腺病毒介导的人HGF转染大鼠骨髓间充质干细胞及其作用研究

目的：评价携带HGF基因的腺病毒栽体转染鼠骨髓间充质干细胞(MSC)的效率，以及转染HGF基因对MSC增殖与分化的影响。方法：采用荧光显微镜及流式细胞术检测转染效果和转染率；采用ELISA方法检测转染后HGF的表达情况；细胞增殖分析采用MTT法；MSC向成骨细胞分化采用碱性磷酸酶染色法。结果：转染效率与病毒滴度(MOI)具有量效关系，随着MOI的增加，转染率明显增高，当MOI=400时，转染率可达99．99％。转染HGF后，MSC表达HGF明显增高，48h可达128ng/ml，随后逐渐下降并维持2周以上；转染HGF对MSC的增殖以及向成骨分化没有影响。结论：MSC是一种理想的基因载体细胞，可用于HGF的基因治疗。     

逆转录病毒介导hBMP7基因转染兔骨髓间充质干细胞的表达

采用粘－粘端连接方法构建hBMP7逆转录病毒载体,重组质粒转染包装细胞PT67后,制备含目的基因的重 逆转录病毒液感染兔骨髓间充质干细胞。限制性内切酶切分析筛选插入方向正确的重组质粒并进行基因测序。结果显示,hBMP7逆转录病毒载体中外源基因插入方向正确、无碱基错误和缺失。原位杂交和免疫组织化学检测表明,感染后2天经基因转染的BMSc原位杂交和免疫组化检测结果呈阳性,未经转染的细胞检测结果呈阴性。转染的BMSc经G418筛选至4周仍有外源BMP蛋白的表达。提示采用逆转录病毒介导方法转染的BMSc中可有源性BMP7mRNA和蛋白的表达。     

BMP12转染骨髓间充质干细胞的瞬时表达

目的 以骨形态发生蛋白12(BMP12)基因转染骨髓间充质干细胞,探讨骨髓间充质干细胞定向分化为肌腱细胞的可行性。方法 将携带有BMP12基因的质粒pEGFP-C1,采用电穿法转染骨髓间充质干细胞,转染后于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)表达情况。结果 转染后6h可见细胞内有GFP表达,12h后达高峰,持续约3天,其后有些细胞荧光开始减退。结论 BMP12基因转染骨髓间充质干细胞后,骨髓间充质干细胞内有GFP表达,提示细胞转染成功,骨髓向间充质干细胞定向分化为肌腱细胞具有可行性。     

Survivin在骨髓间充质干细胞中的表达研究

目的：培养鉴定骨髓间充质干细胞（MSCs）,检测survivin的表达。方法：应用Ficoll法分离培养MSCs,流式细胞仪检测其特异性表面标志物,RT—PCR检测survivin mRNA表达。结果：培养MSCs的超微结构显示了干细胞特性,流式细胞仪检测证实为MSCs,survivin mRNA表达阳性。结论：Survivin在正常人骨髓间充质干细胞中有表达,提示它可能参与了其生物学行为并影响间充质干细胞存活。     

人骨髓间充质干细胞体外不同分离与培养方法的比较

目的探讨骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)理想的分离、培养方法。方法采用密度梯度离心法和全骨髓贴壁法分离培养人骨髓干细胞,并将其分别置于普通培养瓶6、0Co培养瓶中培养,应用倒置显微镜和免疫组化法观察和鉴定骨髓间充质干细胞;流式细胞术检测细胞表面标志。结果人骨髓干细胞呈均一梭形、成纤维细胞样,形成集落样生长。60Co培养瓶细胞贴壁情况明显好于普通培养瓶,且费用低;免疫组化及流式细胞术显示CD34、CD45表达为阴性,CD29、CD44表达为阳性。60Co照射处理的培养瓶结合采用全骨髓贴壁法分离培养法获得的骨髓干细胞活性高,增殖力强,克隆形成早,传代时间短。结论全骨髓贴壁法和密度梯度离心法均可获得高纯度贴壁生长的骨髓干细胞,其中60Co照射处理的培养瓶结合采用全骨髓贴壁法分离培养简单易行,骨髓干细胞增殖快,活性好,传代力持久。可以收获大量、高纯度的MSCs;本实验为MSCs进一步的研究与临床应用提供了实验方法及依据。     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养及示踪优化

目的探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)的标记和示踪方法,优化示踪技术。方法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,通过流式细胞仪鉴定细胞表面抗原(CD29、CD34、CD45、CD90),分别用BrdU、DAPI以及GFP 3种方法标记干细胞,DAPI和GFP标记率直接通过荧光显微镜进行鉴定,BrdU标记率通过细胞免疫化学法鉴定,比较3种示踪技术的优缺点。结果流式细胞仪鉴定结果显示MSCs CD29、CD90表达阳性,CD34、CD45表达阴性。3种标记方法对细胞均未显示明显毒性。终浓度10μmol/L BrdU标记48h、终浓度1μg/ml DAPI标记12h分别为其最佳标记浓度及时间。感染复数MOI=8时,GFP慢病毒感染MSCs 12h,感染率可达90%以上。结论 GFP基因转染是一种稳定、可靠、安全的标记方法,对成体干细胞的示踪有重要价值。     

骨髓间充质干细胞研究进展

骨髓间充质干细胞是干细胞领域的研究热点之一。虽然近几年来有关间充质干细胞的研究已取得了很大进展,但仍有很多问题有待进一步解决。本文主要对间充质干细胞的生物学特性、以及免疫耐受性、分化和促修复、间充质干细胞的标记等问题进行综述。     

真皮间充质干细胞的分离培养及其NOV基因的表达

目的：分离培养大鼠真皮来源成体多能干细胞并研究其NOV基因表达。方法：分离培养新生大鼠真皮间充质干细胞，采用形态学观察及免疫组化法进行鉴定。用脂质体法将构建的NOV基因真核表达载体转染入大鼠真皮多能干细胞中，在荧光倒置显微镜下观察转染产物，RT—PCR法检测转染细胞中NOV基因表达。结果：新生大鼠真皮间充质干细胞86％处于G0／G1期，多向诱导后可分化为神经细胞及中胚层来源细胞。NOV重组质粒体外转染大鼠真皮多能干细胞后，转染细胞中检测到NOV基因。结论：大鼠真皮组织中存在着成体多能干细胞，具有多胚系分化潜能。该细胞可作为NOV基因表达的细胞载体。     

人骨髓间充质干细胞的培养及向软骨细胞分化

为建立分离纯化、大鼠扩增人骨髓间充质MSC，改进其冰冻保存的方法，并初步探索其体内向软骨细胞分化的最佳方法，以Percoll(1.073g/ml）密度梯度离心法分离人骨髓中单个核细胞，用含经筛选的10％的胎牛血清的低糖DMEM体外培养扩增骨髓干细胞（MSC），FCM鉴定细胞纯度，传代2次以后的细胞吸附于明胶海绵内，以TGF－β为主要刺激因子体外诱导1周，植入裸鼠皮下。在不同的时间取出组织块，甲苯胺蓝染色显示细胞外基质。结果发现，体外培养扩增的人间充质MSC表达CD166、CD29、CD44等表面抗原，不表达CD34、CD45、HLA－DR等抗原；MSC可以不经消化，直接在原培养瓶内冻存在－70℃低温冰箱，3个月后复苏的细胞生物学特性没有明显改变；体外诱导的细胞植入裸鼠皮下4周后即出现软骨细胞特有的结构。说明骨髓MSC具有独特的生物学特征，体外培养的MSC具有体内成软骨能力，应用MSC构建软骨组织具有一定的可行性。     

人胚胎骨髓间充质干细胞在大鼠体内分化为肝细胞的研究

目的：观察人胚胎骨髓间充质干细胞(MSC)在受体大鼠体内的分化演变，研究人胚胎骨髓间充质干细胞在活体大鼠体内转化为人肝细胞的可行性。方法：将人胚胎MSC移植到肝损伤合并自身肝细胞再生抑制大鼠的脾脏。术后分时段取脾脏进行免疫组化染色，了解人白蛋白(ALB)、人角蛋白(CK8)、人CK18、人CK19的表达情况。结果：人胚胎MSC移植后10d大鼠脾脏的人CK8、人CK18、人CK19免疫组化染色可见阳性细胞；移植后15d大鼠脾脏组织内人ALB免疫组化染色可见阳性细胞。结论：人胚胎MSC能够在自身肝细胞再生抑制的肝损伤大鼠脾脏内分化为肝细胞。     

IL-1Ra和IL-10真核表达质粒载体的构建及其表达检测

目的:构建人IL-1Ra和人IL-10真核表达质粒载体并检测其表达。方法:用双酶切方法切取PCDI-IL-1Ra和PCDI-IL-10质粒中包含人IL-1Ra和人IL-10 CDS全长序列的cD-NA片段,并分别连接到真核表达质粒pcDNA3.1上,然后用壳聚糖转染上述质粒到原代软骨细胞,RT-PCR检测其mRNA水平的表达。结果:成功将人IL-1Ra和IL-10 CDS全长序列的cDNA片段克隆到真核表达载体,mRNA水平检测到目的基因的表达明显提高。结论:真核表达质粒可以用于外源基因的原代软骨细胞导入和表达,为进一步的基因治疗研究提供依据。     

IL-1和TNF-α拮抗剂治疗骨关节炎实验研究

目的:观察腺病毒载体介导的白细胞介素1受体拮抗蛋白(IL-1Ra)和可溶性肿瘤坏死因子Ⅰ型受体(sTNF-RI)基因转移对兔骨关节炎的治疗作用,并探讨IL-1和TNF-α在骨关节炎发生中的作用。方法:构建Ad-IL-1Ra和Ad-sTNF-RI腺病毒载体,注射到兔骨性关节炎膝关节腔内。关节内注射腺病毒后第3天和第7天,分别用1ml生理盐水灌洗膝关节,抽取关节腔灌注液采用ELISA分析外源基因的表达。第7天处死动物,取膝关节股骨内侧髁软骨和滑膜常规石蜡切片,软骨HE染色、甲苯胺蓝染色和滑膜组织HE染色检查病理改变,并进行软骨组织学评分。结果:膝关节内注射IL-1Ra能明显抑制关节软骨的破坏,但对滑膜炎无明显治疗作用;单独sTNF-RI基因治疗对关节软骨的破坏和滑膜炎均无明显的作用。结论:IL-1Ra对骨关节炎关节软骨有明显的保护作用,而sTNF-RI对骨关节炎无明显的治疗作用,这提示在骨关节炎的发生中IL-1可能起主要的作用,因而抑制IL-1的作用对骨关节炎的治疗更为有效。     

IL-8基因真核表达载体的构建及其在OVCAR-3卵巢癌细胞中的表达

目的:构建白细胞介素8(interleukin 8,IL-8)基因真核表达载体,瞬时转染OVCAR-3卵巢癌细胞,为进一步探讨其与肿瘤发生发展关系奠定基础.方法:采用RT-PCR法自健康志愿者外周血单个核细胞扩增IL-8基因,构建pcDNA3.1( )/IL-8重组质粒;脂质体介导将外源基因转入OVCAR-3卵巢癌细胞,半定量RT-PCR、Western印迹及ELISA法鉴定其mRNA及蛋白瞬时表达后,MTT法检测细胞转染前后生长增殖特性的改变,FCM检测细胞周期的变化.结果:重组质粒双酶切电泳结果显示,相应位置(300 bp,5 400 bp)可见2条清晰特异的DNA条带;DNA测序结果进一步显示,重组质粒中插入的基因片段全长 300 bp,编码序列与GenBank报道的基因序列相符,阅读框保持不变;RT-PCR、Western 印迹检测及ELISA检测结果显示,转染后OVCAR-3细胞IL-8 mRNA及蛋白表达水平均明显升高(P<0.05);MTT检测结果显示,IL-8转染细胞组转染3 d后的光密度值(D值)显著高于未转染细胞组(P<0.05);FCM分析结果显示,OVCAR-3细胞转染IL-8基因后进入S期的细胞比例显著增高,增殖指数也相应上升,与未转染及空质粒转染组细胞相比,差异显著(P<0.05).结论:IL-8基因真核表达载体成功构建并瞬时转染OVCAR-3卵巢癌细胞;IL-8可以自分泌方式促进卵巢癌OVCAR-3细胞生长增殖.     

人血管生成素-1真核表达载体的构建与表达

目的构建人血管生成素-1的真核表达载体,真核表达人血管生成素-1蛋白并进行纯化。方法通过聚合酶链反应（PCR）将人血管生成素-1基因片段插入B7载体中构建真核表达载体,通过转染中国仓鼠卵巢（CHO）细胞进行真核表达。结果成功构建了B7Ang-1真核表达载体,在CHO细胞中进行了稳定表达,获得了纯化的人血管生成素-1蛋白。结论真核系统表达的人血管生成素-1蛋白具有良好的抗原性,为进一步的生物活性研究和临床应用奠定了基础。     

人中性粒细胞多肽1真核表达载体的构建与表达

目的 构建人中性粒细胞多肽1(HNPl)基因真核表达载体,为探讨HNP1基因工程生产的可能性奠定基础。方法 从健康人中性粒细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增出HNPl基因cDNA片段,将纯化PCR产物与pMD18-T载体连接,经酶切鉴定及测序确证,将其亚克隆入真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO中．用脂质体转染CA3S-7细胞,用BA-ELISA法检测转染细胞上清中HNP1的表达。结果 从人中性粒细胞中克隆出人HNP1基因,经测序分析与GenBank公布的人HNP1核苷酸序列完全一致,并在COS-7细胞中获高效瞬时表达。结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO／HNP1,为后续哺乳动物工程细胞株的建立奠定了实验基础。     

人骨髓间充质干细胞Toll样受体3和4活化对IL-10、IL-12和IL-6分泌的影响

目的：研究人骨髓间充质干细胞（BM—MSCs）中Toll样受体（TLR）3和4的活化对IL-10、IL-12和IL-6分泌的影响。方法：用RT—PCR法检测体外培养的BM—MSCs中是否存在TLR3和TLR4的表达;用不同剂量的聚肌胞和脂多糖分别进行诱导后,用ELISA法检测培养上清中IL-10、IL-12和IL-6的变化。结果：BM—MSCs中有较高水平的TLR3和TLR4mRNA表达。聚肌胞可明显促进IL-6分泌（P〈0．05）,且0．025g／L组明显强于0．0025g／L组（P〈0．01）;明显抑制IL-10分泌（P〈0．01）,且0．25g／L组明显强于0．025g／L组（P〈0．05）;对IL-12的分泌无明显影响。脂多糖可明显促进IL-6的分泌（P〈0．01）,而对IL-12和IL—10的分泌无明显影响。结论：BM—MSCs中有较高水平的TLR3和TLR4表达。TLR3活化影响BM—MSCs对IL-6和IL-10的分泌,TLR4活化影响IL-6的分泌,TLR3或TLR4活化均不影响IL-12的分泌。     

人骨髓间充质干细胞表型转化为汗腺细胞的体外研究

目的 研究体外人骨髓间充质干细胞（MSCs）和汗腺细胞（SGCs）直接和间接共培养条件下骨髓间充质干细胞的表型转化及其机制。方法 体外分别分离培养、扩增并鉴定MSCs和汗腺细胞。将培养的MSCs和经47℃高温处理造成热休克的SGCs直接和间接共培养，1周后，采用免疫细胞化学染色法和流式细胞仪法检测共培养体系中MSCs的表型改变，Western blot测定细胞外信号调节激酶（ERK）和磷酸化细胞外信号调节激酶（pERK）表达。结果 MSCs和SGCs均呈克隆样生长，MSCs表达CD44、CD105和CD29，不表达CD34、CEA、CK19和CK7；SGCs表达CEA、CK19、CK8和CK7。MSCs与经高温损伤后的SGCs共培养1周后，部分MSCs呈汗腺细胞表型，间接共培养结果示各组MSCs均表达水平相当的ERK，但pERK水平表达不同。结论 成人MSCs和热休克的SGCs直接和间接共培养均可诱导MSCs向SGCs表型转化，pERK途径参与这一过程。     

大鼠骨髓间充质干细胞磁标记及MR成像研究

目的应用菲立磁．多聚左旋赖氨酸复合物标记大鼠骨髓间充质干细胞，探讨MR成像显示磁标记干细胞的可行性。方法制备菲立磁-多聚左旋赖氨酸复合物。分离培养Wistar大鼠骨髓间充质干细胞，以菲立磁-多聚左旋赖氨酸复合物标记干细胞。分别于标记后24h及1、2、3周行普鲁士蓝染色观察细胞内铁，台盼蓝排除试验检测细胞活力。应用1．5TMR仪，以SE序列T1WI、T2WI和梯度回波（GRE）序列T2＊WI行磁标记干细胞成像。结果普鲁士蓝染色显示细胞质内大量铁颗粒存在，标记率100％；随细胞分裂增殖，细胞内铁颗粒逐渐减少。干细胞磁标记后24h及1、2、3周的台盼蓝拒染率分别为91．00％、93．00％、91．75％和92．50％，与未标记细胞相比较差异无统计学意义（P〉0．05）。10^3、10^4、10^5个磁标记干细胞T2WI信号降低分别为63．75％、82．31％、91．92％，T2＊WI信号降低分别为68．24％、83．01％、93．94％。10^5个干细胞磁标记后24h及1、2、3周T2＊WI信号降低分别为93．75％、75．92％、41．75％、8．83％。结论应用菲立磁-多聚左旋赖氨酸复合物标记大鼠间充质干细胞安全、有效；T2＊WI对磁标记干细胞的显示最敏感；MR信号改变与干细胞数目及分裂增殖状态相关。     

miR-1抑制SDF-1表达和分泌调控HMSC-bm向肝癌细胞迁移

目的 明确肿瘤抑制性micro RNA-1（miR-1）能否通过抑制SDF-1的表达和分泌,调控骨髓间充质干细胞（HMSC-bm）向肿瘤组织的转移.方法 （1）分别利用miR-1表达质粒pSuper-miR-1和miR-1反义寡核苷酸,在肝癌细胞系HepG2中过表达或下调miR-1,Western blot和酶联免疫吸附实验分别检测肝癌细胞蛋白裂解物和培养上清液中SDF-1的表达和分泌水平;（2）构建融合SDF-1 3UTR的pGL3重组萤光素酶报告基因载体,将其与pSuper-miR-1共转染HEK293细胞,利用双萤光报告基因检测系统检测重组萤光素酶的表达情况.（3）利用pSuper-miR-1或miR-1反义寡核苷酸转染接种于Transwell下层小室的HepG2细胞过表达miR-1或下调miR-1水平,检测TransweH上层小室HMSC-bm向下层小室HepG2肝癌细胞的迁移情况.结果 （1）在肝癌细胞,HepG2过表达miR-1能够显著抑制SDF-1蛋白表达和分泌,而下调miR-1水平则能够诱导SDF-1的表达和分泌.（2） miR-1能够抑制携带SDF-1 3UTR的pGL3重组萤光素酶报告基因活性.（3）在Transwell下层小室的HepG2细胞中过表达miR-1后,上层小室中HMSC-bm向下层小室迁移细胞数量显著减少,而下调下层小室HepG2细胞中miR-1表达水平,则明显增加HMSC-bm向HepG2肝癌细胞的迁移.结论 miR-1能够直接抑制肝癌细胞SDF-1的表达和分泌,并藉此降低肝癌细胞对HMSC-bm的趋化作用.     

大鼠间充质干细胞的体外分离培养及CFSE标记

目的 探讨体外分离、培养及荧光染料CFSE标记大鼠间充质干细胞(MSCs)的方法.方法 Wistar大鼠10只.用密度梯度离心及贴壁法相结合的方法分离纯化大鼠MSCs并进行鉴定.荧光染料CFSE标记MSCs,荧光显微镜检测标记率,CCK-8法检测标记细胞的增殖能力.结果 原代MSCs 72h贴壁,呈梭形,集落样生长;传代后,细胞变为形态均一,排列有序的成纤维细胞样.CFSE标记当天,荧光显微镜下大鼠MSCs呈明亮的绿色荧光,标记率达100%,随着培养时间延长,荧光强度逐渐减弱,标记率随之下降,标记4周后,标记率下降至78%;标记细胞的增殖能力与未标记细胞相比,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 利用密度梯度离心法结合贴壁法可以获得比较纯的MSCs;CFSE短期标记MSCs效率很高,且标记细胞的增殖能力不受影响,但荧光强度及标记率随着时间延长而下降.