槲芪散阻断肝癌前病变的机制研究

目的：探讨槲芪散及其拆方阻断肝癌前病变的作用。方法：用二乙基亚硝胺（DEN）建立Soh-Farber二步大鼠肝癌前短期实验模型，用槲芪散全方（Ⅰ号方）及槲芪散拆方（Ⅱ号方）进行干预，应用流式细胞术（FCM）测定肝癌前痛变大鼠肝组织的DNA相对含量；观察肝组织病理及超微结构的变化。采用组织化学染色法检测肝癌前病变组织中γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-Pase）、三磷酸腺苷酶（ATPase）的活性。采用琼脂糖电泳法测定各组大鼠血清中乳酸脱氢酶（LDH）总活力及其同功酶、血清γ-谷氨酰转肽酶同功酶Ⅱ（γ-GT-Ⅱ）。结果：槲芪散Ⅰ号方可减少大鼠肝癌前病变部位的γ-GT灶的发生数和灶面积，血清中γ-GT-Ⅱ阳性率明显下降。DI接近于正常肝细胞；可将调节能量代谢的酶类基本维持在正常水平，ATPase与G-6-Pase增生灶呈阳性反应。结论：槲芪散具有明显阻断肝癌前病变的作用，而槲芪散拆方无此作用。     

方剂槲芪散及君药槲寄生提取物对人肝癌细胞生长的抑制作用

目的：探讨方剂槲芪散(HQS)及其君药槲寄生提取物多糖和总碱对人肝癌细胞SMMC-7721生长的抑制作用及细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)浓度的影响.方法：采用MTT法测定药物槲芪散(0.3125,0.625,1.25g/L),槲寄生多糖(0.625,1.25,2.5,5g/L)及槲寄生总碱(3,6,12g/L)作用48,72及96h对细胞(密度1×10\ 8/L)增殖的体外抑制作用；利用流式细胞仪分析细胞周期、凋亡；利用激光共聚焦显微镜测定细胞内活性氧浓度.结果：MTT结果显示HOS及槲寄生提取物有较好的抑制肿瘤细胞增殖的作用,呈现出时间.剂量依赖性,高剂量组除了HOS和槲寄生总碱48h时间点外,A值均较对照组明显降低(HOS72h：1.022±0.13 vs 1.207±0.04,P＜0.01：96h：1.235±0.20 vs 1.602±0.05,P＜0.01；槲寄生多糖48h：0.570±0.03 vs 0.744±0.01,P＜0.01；72h：0.803±0.04 vs 1.207±0.04,P＜0.01：96h：0.860±0.13 vs 1.602±0.05,P＜0.01；槲寄生总碱72h：0.919±0.14 vs 1.233±0.04,P＜0.01；96h：0.701±0.07 vs 1.819±0.04,P＜0.01).流式细胞仪检测发现,与对照组相比,经药物作用72h后,槲寄生多糖及总碱组G1期细胞比例增加(81.0%,86.9% vs 70.0%,P＜0.01),S期(5.9%,7.4% vs 13,5%,P＜0.01)和G2期(13.1%,5.7% vs 16.4%,P＜0.01)比例降低,HOS组G1期细胞比例无明显变化,S期比例降低(1.5% vs 13.5%,P＜0.01),G2期比例增加(28.2% vs 16.4%,P＜0.01)；三者均使细胞凋亡增加(HQS：14.8% vs 6.0%,P＜0.01；槲寄生多糖：11.7% vs 6.0%,P<0.01；总碱：6.7% vs 6.0%,P＜0.05).激光共聚焦显微镜检测发现,当细胞内荧光强度呈现不断升高趋势时,加入3种药物后,荧光强度瞬间下降,然后稳定在一低水平,未见明显波动.当荧光开始稳定在一基线时,加入槲寄生总碱,荧光强度陡然增强后又迅速下降到低水平,并维持一段时间,而加入HQS及槲寄生多糖未见此变化.结论：HQS、槲寄生多糖和总碱均能抑制肝癌细胞增殖并促进凋亡.     

老年大鼠心肌组织中促凋亡蛋白Omi/HtrA2的表达改变及可能意义

目的验证老年大鼠心肌细胞凋亡程度；测定老年心肌组织中内源性线粒体后凋亡调节蛋白Omi／HtrA2和XIAP的表达及其与心肌细胞凋亡的关系。方法分别选取雄性成年SD大鼠[体重（278±10）g，4-6个月]和老年SD大鼠[体重（525±8）g，22-24个月]。随机分为以下4组：正常成年组（40只）；正常老年组（40只）；老年ucf～101组（10只），腹腔注射ucf-101（1．5μmol／kg）；老年DMSO组（10只），腹腔注射DMSO（1．5μmol／kg）。采用Caspase-3活性测定法检测大鼠心肌组织中心肌细胞凋亡发生情况；用Western—blot蛋白印记法检测大鼠心肌组织中Omi／HtrA2和XIAP的表达水平。结果以成年大鼠caspase-3比活性（1．00±0．04）为1，老年大鼠的caspase-3的比活性（2．31±0．43，P〈0．01）显著增高。老年大鼠心肌组织中Omi／HtrA2表达明显增高，XIAP表达明显下降。给予特异性Omi／HtrA2的抑制剂ucf-101，可显著减少老年大鼠心肌组织caspase-3的表达。结论老年大鼠心肌组织中表达增多的Omi／HtrA2，可能导致了XIAP的降解以及随后的caspase-3活化和细胞凋亡。     

益肝消癥方对大鼠肝癌前病变肝细胞凋亡因子Bcl-2、Bax mRNA及蛋白质表达的影响

目的:观察益肝消癥方对二乙基亚硝胺诱导的大鼠肝癌前病变肝细胞凋亡因子Bcl-2、Bax mRNA及蛋白质表达的影响。方法:将40只Wistar雄性大鼠随机分为对照组10只、模型组15只和益肝消癥组15只,除对照组外,其余各组大鼠以二乙基亚硝胺腹腔注射诱导肝癌前病变模型,持续14周。第8周起,每天分别以生理盐水、益肝消癥颗粒的水溶剂给予相应组大鼠灌胃给药,第14周末给药后取材,检测大鼠0、7、14周体重,Bcl-2、Bax mRNA及蛋白质表达,观察肝脏病理情况。结果:益肝消癥方可改善肝癌前病变大鼠一般状况、肝脏病理,下调Bcl-2、Bax mRNA、Bax蛋白表达及Bax/Bcl-2比值。结论:益肝消癥方通过Bcl-2/Bax途径抑制肝细胞凋亡,减轻肝星状细胞增殖,从而对大鼠肝癌前病变具有一定改善作用。     

补肝散对感染血吸虫小鼠肝损伤后肝组织Bcl-2、Bax水平的影响

目的:观察补肝散干预感染血吸虫小鼠肝损伤模型后,对肝组织凋亡相关基因Bcl-2和Bax蛋白表达水平的影响,探讨补肝散对肝损伤的防护作用机制.方法:选择健康8周龄雄性昆明小白鼠108只,随机分为5组,将血吸虫尾蚴(18条/只)经小鼠腹部皮肤攻击感染造模,每组定期随机抽取6只小鼠,处死后留取其肝脏左叶,置于10％中性甲醛(用PBS配)固定,免疫组化法检测Bcl-2、Bax蛋白的表达水平.结果:①Bcl-2、Bax表达在模型组小鼠肝组织中的阳性率均明显升高,与正常组比较差异有显著性意义(P＜0.05),Bcl-2/Bax比值下降(P＜0.05);②补肝散组与模型组相比小鼠Bel-2表达升高差异有显著性意义(P＜0.05),Bax表达升高差异无显著性意义(P＞0.05),Bcl-2/Bax比值增高差异有显著性意义(P＜0.05).结论:补肝散可促进Bcl-2表达,使Bcl-2/Bax比值上调,减少肝细胞的凋亡,进而防护血吸虫性小鼠肝损伤,发挥抗纤维化的作用.     

Omi／HtrA2对人肝癌细胞系凋亡的调控作用研究

目的探讨丝氨酸蛋白激酶Omi／HtrA2在肝癌细胞中在促凋亡基因p53与抑凋亡基因XIAP之间调控机制的研究,并探讨其今后用于靶向治疗的可能性。方法用Western blotting的方法半定量测定4种不同的肝细胞株（L02、HepG2、Hep3B、Huh7）中p53、XIAP、Omi／HtrA2蛋白的表达量,以及使用Omi／HtrA2特异性抑制剂ucf-101后各自的表达量。结果在p53表达不同的细胞株中XIAP蛋白和Omi／HtrA2蛋白的表达也是不同的,p53可上调Omi／HtrA2蛋白表达,下调XIAP蛋白表达。使用ucf-101后,肝癌细胞中XIAP蛋白表达明显上调。结论Omi／HtrA2是p53与XIAP之间凋亡调控作用的信号因子之一,参与细胞凋亡的调控,有可能作为肿瘤细胞凋亡的治疗靶点。     

抑制金属蛋白酶组织抑制因子-2在肝组织中的表达对大鼠肝纤维化发展的影响

我们前期应用反义寡核苷酸技术，以金属蛋白酶组织抑制因子（TIMP）-1基因为靶基因，研究发现抑制TIMP-1的表达可阻止大鼠肝纤维化的发展。肝纤维化时，肝内增生的胶原蛋白主要为Ⅰ、Ⅲ型胶原，Ⅳ型胶原的增生沉积并不占主要地位，但Ⅳ型胶原过度沉积可使肝血窦毛细血管化，肝血流和结构改变，从而加剧肝脏病变。TIMP-2是肝组织内Ⅳ型胶原酶，即基质金属蛋白酶-2（MMP-2）的主要抑制因子，     

芪参益气滴丸对肝纤维化大鼠肝脏胶原表达的影响

目的：应用二甲基亚硝胺（DMN）建立肝纤维化大鼠模型，研究芪参益气滴丸对纤维化肝组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的影响。方法：70只大鼠随机分为正常对照组、模型组、芪参益气滴九干预组、模型对照组及芪参益气滴丸治疗组。采用DMN腹腔内注射的方法建立肝纤维化大鼠模型。按6期分类法评价各组大鼠肝纤维化程度。应用RT—PCR法检测各组大鼠肝组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA水平；应用免疫组织化学技术检测各组动物肝组织Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达。结果：芪参益气滴丸干预组与治疗组大鼠的肝纤维化程度、肝组织中Ⅰ型与Ⅲ型胶原mRNA水平及肝组织中Ⅰ型与Ⅲ型胶原的阳性表达，均分别较模型组与模型对照组显著减轻与下降。结论：芪参益气滴丸能明显减轻肝组织病理改变和肝纤维化程度．抑制Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达是其抗肝纤维化的机制。     

黄参膏对胃癌癌前病变细胞凋亡及BCL-2蛋白表达的影响

目的:探讨黄参膏对胃癌癌前病变细胞凋亡及相关基因表达的影响。方法:将46例胃癌癌前病变患者随机分为2组,治疗组28例,口服黄参膏60ml/天,对照组18例,口服维酶素片2.4g/天,疗程2月,治疗前后检测细胞凋亡指数和Bcl-2蛋白的表达。采用原位末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡,采用免疫组化检测Bcl—2蛋白的表达。结果:黄参膏组服药前后细胞凋亡指数分别为19.8±9.6％和32.8±16.2％,服药后细胞凋亡指数显著高于服药前(P<0.05)。Bcl-2蛋白阳性率治疗前后分别为53.6％和28.6％,治疗前后比较具有显著性差异(P<0.05)。而对照组细胞凋亡指数和Bel-2蛋白阳性率在服药前后比较均无显著性差异(P>0.05)。结论:黄参膏可诱导胃癌癌前病变细胞凋亡。     

丝氨酸蛋白酶Omi/HtrA2的表达与大鼠肝功能衰老的关系

目的：观察促凋亡蛋白丝氨酸蛋白酶Omi/HtrA2在衰老大鼠心、肾、肝、肺和脾中的表达情况,研究大鼠肝中Omi/HtrA2的表达与肝功能衰老程度的相关性。方法选用3月龄、9月龄和22月龄雄性SD大鼠;多普勒超声方法检测动物心功能;血清生化方法检测动物的肝功能;免疫组化方法比较Omi/HtrA2在心、肝、肺、肾、脾中的表达情况;Western免疫印迹方法检测动物肝中Omi/HtrA2表达情况。结果（1）在心、肾、肝和肺中,Omi/HtrA2表达量都很高,且蛋白的表达位置有一定的细胞特异性;与壮年组相比,衰老组大鼠的肝中Omi/HtrA2的表达量显著下降（P＜0.05）,而在心、肾、肺组织中Omi/HtrA2的表达量也有下降的趋势,但差异无统计学意义（P＞0.05）;（2）与壮年组相比,衰老组动物肝功能指标：天冬氨酸氨基转移酶（AST）、血清铁（SI）、白蛋白（ALB）、白蛋白与球蛋白比值（A/G）都发生显著改变（P＜0.05）;衰老组动物的心功能指标：左室短轴缩短率（FS）和左室射血分数（LVEF）都有下降趋势,但差异无统计学意义（P＞0.05）;（3）与壮年组相比,中年组和衰老组大鼠的肝中Omi/HtrA2的表达量显著下降（ P＜0.05）,随着年龄增加肝功能逐渐降低,Omi/HtrA2的表达量与ALB和A/G呈显著正相关（P＜0.05）。结论大鼠肝中Omi/HtrA2的表达量与肝功能呈正相关。     

衰老心肌中Omi/HtrA2表达增加可促进心肌细胞自噬

目的探讨衰老心肌中增加的Omi／HtrA2在心肌细胞自噬中的作用。方法用D-半乳糖干预胎鼠心肌细胞系H9c2建立衰老细胞模型,B-半乳糖苷酶染色观察细胞的衰老情况,cck8试剂盒检测细胞存活率,并以分析细胞乳酸脱氢酶（Lactic Dehydrogenase,LDH）水平反映其活性;给予Omi／HtrA2特异性抑制剂ucf_101降低Omi／HtrA2活性,构建稳转Omi／HtrA2的H9c2细胞株过表达Omi／HtrA2;采用westernblot法测定心肌细胞中Omi／HtrA2、beclinl及LC3．II蛋白的表达。结果（1）与H9c2心肌细胞相比,D．半乳糖诱导的H9c2心肌细胞内B-半乳糖苷酶染色阳性率显著升高[（87．7±3．6％）VS（18．3±2_8％）,P〈0．01];cck8结果显示,两组之间无显著性差异（P〉0．05）,但D-半乳糖诱导的H9c2心肌细胞中LDH活性明显升高（7．07±0．65w5．93±0．34,P〈0．01o（2）与H9c2细胞相比,D-半乳糖诱导的H9c24心肌细胞中Omi／HtrA2蛋白表达升高（P〈0．05）,而beclinl表达下降（P〈0．01）;给予ucf-101后,衰老细胞中Omi／HtrA2蛋白表达明显下降（P〈0．05）,而beclinl表达则进一步降低（P〈0．01）。（3）与H9c2细胞相比,过表达Omi／HtrA2的H9c2心肌细胞Omi／HtrA2蛋白表达增高,LC3-Ⅱ蛋白表达也增高（P〈0．05）;给予过表达Omi／HtrA2的H9c2心肌细胞ucf-101后,LC3-Ⅱ表达下降（P〈0．05o结论衰老心肌细胞中Omi／HtrA2的表达增加可促进心肌细胞自噬。     

Expression levels of the mitochondrial IAP antagonists Smac/DIABLO and Omi/HtrA2 in clear-cell renal cell carcinomas and their prognostic value

Purpose

Numerous molecular parameters are thought to be implicated in renal cell carcinoma (RCC) tumor biology and may therefore reflect the malignant potential of individual tumors. Their investigation may thus help to improve the postoperative management of RCC patients. This study characterized the mRNA expression levels and evaluated the prognostic effect of the mitochondrial inhibitor of apoptosis antagonists Smac/DIABLO and Omi/HtrA2 in tumor tissue from clear-cell RCC patients.

Methods

The relative gene expression (RGE) was analyzed by real-time RT-PCR in tumor tissue obtained from 85 patients (median follow-up: 47 months) following surgical treatment. Expression data was correlated to clinico-pathological variables and outcome.

Results

The RGE of Smac/DIABLO was lowest in patients with primary metastases, intermediate in those who progressed to metastatic disease, and highest in those who did not develop metastases during follow-up (P = 0.006). Expression levels of Smac/DIABLO and Omi/HtrA2 were strongly correlated with each other (Pearson coefficient 0.90). Recurrence-free and tumor-specific survival was shorter in patients with low Smac/DIABLO levels (P = 0.019 and P = 0.001) as well as in those with low Omi/HtrA2 tumor expression (P = 0.033 and P = 0.032). Contrary to Omi/HtrA2, low Smac/DIABLO levels were still predictive of a reduced time to recurrence (hazard rate 5.31; 95% CI: 1.16–24.21) and tumor-specific survival (hazard rate 4.24; 95% CI: 1.22–14.77) in explorative multivariate analysis.

Conclusions

The mRNA expression levels of the mitochondrial IAP antagonists Smac/DIABLO and Omi/HtrA2 are strongly inter-correlated, but do not relate to tumor stage or grade of RCC. Our data suggest that expression of Smac/DIABLO, but not Omi/HtrA2, is inversely associated with outcome of RCC patients.     

Activation of HtrA2, a mitochondrial serine protease mediates apoptosis: current knowledge on HtrA2 mediated myocardial ischemia/reperfusion injury

A plethora of apoptotic stimuli converge on the mitochondria and affect their membrane integrity, thereby eliciting release of multiple death-promoting factors residing in the mitochondrial intermembrane space into the cytosol. Among the death-promoting factors, a serine protease, high temperature requirement A2 (HtrA2) has drawn attention as a key player in the apoptosis pathways in different pathological conditions including myocardial ischemia/reperfusion injury. Heart ischemia/reperfusion results in HtrA2 translocation from the mitochondria to the cytosol, where it promotes cardiomyocyte apoptosis via a protease activity-dependent and caspase-mediated pathway. Once released, cytosolic HtrA2 causes X-chromosome-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP) degradation, caspase activation, and subsequent apoptosis. Consistent with the hypothesis, inhibition of HtrA2 improved postischemic myocardial contractile functions along with reduction of myocardial infarct size. The precise mechanism underlying HtrA2-induced apoptosis in mammalian cells has been studied through biochemical, structural, and genetic studies, in which HtrA2 promotes proteolytic activation of caspases through multiple pathways in heart ischemia. Therapeutic interventions that inhibit HtrA2 expression, translocation, or protease activity (such as by using the ucf-101 inhibitor) may provide an attractive therapeutics in the treatment of cardiovascular diseases.     

MUC2在胃癌及癌前病变中的表达及其意义

目的探讨粘蛋白MUC2在胃癌，癌前病变中的表达及其与胃癌临床病理特征的关系。方法采用免疫组织化学SP法检测10例正常胃粘膜，20例胃炎肠化生组织及49例胃癌组织中MUC2的表达。结果MUC2在正常胃粘膜中没有表达，MUC2在胃炎肠化生粘膜中的表达率为85%，在胃癌中的表达率为73.5%，肠化生粘膜和胃癌组织的阳性率明显高于正常胃粘膜，差异有非常显著性意义（P〈0.001）。MUC2与胃癌的病理组织分型密切相关，高中分化腺癌，低分化腺癌，粘液腺癌的阳性率分别为81.0%，52.6%、100%。差异有显著性（P〈0.05），粘膜腺癌的强阳性表达率为77.8%，与另外两种组织学分型之间有非常显著性差异（P〈0.001）。结论MUC2是胃癌发生发展中的重要因子。MUC2在不同的组织学类型的胃癌中表达不同，粘液腺癌中表达最强。     

胃癌及癌前病变组织中c_erbB_2癌基因产物的表达

目的探讨ｃｅｒｂＢ２癌基因产物的表达与胃癌发生及胃癌生物学行为的关系．方法应用抗ｃｅｒｂＢ２癌基因蛋白（Ｐ１８５）的单克隆抗体，采用免疫组化ＡＢＣ方法对正常胃粘膜（ｎ＝９）、各级胃粘膜异型增生（轻度ｎ＝１０，中度ｎ＝６，重度ｎ＝７）、早期胃癌（ｎ＝１８）及进展期胃癌（ｎ＝３０）进行研究，并与胃癌类型、大小、有无淋巴结转移等作了比较分析．结果正常胃粘膜为阴性，仅在腺体颈部偶见Ｐ１８５蛋白的弱阳性表达．在异型增生病变中则有较高的表达率，并随异型增生程度的增加，表达率逐渐升高，轻、中、重度异型增生表达率分别为５０％，８３３％，８５７％．Ｐ１８５蛋白在早期及进展期胃癌中的表达率分别为２２２％和５６７％．重度异型增生表达率显著高于早期胃癌（Ｐ＜００５），进展期胃癌表达率显著高于早期胃癌（Ｐ＜００５），淋巴结转移组的表达率高于淋巴结未转移组（５９３％ｖｓ２３８％，Ｐ＜００５），但Ｐ１８５蛋白的表达与胃癌组织学类型及胃癌肿块大小无相关性（Ｐ＞００５）．结论ｃｅｒｂＢ２癌基因有可能参与正常胃粘膜的增殖、修复及癌变过程，Ｐ１８５蛋白阳性的肿瘤可能具有更强的浸润及转移能力．     

黄参膏对胃癌癌前病变细胞凋亡及BCL—2蛋白表达的影响

目的:探讨黄参膏对胃癌癌前病变细胞凋亡及相关基因表达的影响。方法:将47例胃癌癌前病变患者随机分为2组,治疗组24例,口服黄参膏60ml/天,对照组23例,口服维酶素片12片/天,疗程2月,治疗前后检测细胞凋亡指数和 Bcl-2蛋白的表达。采用原位末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡,采用免疫组化检测 Bcl-2蛋白的表达。结果:黄参膏组服药前后细胞凋亡指数分别为19.8±9.6%和32.8±10.2%,服药后细胞凋亡指数显著高于服药前(P<0.05)。Bcl-2蛋白阳性率治疗前后分别为54.2%和25.0%,治疗前后比较具有显著性差异(P<0.05)。而对照组治疗前后细胞凋亡指数分别为18.9±8.5%和20.1±9.8%,治疗前后 BCL-2蛋白阳性率分别为52.5%和43.5%,对照组细胞凋亡指数和 BCL-2蛋白阳性率在服药前后比较均无显著性差异(P>0.05)。结论:黄参膏可诱导胃癌癌前病变细胞凋亡。