人胃癌组织中癌基因及其调控序列是否存在结构上的改变，首先需要分离并获得所需研究的基因．方法：用人胃癌异常高表达基因ｃＤＮＡ片段（ｈＳＣＧ－３）和ｃ－ｍｙｃ基因为探针，经同位素标记，对所构建的人胃癌组织基因组文库进行二轮噬菌斑原位杂交筛选．结果：从该基因组文库中分别筛选得到２个和６个阳性克隆．结论：为进一步探讨胃癌发生的机理，以及对这二个基因进行亚克隆和序列分析奠定了基础．     

人M961全长cDNA及剪接异构体的分离与克隆

目的分离、克隆人M96基因,并初步探索其在不同血细胞系中的表达。方法根据与鼠M96基因有较高同源性的人表达序列标签(EST)设计筛库引物,筛选成人睾丸及胎脑cDNA文库,采用BLAST及CLUSTALW等程序比较分析筛选到的阳性克隆;应用多细胞系杂交膜分析该基因在各细胞系的表达;用氯化血红素诱导K562细胞向红系分化,探讨该基因在此过程中的表达变化。结果从文库中筛出长度分别为1878和1382bp的M96cDNA克隆,二者为剪接异构体,其开放阅读框分别编码491及262个氨基酸,分别命名为M961和M962(GenBank接受号分别为AF072814和AF073293)。Northern杂交结果表明,在所检测的10种血细胞系中,人淋巴细胞白血病细胞系CEM的M961基因表达量最高,在有巨核及红系特点的Hel、Dami及K562白血病细胞系中M961的表达量也较高。在K562细胞分化过程中,M961基因表达略有升高。结论M961基因在某些白血病细胞系中表达量较高。     

人肿瘤坏死因子样蛋白全长cDNA的克隆及原核表达

目的分离、克隆编码人肿瘤坏死因子样蛋白(TNFLP)的全长cDNA,并对其功能进行初步研究。方法从本室构建的λZAP表达胎脑文库中分离到编码TNFLP的全长cDNA。应用多种软件对该基因及其编码蛋白进行分析,寻找其同源蛋白,分析其亲、疏水性及其存在的结构域和基序。以Northern印迹分析检测TNFLP的mRNA的组织分布,并用谷胱苷肽-S-转移酶(GST)原核表达系统分段表达TNFLP的N端和C端蛋白。结果TNFLP全长共2112bp,编码一208个氨基酸的蛋白。亲、疏水性分析显示,TNFLP有两个疏水区,且C端95个氨基酸与小鼠的TNF-α一致性为42%。基序分析显示,TNFLP的C端有一内质网膜定位信号-TYKRL,与TNF-α完全一致。人的TNFLP位于人的16号染色体上。Northern杂交显示,TNFLP在心、脑和胰腺中呈高表达,可见一个转录本。用GST原核表达系统,分段表达了TNFLP的N端和C端。结论初步分析了TNFLP的组织表达谱,并分段表达了其N端和C端,为进一步研究其功能提供了条件。     

肝癌内高表达新基因的部分cDNA克隆

目的寻找人肝癌相关的基因。方法应用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交技术，对表达序列标记（ＥｘｐｒｅｓｓｅｄＳｅ－ｑｕｅｎｃｅｔａｇｓ，ＥＳＴ）基因克隆进行筛选，以得到的基因片段为探针，筛选人胎肝ｃＤＮＡ文库。结果得到一个在肝癌内高表达的ＥＳＴ基因片段。进一步筛选人胎肝ｃＤＮＡ文库，得到一命名为ＦＬ６的ｃＤ－ＮＡ克隆，核苷酸序列测定表明，ＦＬ６长度为１４６４个碱基，检索最新版本ＧｅｎｅＤａｔａｂａｓｅｓ（ＥＭＢＬ９６．６），未发现同源基因。实验结果还显示该基因在胎儿各组织内有不同的表达特性。结论该基因可能与细胞的增殖、癌变过程相关。     

A novel full-length gene of human ribosomal protein L14.22 related to human glioma

Background This study was undertaken to obtain differentially expressed genes related to human glioma by cDNA microarray and the characterization of a novel full-length gene. Methods Total RNA was extracted from human glioma and normal brain tissues, and mRNA was used as a probe. The results of hybridization procedure were scanned with the computer system. The gene named 507E08 clone was subsequently analyzed by northern blot, bioinformatic approach, and protein expression. Results Fifteen differentially expressed genes were obtained from human glioma by hybridization and scanning for four times. Northern blot analysis confirmed that the 507E08 clone was low expressed in human brain tissue and over expressed in human glioma tissues. The analysis of BLASTn and BLASTx showed that the 507E08 clone was a novel full-length gene, which codes 203 amino acid of protein and is called human ribosomal protein 14.22 gene. The nucleotide sequence had been submitted to the GenBank?with the accession number of AF329277. After expression in E.coli., protein yielded a major band of apparent molecular mass 22 kDa on an SDS-PAGE gel. Conclusions cDNA microarray technology can be successfully used to identify differentially expressed genes. The novel full-length gene of human ribosomal protein 14.22 may be correlated with the development of human glioma.     

Suppression subtractive hybridization for identifying differentially expressed genes in renal cell carcinoma

Objective To construct a renal cell carcinoma (RCC) cDNA subtractive library using suppres sion subtractive hybridization.Methods Polyadenylated RNA ［Poly (A)(+) RNA］ was isolated from tissues of RCC and norm al kidney, and single- strand cDNAs and double-strand cDNAs were synthesized in turn. RCC cDNAs were divided into two groups and ligated to the specific adaptors l and 2, and then h ybridized with normal kidney cDNA twice with two rounds of suppression PCR. Sec ond round PCR products were cloned to T/A plasmid vectors to set up the subtract ive library. One hundred clones were randomly picked to perform enzyme digest a nalysis, and some underwent sequence analysis and Northern blot to identify RCC specifically expressed genes. SMART RACE procedure was operated to clone full l ength novel RCC specifically expressed genes.Results A human RCC subtractive library with high subtractive efficiency was successfull y set up. The amplified library contains 350 positive clones. Random analysis of 100 clones with enzyme restriction showed that 85 plasmids in the clones cont ained 50-400 bp inserts. Sequence analysis was performed for 10 clones. All t he 10 sequences were unknown before and derived from 6 unique, novel genes among which the cDNA insert RCC18 had five copies. Northern blot analysis showed tha t RCC18 cDNA was highly expressed in RCC, but no signal could be detected in nor mal kidney. Using SMART RACE technique, we obtained the full length of the nove l gene RCC18.Conclusions The constructed cDNA subtractive library of human RCC is a highly efficient one and lays a solid foundation for large scale screening and cloning new and speci fic oncogenes or tumor suppressor genes of RCC. The novel specifically expresse d genes provided an important clue for studying the mechanisms of occurrence and development of RCC.     

人胃癌相关蛋白VRG107基因的扩增及组织表达初步研究

以正常人肝脏cDNA文库为模板,采用PCR方法扩增出编码胃癌相关蛋白VRG107基因片段,应用半定量RT-PCR和Northern印迹分析研究它在人体组织中表达的分布。结果表明VRG107基因编码区为297 bp,与文献报道完全相同。该基因在肝、胃、结肠、肾、乳腺等多种组织(包括肿瘤组织)中均有不同程度的表达。在肝癌组织中表达量明显少于癌旁组织(P<0.01),而在结肠癌组织中表达也少于癌旁组织。提示VRG107基因是一个组织分布广泛的基因,在部分肿瘤组织中表达量明显减少。