NGAL基因cDNA的克隆及其表达载体的构建

目的：克隆NGAL基因的cDNA,并构建其表达载体。方法：应用RT－PCR技术,从食管癌细胞系SHEEC中扩增出NGAL（neutrophil gelatinase-associated lipocalin)基因的cDNA,并重组到中间载体pT-Adv中,经测序和与NCBI数据库比较证实是NGAL基因的全编序列。然后把它分别插入到真核表达载体pcDNA3和原核表达载体pGEX-4T-3中。结果：获得了NGAL基因的cDNA全序列,构建了NGAL的正、反向真核表达载体pcDNA-NGAL( /-)和原核表达载体pGEX－NGAL,并在大肠埃希菌TOP10F′中成功地表达出NGAL融合蛋白。结论：为研究NGAL基因的新功能和制备其抗体,进而阐明NGAL在食管癌等肿瘤中的生物学作用提供了有利工具。     

NGAL基因cDNA的克隆及其表达载体的构建

目的 :克隆NGAL基因的cDNA ,并构建其表达载体。方法 :应用RT PCR技术 ,从食管癌细胞系SHEEC中扩增出NGAL(neutrophilgelatinase associatedlipocalin)基因的cDNA ,并重组到中间载体pT Adv中 ,经测序和与NCBI数据库比较证实是NGAL基因的全编序列。然后把它分别插入到真核表达载体pcDNA 3和原核表达载体pGEX 4T 3中。结果 :获得了NGAL基因的cDNA全序列 ,构建了NGAL的正、反向真核表达载体pcDNA NGAL( - )和原核表达载体pGEX NGAL ,并在大肠埃希菌TOP10F′中成功地表达出NGAL融合蛋白。结论 :为研究NGAL基因的新功能和制备其抗体 ,进而阐明NGAL在食管癌等肿瘤中的生物学作用提供了有利工具。     

成骨肉瘤细胞SOSP-9607中miRNA的克隆与验证

背景与目的:microRNA(miRNA)是一类非编码蛋白,并参与转录后调节的单链小分子RNA(约20～25个碱基),对基因表达具有重要调控作用,与肿瘤的发生存在着密切的关系.本研究拟克隆成骨肉瘤细胞系SOSP-9607中miRNA,并对部分功能性基因进行验证.方法:以SOSP-9607细胞作为实验对象,分离提取细胞内小片段RNA(≤200 nt),多聚腺苷酸化和5'连接子连接后,通过RT-PCR进行反转录和扩增,克隆到pCR 4-TOPO载体上得到大约109 bp DNA片段,测序后经过生物信息学分析确定miRNA的表达情况.根据当前miRNA的研究现状,在克隆到的miRNA中选取部分功能性miRNA和新发现miRNA,合成相应探针后与从SOSP-9607细胞、HeLa细胞和成骨肉瘤组织中分离出的小片段RNA进行Northern印迹验证.结果:克隆测序后得到182个克隆体,经生物信息学分析发现有47个miRNA(25种),其中含有23种已知的miRNA和2种Nature杂志上预测的miRNA(miR-165和miR-166).选取的三条实体瘤相关的miRNA(miR-21、miR-20a、miR-17-5p)以及两条预测的miRNA进行Northern印迹验证,miR-21、miR-20a、miR-17-5p在SOSP-9607细胞和成骨肉瘤组织中均表达,预测的miR-165和miR-166在SOSP-9607细胞和成骨肉瘤组织中亦均表达,但miR-166在HeLa细胞中没有表达.结论:克隆了SOSP-9607细胞中的miRNA,并验证了部分功能性miRNA的表达,提示miRNA与肿瘤发生可能有密切的关系.     

tBid基因的表达及其对骨肉瘤SOSP-9607细胞的促凋亡作用

目的:观察tBid基因在骨肉瘤细胞中的表达及其对转染的SOSP-9607细胞的凋亡作用。方法:采用脂质体转染的方法,将tBid基因转染骨肉瘤细胞,间接免疫荧光法检测目的蛋白的表达和细胞形态学变化,进一步电镜观察其超微结构改变。MTT法检测目的基因转染后细胞的增殖情况,通过Annexin V、染色流式细胞仪检测来观察其促凋亡作用。结果:转染SOSP-9607细胞后,间接免疫荧光染色检测tBid的表达,细胞出现凋亡。电镜观察呈现出典型的凋亡特征。MTT实验发现细胞的增殖被明显抑制。Annexin V染色流式细胞仪检测可见明显的凋亡细胞,与对照组细胞(凋亡率为6%)相比,其凋亡率为35.8%。结论:tBid基因可以在转染的SOSP-9607细胞中表达,并可抑制转染细胞的生长,诱导细胞发生凋亡。     

tBid基因的表达及其对骨肉瘤SOSP-9607细胞的促凋亡作用

目的：观察tBid基因在骨肉瘤细胞中的表达及其对转染的SOSP-9607细胞的凋亡作用。方法：采用脂质体转染的方法,将tBid基因转染骨肉瘤细胞,间接免疫荧光法检测目的蛋白的表达和细胞形态学变化,进一步电镜观察其超微结构改变。MTT法检测目的基因转染后细胞的增殖情况,通过Annexin V、染色流式细胞仪检测来观察其促凋亡作用。结果：转染SOSP-9607细胞后,间接免疫荧光染色检测tBid的表达,细胞出现凋亡。电镜观察呈现出典型的凋亡特征。MTT实验发现细胞的增殖被明显抑制。Annexin V染色流式细胞仪检测可见明显的凋亡细胞,与对照组细胞（凋亡率为6%）相比,其凋亡率为35.8%。结论：tBid基因可以在转染的SOSP-9607细胞中表达,并可抑制转染细胞的生长,诱导细胞发生凋亡。     

COPS3基因cDNA的克隆及表达

目的:克隆COPS3基因cDNA,构建其原核融合蛋白表达载体并表达和鉴定。方法:从培养的人骨肉瘤细胞系SOSP-9607细胞中提取总RNA,经RT-PCR获得COPS3基因。将该基因克隆到pGEM-T-Easy载体中,酶切及测序鉴定。将COPS3基因插入pET28 a融合蛋白表达载体中,IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE分析。免疫印迹法鉴定COPS3蛋白的表达。结果:cDNA测序证明,获得了COPS3基因cDNA,其序列与Genebank中报道序列完全一致。酶切分析表明,成功构建了含COPS3基因的pET28 a融合蛋白表达载体。SDS-PAGE以及免疫印迹法鉴定分析表明,COPS3蛋白获得高效表达,分子质量为51Ku,表达量约占菌体总蛋白的30%。结论:成功克隆和表达了COPS3 cDNA。     

COPS3基因cDNA的克隆及表达

目的：克隆COPS3基因cDNA,构建其原核融合蛋白表达载体并表达和鉴定。方法：从培养的人骨肉瘤细胞系SOSP-9607细胞中提取总RNA,经RT-PCR获得COPS3基因。将该基因克隆到pGEM-T-Easy载体中,酶切及测序鉴定。将COPS3基因插入pET28a融合蛋白表达载体中,IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE分析。免疫印迹法鉴定COPS3蛋白的表达。结果：cDNA测序证明,获得了COPS3基因cDNA,其序列与Genebank中报道序列完全一致。酶切分析表明,成功构建了含COPS3基因的pET28a融合蛋白表达载体。SDS-PAGE以及免疫印迹法鉴定分析表明,COPS3蛋白获得高效表达,分子质量为51Ku,表达量约占菌体总蛋白的30%。结论：成功克隆和表达了COPS3 cDNA。     

pEGFP-BLCAP真核表达载体的构建和鉴定

目的：构建真核表达载体pEGFP—BLCAP并转染骨肉瘤细胞SOSP—M。方法：从培养的人骨肉瘤细胞系SOSP—M细胞中提取总RNA，经RT—PCR获得BLCAP基因的cDNA，测序正确后插入真核表达载体pEGFP—C2中。构建的重组质粒经脂质体介导转染SOSP—M细胞，经观察荧光蛋白表达和Western blot鉴定目的蛋白在转染后的SOSP—M细胞中的表达情况。结果：RT—PCR成功地扩增出一条约280bp的片段，经限制性内切酶分析和DNA序列测定证实目的基因cDNA已插入重组质粒；荧光显微镜下观察到转染后的SOSP—M细胞发出较强绿色荧光，Western blot证明BLCAP能以融合蛋白的形式在SOSP—M细胞中获得表达。结论：构建了真核表达载体pEGFP—BLCAP并成功表达目的蛋白。     

大鼠肝癌高表达基因cDNA序列的克隆

目的克隆出大鼠肝癌高表达EST片段相关基因的cDNA完整表达序列,为进一步揭示其生物学功能奠定基础。方法通过基因芯片检测出DEN诱发的大鼠肝癌高表达的EST片段;其中部分高表达的EST片段,采用电子克隆与PCR相结合的方法,克隆出其cDNA完整表达序列。结果与正常大鼠肝组织比较,肝癌组织中明显高表达的EST片段有34个。采用EST电子克隆技术与PCR技术相结合的方法,成功克隆出4个EST片段的cDNA序列,经进一步BLAST对比分析,证明G15、G20、G36、G40等4个基因为新基因,并进行GenBank登录,登录号分别为DQ480746、DQ480747、DQ480744、DQ912022。结论利用大鼠基因芯片高通量地筛选出DEN诱发的肝癌组织高表达的有关基因,并在充分利用生物信息学资源的基础上,成功克隆出4个新基因的cDNA序列,为今后进一步深入观察这些基因的功能及其在肝癌发生、发展过程中的作用机制打下良好的研究基础。     

重组超抗原葡萄球菌肠毒素A基因的克隆及表达载体的构建

目的　克隆金黄色葡萄球菌肠毒素 A(SEA)全长基因并构建其表达载体。方法　以金黄色葡萄球菌的基因组 DNA为模板 ,用两条针对 SEA全长基因特异的引物 ,通过 PCR方法克隆 SEA全长基因 ,PCR产物与p GEM- T载体连接 ,经测序证实后进行亚克隆 ,构建其表达载体 p ET- 2 8b- SEA,再次测序验证。结果　克隆了 SEA全长基因 ,编码 2 5 7个氨基酸残基 ,经测序证实与 Genbank中收录的 SEA基因序列完全一致 ;并构建了 SEA的表达载体。结论　成功克隆了 SEA全长基因并构建了其表达载体 ,为进一步研究 SEA的融合蛋白的抗肿瘤活性奠定了基础     

FasL基因siRNA表达载体的构建及其在肺癌A549细胞中的表达

背景与目的Fas/FasL是肿瘤坏死因子超家族成员,与肿瘤细胞的凋亡有关。激活的淋巴细胞由于FasL表达上调对于Fas/FasL凋亡途径非常敏感,从而可能被肿瘤细胞反杀伤攻击,使激活的淋巴细胞被清除掉。为研究FasL基因的功能及肺癌的基因治疗,构建了针对FasL基因的siRNA的表达载体,观察转染细胞A549后其对激活的T淋巴细胞的反杀伤作用。方法利用网站选择适当位点设计并合成针对FasL基因mRNA的寡核苷酸序列,插入质粒pGCsi-U6中形成重组载体pSi-FasL。重组载体经测序鉴定后转染肺癌细胞A549,Western blot检测转染前后FasL蛋白的表达情况。结果测序结果与所合成的寡核苷酸完全一致,证实成功构建了针对FasL基因的siRNA表达载体。Western blot检测显示转染肺癌细胞A549后有效抑制了FasL基因的表达。结论针对FasL基因的siRNA表达载体成功构建,并能有效的抑制肺癌细胞A549中FasL基因的表达。     

Survivin基因siRNA真核表达载体的构建及其对转染膀胱癌细胞Survivin表达的抑制作用

目的构建针对Survivin基因的siRNA(smallinterferenceRNA)真核表达载体,并观察其对转染的膀胱癌细胞中Survivin基因表达和细胞凋亡的影响。方法应用siRNA设计软件设计针对Survivin基因的特异性短链寡核甘酸,化学合成后经退火形成双链siRNA模板,通过克隆到质粒pSilencer1.0-U6构建siRNA真核表达载体并用酶切和测序鉴定;然后将其转染人膀胱癌细胞株BIU-87,以反义Survivin寡核甘酸(ASODN)抑制效果为对照,分别采用噻唑蓝(MTT)比色法和DNA原位末端标记(TUNEL)法检测BIU-87细胞生长抑制率(IR)和凋亡指数(AI),半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Westernblot检测BIU-87细胞中SurvivinmRNA及其蛋白的表达。结果酶切和测序证实siRNA真核表达载体构建成功。siRNA对BIU-87细胞的IR和AI(62.14%和33.77%)均分别显著高于ASODN(39.33%和23.98%)和空白对照组(1.98%和3.75%),P均<0.05,SurvivinmRNA及其蛋白相对表达水平均显著低于ASODN和空白对照组。结论构建的siRNA真核表达载体能有效地抑制Sur-vivinmRNA的转录和表达,诱导BIU-87细胞凋亡和抑制细胞生长,为膀胱肿瘤的基因治疗提供新的方法和手段。     

胃癌相关基因GCRG213小干扰RNA表达载体的构建及其对胃癌细胞的影响

目的探讨胃癌相关基因GCRG213小干扰RNA(siRNA)转染对胃癌细胞MKN45的影响。方法设计两对针对GCRG213可转录为siRNA的DNA片段,退火后插入siRNA表达载体IMG-800。测序正确的重组子IMG-800-1(含干扰片段1)、IMG-800-2(含干扰片段2)和空载体经脂质体转染人胃癌细胞系MKN45细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株。采用半定量RT-PCR及Western免疫印迹法,比较转染不同质粒的MKN45细胞中GCRG213在mRNA和蛋白质水平上的表达差异。选取稳定转染不同质粒的MKN45细胞,采用细胞计数法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪分析细胞的增殖状态,Annexin V FITC/PI双标记法检测凋亡细胞,平板克隆形成实验、裸鼠移植瘤实验分析转染细胞成瘤性。结果经测序证实,干扰片段退火后正确插入小干扰RNA表达载体IMG- 800,组成重组子IMG-800-1和IMG-800-2。重组子IMG-800-1、IMG-800-2和空载体经脂质体转染人胃癌细胞系MKN45细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株。与对应的空载体比较,RT-PCR结果显示,转染siRNA的MKN45细胞中,mRNA的表达分别下调44.9%和49.5%;Western印迹法结果显示,转染siRNA的MKN45细胞中,蛋白的表达分别下调55.3%和64.2%。与转染空载体的细胞相比,转染siRNA的MKN45细胞生长增殖速度明显减慢,细胞周期表现为处于G0～G1期的细胞有所增加,G2/M期和(或)S期的细胞比例减少,细胞凋亡率增加,细胞克隆形成数量减少,裸鼠体内成瘤性降低。结论胃癌相关基因GCRG213 siRNA转染,可抑制肿瘤细胞的生长和增殖,促进肿瘤细胞的凋亡,抑制肿瘤细胞的成瘤性。     

沉默CDK7对子宫内膜癌细胞顺铂敏感性的影响

  目的   研究沉默CDK7对子宫内膜癌细胞HEC-1-A顺铂化疗敏感性的影响。   方法   根据CDK7的基因序列设计合成不同的CDK7 siRNA片段并转染子宫内膜癌细胞HEC-1-A,通过实时定量PCR和Western blot验证RNA干扰的效果后,选择效果最优的CDK7 siRNA片段特异性沉默子宫内膜癌细胞中CDK7的表达,采用MTT细胞毒性实验、流式细胞仪及Hochest/PI双染色荧光显微镜技术检测转染前后该细胞系对化疗药物顺铂敏感性的变化。   结果   共选择了4个位点设计CDK7 siRNA并成功转染子宫内膜癌细胞系HEC-1-A,实时定量PCR及Western blot验证了各组的干扰作用,证实CDK7-423干扰效果最强,达70%以上。选择CDK7-423转染HEC-1-A,MTT细胞毒性实验结果发现在CDK7表达被抑制后,DDP的IC₅₀由45.122 g/mL降为3.200 g/mL,细胞毒性显著增高（P < 0.05）。流式细胞仪检测结果:CDK7低表达组细胞平均凋亡率细胞为37.57%,与高表达组细胞（11.66 %）相比,凋亡率明显增加（P < 0.05）。Hochest/PI双染色荧光显微镜下可见CDK7低表达组HEC-1-A细胞与亲代细胞比较,凋亡小体明显增多。   结论   通过CDK7 siRNA转染下调子宫内膜癌细胞中CDK7的表达以后,可以明显增强子宫内膜癌细胞对DDP的化疗敏感性,使子宫内膜癌细胞凋亡增加。CDK7可作为子宫内膜癌治疗的新靶点进行更加深入的研究。      

CEA siRNA载体的构建和转染人食管癌EC9706细胞的沉默作用

Objective: To construct the small interfering RNA (siRNA) expression vector of carcino-embryonic antigen (CEA) and inhibit the expression of CEA in EC9706 cells by RNA interference. Methods: Two pairs of oligonucleotide sequences were designed and synthesized according to the encoding sequence of mRNA of CEA. The annealed oligonucleotide frag-ments were cloned into pRNAT-U6.2 expression vector and identified by sequencing. The recombinant plasmid pRNAT-U6.2-CEA was transfected into EC9706 cells. The expression of CEA in the stable transfected cells was assayed by real time PCR and Western blot. Results: DNA sequencing showed that the oligonucleotide fragments were correctly inserted into pRNAT-U6.2 vector, and CEA expression in the transfected cells was down-regulated significantly by pRNAT-U6.2-CEA at both the mRNA and protein levels. Conclusion: The siRNA expression vector of CEA is successfully constructed and inhibits CEA expression in EC9706 cells. This facilitates further studies of the function of CEA at the molecular level.     

siRNA封闭BRCAA1基因对乳腺癌细胞MCF-7增殖和Rb基因表达的影响

目的：〖HT5"SS〗 研究siRNA封闭乳腺癌抗原相关基因1(BRCAA1)对乳腺癌细胞MCF7增殖和Rb基因表达的影响。〖HT5W〗方法： 〖HT5"SS〗采用RNAi技术对乳腺癌细胞MCF7细胞BRCAA1基因进行特异性抑制,用阳离子脂质体与化学合成的Predesigned antiBRCAA1 siRNA构建转染复合体,反转染MCF7细胞株48h后提取总RNA,分为未处理(NT)组、阴性对照组、阳性对照组和BRCAA1组,经反转录荧光实时PCR检测BRCAA1和Rb基因mRNA表达情况;检测细胞增殖抑制率。〖HT5W〗结果： 〖HT5"SS〗与阴性对照组相比,siRNA转染MCF7细胞后实验组BRCAA1基因mRNA水平降低了42.3％;Rb基因表达较之阴性对照组上升了11.1％;实验组MCF7细胞增殖抑制率为（81.9±6.1）％,抑制作用明显强于对照组(P<0.05)。〖HT5W〗结论： 〖HT5"SS〗BRCAA1基因的封闭明显抑制了MCF7细胞的增殖,BRCAA1基因与Rb基因可能存在有某种相互拮抗的作用。     

存活素siRNA表达质粒的构建及其对MCF-7细胞细胞周期和增殖的调控

背景与目的：存活素特异地在肿瘤组织中过表达,许多报道表明抑制它的功能对肿瘤治疗有利。RNA干扰被证明是一项能有效而特异地抑制基因表达的新技术。本研究的目的在于构建存活素基因的小分子干扰RNA(siRNA)表达质粒,并检测该质粒在乳腺癌细胞中的生物学功能。方法：应用含有u6启动子的mu6pro载体构建存活素siRNA质粒,RT-PCR和Western blot法检测该质粒转染MCF-7细胞后存活素表达的变化,流式细胞仪和MTT法分别检测其对细胞周期和对细胞增殖的影响。结果：存活素siRNA质粒明显下调MCF-7细胞中存活素的表达,阻断细胞周期在G1期,显著抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。结论：通过RNA干扰,存活素的表达在mRNA和蛋白质水平上被下调。     

siRNA抑制人前列腺癌细胞PC3的MDM2表达及细胞增殖

 目的 研究siRNA MDM2对人前列腺癌细胞PC3的MDM2表达和细胞增殖的作用。 方法 构建PGCsilencer^TM MDM2 siRNA,并转染入PC3细胞,分别用RT-PCR和 Western blot检测siMDM2对PC3细胞MDM2基因和蛋白表达的抑制作用;用MTT法检测siMDM2对PC3增殖抑制的作用,用流式细胞术检测siMDM2对PC3细胞凋亡的影响。 结果 PT-PCR和Western blot结果显示siMDM2能显著抑制PC3细胞MDM2基因和蛋白的表达,抑制率最高可达65%;MTT和流式细胞术结果证明siMDM2能显著抑制PC3细胞增殖并诱导细胞凋亡。 结论 siMDM2能特异有效地抑制MDM2在PC3中的表达,并抑制PC3细胞增殖,促进其凋亡。     

siRNA抑制卵巢癌细胞株SKOV3 HPA基因表达的研究

目的: 〖HT5"SS〗研究siRNA对卵巢癌细胞株SKOV3中乙酰肝素酶(heparanase,HPA)基因表达的抑制作用。〖HT5W〗方法: 〖HT5"SS〗设计合成两对HPA编码基因的反向重复序列,中间间隔9个核苷酸序列,通过定向克隆至载体PGenesil1,构建siRNA真核表达载体,经稳定转染SKOV3细胞后应用RTPCR、realtime PCR及免疫组化技术检测卵巢癌细胞中HPA基因mRNA及蛋白表达水平的抑制情况。〖HT5W〗结果: 〖HT5"SS〗测序证实成功地构建了编码2条shRNA的siRNA真核表达载体。通过RTPCR、realtime PCR及免疫组化技术检测转染siRNA的SKOV3细胞,与对照组相比,HPA mRNA表达水平和蛋白表达水平明显降低。〖HT5W〗结论:〖HT5"SS〗构建的PGenesil1(+)HPA重组质粒能有效的抑制HPA基因在卵巢癌细胞株SKOV3中的表达,为研究HPA基因在肿瘤细胞中的调节途径和肿瘤的基因治疗提供了新的方法。