白细胞介素22对HaCaT细胞CCL28表达的影响

目的探讨白细胞介素(IL-22)对HaCaT细胞黏膜相关上皮趋化因子(CCL28)表达的影响。方法培养HaCaT细胞,将其分为6组:4个IL-22组(分别用12.5、25、50、100μg/L的IL-22进行干预处理);阻断剂组(50μmol/L PD98059阻断干预,2 h后加入50μg/L IL-22);对照组(用PBS处理)。24 h后,用CCK-8检测细胞的增殖;用实时荧光定量RT-PCR检测CCL28 mRNA的水平变化;用蛋白免疫印迹法、酶联免疫吸附法和免疫荧光检测CCL28蛋白水平的变化。结果CCK-8检测显示,上述浓度的IL-22作用于HaCaT细胞24 h后,对细胞的增殖有明显的促进作用,且这种促进作用能被PD98059抑制,差异具有统计学意义(P<0.05)。实时荧光定量RT-PCR检测显示,上述浓度的IL-22作用于HaCaT细胞,细胞中CCL28 mRNA逐渐升高,均较对照组升高,差异有统计学意义(P<0.01);通路阻断剂组较50μg/L IL-22组降低,差异有统计学意义(P<0.05)。用蛋白免疫印迹法和酶联免疫法检测到CCL28蛋白水平变化的趋势与实时荧光定量RT-PCR检测到的CCL28 mRNA的水平变化的趋势一致,且差异有统计学意义(P<0.05)。免疫荧光检测显示,HaCaT细胞内CCL28蛋白主要表达在细胞质。结论IL-22可剂量依赖促进HaCaT细胞增殖和CCL28的表达,其可能通过MAPK-ERK1/2通路作用。     

重楼皂苷Ⅰ对缺氧诱导HaCaT细胞VEGF表达的影响

目的研究重楼皂苷Ⅰ对人永生化角质形成细胞株(HaCaT细胞)在缺氧条件下VEGF表达的影响。方法采用MTT法用于检测进行细胞增殖实验,ELISA方法检测重楼皂苷Ⅰ对HaCaT细胞上清中VEGF表达的影响。实时定量PCR(RT-PCR)方法检测重楼皂苷Ⅰ对HaCaT细胞VEGF mRNA的影响。采用Western blot检测重楼皂苷Ⅰ对HaCaT细胞VEGF,HIF-1α,STAT-3,phospho-STAT-3蛋白表达的影响。结果在缺氧条件下,所选浓度范围内(0.75,1.5,3,5μg/m L),重楼皂苷Ⅰ对HaCaT细胞的增殖有抑制作用;其中1.5μg/m L,3μg/m L和5μg/m L浓度组重楼皂苷Ⅰ可下调HaCaT细胞VEGF mRNA表达及上清中VEGF水平,在缺氧条件下,重楼皂苷Ⅰ抑制了HIF-1α,STAT-3,phospho-STAT-3的表达。结论重楼皂苷Ⅰ能抑制缺氧条件下HaCaT细胞增殖和VEGF的表达,可能与其能抑制缺氧诱导的HIF-1α表达及STAT-3的活化有关。     

金黄色葡萄球菌肽聚糖对HaCaT细胞Toll样受体2和4的影响

目的观察金黄色葡萄球菌胞壁成分肽聚糖对HaCaT细胞Toll样受体(TLR)2和TLR4表达的影响。方法用不同浓度的肽聚糖(10μg/mL、30μg/mL、100μg/mL)处理培养的HaCaT细胞,用RT-PCR检测TLR2 mRNA和TLR4 mRNA含量变化,用流式细胞术检测HaCaT细胞表面TLR2和TLR4蛋白的表达。结果30μg/mL肽聚糖处理组HaCaT细胞的TLR2 mRNA和TLR4 mRNA相对表达水平分别为0.826±0.06和0.801±0.04,明显高于未处理的对照组的TLR2 mRNA(0.433±0.04,P<0.05)和TLR4 mRNA(0.351±0.05,P<0.01)。各浓度的肽聚糖处理HaCaT细胞24h,及100μg/mL浓度的肽聚糖处理HaCaT细胞12h、24h、36h和48h时,及100μg/mL肽聚糖处理24h后,HaCaT细胞表面TLR2和TLR4蛋白表达量均最高。结论肽聚糖可以上调HaCaT细胞TLR2和TLR4的mRNA和蛋白的表达。     

姜黄素对IL-17诱导的人表皮角质形成细胞株CCL20表达的影响

目的探讨姜黄素对IL-17诱导的人表皮角质形成细胞株(HaCaT细胞株)CCL20表达的影响。方法用IL-17刺激HaCaT细胞,并加入不同浓度的姜黄素(2.5μmol/L,5μmol/L,10μmol/L)共培养24h。提取总RNA并收集细胞上清液,分别进行荧光定量PCR和ELISA实验,从mRNA及蛋白表达水平两方面观察姜黄素对CCL20表达的影响。结果 IL-17能够有效地诱导HaCaT细胞CCL20的表达。加入姜黄素共培养后,CCL20在mRNA及蛋白表达水平均明显下降(P均<0.05)。结论姜黄素对IL-17诱导的HaCaT细胞CCL20的表达具有明显的抑制作用,可为其对银屑病的治疗提供理论依据。     

白介素22调控角质形成细胞表达角蛋白17的研究

目的:研究白介素(IL)-22对培养的人永生化角质形成细胞(HaCaT细胞)表达角蛋白(K)17的影响.方法:对体外培养的HaCaT细胞分别给予不同浓度的IL-22(0 ～ 100 μg/L)作用24 h,应用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time PCR)检测K17mRNA 表达水平,以酶联免疫吸附测定技术(ELISA 法)、蛋白质免疫印记法(Western blot)及免疫荧光染色法检测K17 蛋白表达水平的变化.结果:HaCaT细胞经12.5、25.0、50.0、100.0 μg/L 的IL-22 作用后, 均出现不同程度的K17 表达.与空白对照组的HaCaT细胞相比,12.5 μg/L组的mRNA及蛋白表达无明显差异,而25.0、50.0、100.0 μg/L组的mRNA 及蛋白表达则明显上升(P ＜0.05),并且随着IL-22浓度增高,K17mRNA及蛋白表达量增多.免疫荧光染色图片显示,随着IL-22 浓度的增高,HaCaT细胞胞质中K17蛋白荧光染色增强.结论:IL-22可以剂量依赖方式诱导HaCaT细胞表达K17.     

复方甘草酸苷对HaCaT细胞表达AQP3的影响

目的 观察复方甘草酸苷(compound glycyrrhizin,CG)对HaCaT细胞表达水通道蛋白3(aquaporin3,AQP3)的影响.方法 不同浓度CG处理人角质形成细胞株HaCaT,MTT法检测CG对HaCaT细胞的增殖抑制作用,蛋白质印迹法(Western blotting method)分析CG处理后的HaCat细胞的AQP3表达.结果 低浓度(31.25～62.5μL/mL)CG对HaCaT细胞生长没有明显影响,而125μL/mLCG则对HaCaT细胞的生长产生低毒,但AQP3的表达明显高于正常对照组.结论 浓度(62.5～125)μL/mLCG可促进HaCaT细胞表达AQP3,而自125μL/mL开始出现细胞毒性,但此时AQP3表达至最高峰.     

重组人色素上皮衍生因子对HaCaT细胞体外增殖和白细胞介素6、8及血管内皮生长因子表达的影响

目的 探讨重组人色素上皮衍生因子（rhPEDF）对HaCaT细胞体外增殖和白细胞介素6（IL-6）、IL-8及血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。 方法 HaCaT细胞分4组进行不同处理,分别为100 μg/L rhPEDF组、50 μg/L rhPEDF组、25 μg/L rhPEDF组及对照组（只加RPMI 1640培养液）。采用CCK8法检测不同浓度rhPEDF作用于HaCaT细胞24、48、72 h后对细胞体外增殖的影响。RT-PCR和Western印迹法检测rhPEDF对HaCaT细胞IL-6、IL-8、VEGF mRNA及其蛋白表达的影响。统计分析方法采用两因素方差分析、单因素方差分析、SNK-q检验以及Pearson相关分析。 结果 25、50、100 μg/L的rhPEDF作用24、48、72 h后对HaCaT细胞体外增殖均有不同程度的抑制作用。随时间延长和rhPEDF浓度的增加,rhPEDF对HaCaT细胞体外增殖的抑制作用均逐渐增强（F = 1115、329.9,均P < 0.001）。与对照组相比,不同浓度（100、50、25 μg/L）rhPEDF作用于HaCaT细胞48 h后,VEGF、IL-6、IL-8 mRNA及蛋白的表达均下降,差异均有统计学意义（P < 0.05）。随rhPEDF浓度的增加,各浓度rhPEDF组VEGF mRNA、IL-6和IL-8蛋白表达均出现下调,与对照组比较,差异均有统计学意义（P < 0.05）;100 μg/L rhPEDF组的IL-6、IL-8 mRNA表达明显低于25 μg/L rhPEDF组（P < 0.05）;100 μg/L rhPEDF组VEGF蛋白表达分别低于50、25 μg/L rhPEDF组（P < 0.05）,而50与25 μg/L rhPEDF组间差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 rhPEDF可抑制HaCaT细胞体外增殖,并可在mRNA及蛋白水平下调IL-6、IL-8、VEGF的表达。     

白细胞介素22对HaCaT细胞他扎罗汀诱导基因3表达的影响

目的 探讨白细胞介素22（IL-22）对HaCaT细胞他扎罗汀诱导基因3（TIG3）表达的影响。 方法 用12.5 ~ 100 μg/L IL-22、IL-22 + PD98059（MAPK-ERK1/2通路抑制剂）及IL-22 + AG490（JAK2/STAT3通路抑制剂）干预处理HaCaT细胞24 h后,分别提取HaCaT细胞总蛋白及总RNA,用免疫荧光、Western印迹法、ELISA法检测TIG3的蛋白水平,用实时荧光定量RT-PCR检测TIG3 mRNA水平的改变。 结果 免疫荧光检测显示,HaCaT细胞内TIG3蛋白主要表达在细胞质。用Western印迹法检测,用12.5、25、50、100 μg/L的IL-22干预处理后,HaCaT细胞中TIG3蛋白表达分别为0.743 ± 0.035,0.678 ± 0.040,0.582 ± 0.041和0.328 ± 0.032,均低于对照组0.839 ± 0.045（P < 0.05）。酶联免疫法检测的结果示,上述浓度的IL-22干预处理后,TIG3蛋白水平变化的趋势与Western印迹法的结果一致。定量RT-PCR检测示TIG3 mRNA分别为对照组的0.838 ± 0.036,0.686 ± 0.061,0.565 ± 0.047,0.457 ± 0.033（P < 0.05）。加入信号通路抑制剂后,TIG3蛋白和mRNA水平降低程度较无抑制剂组减少,差异有统计学意义。 结论 IL-22可剂量依赖抑制HaCaT细胞TIG3的表达,其机制可能与MAPK-ERK1/2和JAK2/STAT3通路有关。     

阿维A对缺氧培养的HaCaT细胞体外增殖和缺氧诱导因子1α及血管内皮生长因子表达的影响

目的 通过阿维A作用于缺氧培养的HaCaT细胞,初步探讨阿维A治疗银屑病的可能机制.方法 将浓度为10-5、10-6、10-7、10-8mol/L的阿维A分别作用于HaCaT细胞,用CCK-8法检测缺氧培养12、24、36h对HaCaT细胞体外增殖的影响.反转录PCR和Western印迹检测不同浓度阿维A对缺氧培养24 h的HaCaT细胞HIF-1α、血管内皮生长因子(VEGF)蛋白及mRNA表达的影响.结果 阿维A 10-8、10-7、10-6、10-5 mol/L作用24 h,HaCaT细胞体外增殖抑制率分别为(13.31±1.15)％、(21.86±5.31)％、(32.05±2.99)％、(37.28±3.21)％,且随着缺氧培养时间延长和阿维A浓度增加,对HaCaT细胞体外增殖的抑制作用逐渐增强.当阿维A浓度为10-5mol/L时,HIF-1α蛋白的表达由1.196±0.088降至0.319±0.180(P＜ 0.05),而HIF-1α mRNA表达水平无明显下降;VEGF mRNA的表达由1.108±0.073降至0.442±0.090(P＜ 0.05),VEGF蛋白的表达则由1.174±0.186降至0.216±0.066(P＜ 0.05).结论 阿维A可抑制缺氧培养的HaCaT细胞体外增殖,并在蛋白水平下调HIF-1α及VEGF的表达,在mRNA水平下调VEGF的表达.     

葡萄籽提取物原花青素对UVA照射HaCaT细胞表达AQP3、Caspase-14和BH mRNA的影响

目的通过研究UVA照射前后及不同浓度葡萄籽提取物原花青素(grape-seed proanthocyanins extract,GSPE)干预的HaCaT细胞表达水通道蛋白3(AQP3)、半胱氨酸蛋白酶14(Caspase-14)和博来霉素水解酶(BH) mRNA的变化,探索GSPE是否能够修复长波紫外线引起的皮肤屏障损伤。方法实验分为五个组:空白对照组、单纯光照组(选取UVA的能量密度为25 J/cm~2)、照光联合不同浓度GSPE干预组(10、50、100μg/mL),采用RT-PCR法分别检测各组AQP3、Caspase-14和BH mRNA的表达量。结果 25 J/cm~2的UVA可以提高AQP3 mRNA表达量。GSPE药物浓度大于10μg/mL时,随药物浓度增加,可以逐渐降低光照后高表达的基因水平,并呈浓度依赖性。UVA可下调BH和Caspase-14 mRNA表达量,而GSPE可以提高光照后降低的基因表达量,且呈浓度依赖性,逐渐使其恢复正常。结论合适浓度的GSPE可以调节UVA对HaCaT细胞AQP3、Caspase-14和BH mRNA表达的影响,并使其趋于正常,推测其具有修复长波紫外线引起的皮肤屏障功能损伤的作用。     

SAA通过TLR-2/TLR-4/NF-κB通路诱导角质形成细胞IL-1β的表达

目的探讨血清淀粉样蛋白A(SAA)在体外角质形成细胞白细胞介素(IL)-1β分泌中可能的作用。方法分离培养包皮的表皮角质形成细胞,分为空白对照组和SAA不同浓度刺激组(1μg/m L、10μg/m L、100μg/m L)。分别用Real-time PCR和ELISA检测细胞中IL-1β前体mRNA和成熟IL-1β的表达。角质形成细胞在SAA(10μg/m L)存在下与同种型对照免疫球蛋白Ig G1、TLR-2抗体(10μg/m L)、TLR-4抗体(20μg/m L)或TLR-2抗体+TLR-4抗体孵育24h。RT-PCR检测IL-1βmRNA的表达。将角质形成细胞暴露SAA 15min后,通过流式细胞术测定NF-κB p65磷酸化。在存在NF-κB抑制剂Bay11-7082的情况下,以10μg/m L SAA处理正常原代角质形成细胞。24h后,RT-PCR法检测细胞IL-1βmRNA水平。结果 SAA刺激角质形成细胞中IL-1β的表达。随SAA浓度的升高IL-1β的表达也逐渐增加。角质形成细胞在SAA(10μg/m L)存在下与同种型对照免疫球蛋白Ig G1、TLR-2抗体(10μg/m L),TLR-4抗体(20μg/m L)或TLR-2抗体+TLR-4抗体孵育24h,IL-1βmRNA表达被不同程度抑制。将正常原代角质形成细胞暴露于SAA后,NF-κB p65磷酸化表达增加。在存在NF-κB抑制剂Bay11-7082的情况下,SAA诱导IL-1βmRNA的表达明显被抑制。结论 SAA在体外角质形成细胞中通过TLR-2/TLR-4/NF-κB通路诱导IL-1β表达。     

姜黄素对IL-17诱导的人表皮角质形成细胞株NF-κB活化的影响

目的探讨姜黄素对IL-17诱导的人表皮角质形成细胞株(HaCaT细胞株)核转录因子NF-κB活化的影响,为其对某些炎症性皮肤病的治疗提供一定的理论依据。方法用IL-17刺激HaCaT细胞不同时间(0h,0.5h,1h,2h),或用姜黄素不同浓度(2.5μmol/L,5μmol/L,10μmol/L)预处理1h后,加入IL-17刺激2h,应用ELISA法结合捕获探针检测各组的NF-κBp65的DNA结合活性。提取IL-17刺激后不同时间点各组以及10μmol/L浓度姜黄素预处理组核蛋白,Westernblot方法检测各组NF-κBp65蛋白的表达。结果 IL-17能够有效地增加HaCaT细胞NF-κBp65的DNA结合活性及核蛋白表达。加入姜黄素共培养后,各浓度处理组的NF-κBp65DNA结合活性均下降(P<0.01),10μmol/L姜黄素处理引起NF-κBp65的蛋白表达水平明显下降(P<0.01)。结论姜黄素能够有效抑制IL-17诱导的HaCaT细胞NF-κBp65的DNA结合活性以及核蛋白的表达,从而抑制NF-κB的活化。     

EGCG对中波紫外线诱导HaCaT细胞p53基因和蛋白表达的实验研究

目的:研究表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对中波紫外线(UVB)照射诱导永生化角质形成细胞株-HaCaT细胞的p53 mRNA和p53蛋白表达的影响。方法:以一定剂量UVB照射HaCaT细胞,并以200μg/mL EGCG处理照射后的HaCaT细胞,分别用RT-PCR法和Western blot方法检测各处理条件下p53 mRNA和/或p53蛋白的表达水平。结果:30 mJ/cm2的UVB照射后HaCaT细胞的p53 mR-NA和p53蛋白表达逐渐增加,4 h达到峰值,4 h后随照射剂量增加而增加,24 h后有所恢复;加入EGCG可下调UVB诱导的表达作用。结论:UVB照射对HaCaT细胞p53 mRNA和p53蛋白的诱导表达有时效性与量效性,EGCG可下调UVB照射的这种诱导作用。     

葫芦素Ⅰ对HaCaT细胞体外增殖及对角蛋白17、STAT3、VEGF表达的影响

目的 探讨葫芦素Ⅰ对HaCaT细胞体外增殖及角蛋白17(K17)、信号转导及转录激活子3(STAT3)、血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响.方法 采用不同浓度葫芦素Ⅰ(0.0125、0.025、0.05、0.1μmol/L)、含与0.1 μmol/L葫芦素Ⅰ等体积DMSO的DMEM培养液(溶媒组)、DMEM培养液(阴性对照组)、10 nmol/L卡泊三醇(阳性对照组)分别作用于HaCaT细胞.采用CCK8法检测葫芦素Ⅰ作用12、24、36 h后对HaCaT细胞体外增殖的影响,RT-PCR法检测葫芦素Ⅰ作用24 h对HaCaT细胞K17和VEGF mRNA表达的影响,Western印迹法检测葫芦素Ⅰ作用24h对HaCaT细胞K17、STAT3、磷酸化STAT3(P-STAT3)和VEGF蛋白表达的影响.结果 0.0125 μmol/L葫芦素Ⅰ作用12h即开始表现出对HaCaT细胞体外增殖的抑制作用,当葫芦素Ⅰ浓度增加到0.1 μmol/L时,24h和36h的抑制率分别为43.00％±2.11％和48.98％±2.27％.与阴性对照组相比,各浓度葫芦素Ⅰ组对HaCaT细胞体外增殖均有抑制作用(均P＜ 0.05),且该抑制作用随葫芦素Ⅰ浓度的增加及作用时间的延长逐渐增强.不同浓度葫芦素Ⅰ作用于HaCaT细胞24 h后,K17 mRNA及其蛋白、P-STAT3蛋白、VEGF mRNA及其蛋白表达量均随葫芦素Ⅰ浓度的增加而降低,差异有统计学意义(均P＜ 0.05).结论 葫芦素Ⅰ可抑制HaCaT细胞的体外增殖,并可在mRNA水平下调K17、VEGF的表达,在蛋白水平下调K17、P-STAT3、VEGF的表达.     

本维莫德对HaCaT细胞增殖、炎症因子分泌及皮肤屏障因子产生的影响

【摘要】 目的 研究本维莫德对人角质形成细胞增殖、炎症细胞因子分泌、皮肤屏障蛋白合成以及信号转导与转录激活蛋白1（STAT1）磷酸化的影响。方法 体外培养HaCaT细胞,采用0.1 ~ 1 000 μmol/L本维莫德处理24 h,用CCK8法检测细胞增殖。部分HaCaT细胞分为6组,对照组仅加入DMEM培养基,刺激剂组加入10 μg/L肿瘤坏死因子α（TNF-α）和干扰素γ（IFN-γ）,本维莫德组加入10 μg/L TNF-α和IFN-γ以及终浓度为1 ~ 10或1 ~ 100 μmol/L本维莫德,AhR拮抗剂组加入10 μg/L TNF-α和IFN-γ、10或100 μmol/L本维莫德以及10 nmol/L StemRegenin1（SR1）,处理24 h后,酶联免疫吸附实验检测细胞培养上清液中白细胞介素（IL）-4、IL-10、IL-22和胸腺活化调节趋化因子（TARC）的水平,RT-PCR检测HaCaT细胞芳香烃受体（AhR）、细胞色素P450 1A（CYP1A1）、聚丝蛋白、内披蛋白、胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP）和TARC mRNA的表达水平,Western印迹法检测聚丝蛋白、内披蛋白、TSLP和STAT1及磷酸化STAT1（p-STAT1）的蛋白表达水平,免疫荧光检测本维莫德对HaCaT细胞中AhR核转位的影响。计量资料采用非配对Student t检验和单因素方差分析进行比较,Spearman检验分析各指标间的关系。结果 0.1、1、10、100、1 000 μmol/L本维莫德干预HaCaT细胞24 h后,细胞存活率分别为（90.2 ± 2.4）%、（85.4 ± 11.9）%、（52.8 ± 14.0）%、（39.4 ± 7.9）%、（27.5 ± 3.4）%,各组间差异有统计学意义（F = 162.5,P < 0.001）,50%抑制浓度为48.54 μmol/L。与刺激剂组相比,10和100 μmol/L本维莫德组HaCaT细胞分泌的IL-10水平上升（F = 16.110,P < 0.001）,但100 μmol/L组IL-22（F = 6.884,P < 0.001）和10、100 μmol/L组 TARC水平（F = 7.052,P < 0.001）显著下降。与刺激剂组相比,1 和10 μmol/L本维莫德组CYP1A1 mRNA表达（P = 0.004）和10 μmol/L本维莫德组FLG mRNA表达（P = 0.040）水平显著增高,而10 μmol/L组 TARC mRNA和10 μmol/L组TSLP mRNA表达显著降低（均P < 0.01）,而刺激剂组和本维莫德组间AhR mRNA的表达差异无统计学意义（P = 0.193）。与刺激剂组相比,10 μmol/L本维莫德组聚丝蛋白（P = 0.020）和1、10 μmol/L本维莫德组内披蛋白表达水平（P < 0.001）显著上升,而10 μmol/L TSLP蛋白表达水平显著下降（P < 0.001）,1和10 μmol/L本维莫德组p-STAT1蛋白表达水平显著下降（P < 0.001）。与100 μmol/L 本维莫德组相比,AhR拮抗剂组IL-10分泌水平显著下降（t = 4.794,P = 0.003）,TSLP mRNA的表达显著上升（t = 3.769,P = 0.005）;与10 μmol/L 本维莫德组相比,AhR拮抗剂组 IVL蛋白表达显著下降（t = 5.117,P = 0.002）,TSLP蛋白表达显著上升（t = 3.117,P = 0.043）, p-STAT1蛋白表达无明显变化（t = 1.400,P = 0.719）。免疫荧光染色显示对照组和1 μmol/L本维莫德组中AhR绿色荧光主要表达于HaCaT细胞胞质中,细胞核中基本无荧光表达;而在10 μmol/L和20 μmol/L本维莫德组HaCaT细胞的细胞质和细胞核均可见高密度绿色荧光。结论 本维莫德可通过活化AhR信号通路抑制HaCaT细胞增殖,调节炎症因子分泌,上调皮肤屏障相关因子的产生和抑制STAT1磷酸化。     

喜树碱对HaCaT细胞自噬的影响

目的 探讨喜树碱对HaCaT细胞自噬的影响.方法 将HaCaT细胞分为对照组和实验组,对照组用0.1％二甲基亚砜处理,实验组分别用5、10、25、50、100、200 nmol/L浓度的喜树碱处理.不同浓度喜树碱作用于HaCaT细胞24、48 h,用CCK8法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测药物作用24 h后细胞凋亡情况,免疫印迹法检测自噬相关微管相关蛋白1轻链3(LC3)、p62的变化;选取10 nmol/L喜树碱作用于HaCaT细胞24 h,间接免疫荧光法检测细胞自噬蛋白LC3的变化.结果 5、10 nmol/L喜树碱对HaCaT细胞增殖、凋亡无显著影响,50、100、200 nmol/L喜树碱作用HaCaT细胞24 h,增殖抑制率分别为(31.23±1.00)％,(54.21±8.10)％,(66.75±10.70)％;25、50、100、200 nmol/L喜树碱作用HaCaT细胞48 h,增殖抑制率分别为(25.81±5.99)％、(44.35±5.32)％、(65.81±8.28)％、(73.23±9.59)％,与同时段对照组相比,差异有统计学意义(均P＜0.001).50、100、200 nmol/L喜树碱作用HaCaT细胞24 h,凋亡率分别为(14.46±2.38)％、(19.15±1.59)％、(29.88±1.37)％,与对照组(3.80±0.13)％比较,差异有统计学意义(均P＜ 0.001).5、10 nmol/L喜树碱处理HaCaT细胞24 h后,LC3Ⅱ表达上调,p62蛋白表达下调.间接免疫荧光显示10 nmol/L喜树碱作用HaCaT细胞24h后,实验组与对照组自噬体阳性细胞百分率分别为(36.67±4.55)％、(6.23±0.92)％,两组差异有统计学意义(t=6.546,P=0.003).结论 5、10 nmol/L喜树碱可诱导HaCaT细胞发生自噬,但对细胞增殖、凋亡无影响.50、100、200 nmol/L喜树碱抑制HaCaT细胞增殖,促使细胞发生凋亡,自噬水平降低.     

长波紫外线照射和基因甲基化状态对HaCaT细胞诱导型一氧化氮合酶表达的影响

目的:研究长波紫外线(UVA)照射和基因甲基化状态改变对HaCaT细胞诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达的影响.方法:5 J/cm<'2>UVA照射HaCaT细胞后24 h、48 h和72 h及1μmol/L 5-氮杂胞苷(5-azaC)处理HaCaT细胞24 h、72 h和120 h后,采用反转录(RT)-PCR、Western blot方法和巢式聚合酶链反应(nested polymearse chain reaction,N-PCR)分别检测iNOS mRNA、蛋白和cDNA的表达情况.结果:HaCaT细胞正常对照组无iNOS mRNA、蛋白和cDNA的表达;5 J/cm<'2> UVA照射后,HaCaT细胞的iNOS mRNA、蛋白和cDNA表达在24 h时出现,48 h达高峰,且明显高于24 h(P<0.05),72 h无表达:5-azaC处理HacaT细胞24 h后,仅有iNOS cDNA表达,72 h和120 h有iNOS mRNA、蛋白和cDNA表达,且120 h表达量强于72 h(P<0.05).结论:HaCaT细胞iNOS表达与UVA照射存在一定的时间关系,iNOS基因甲基化状态的改变可以影响其表达.     

白细胞介素22诱导HaCaT细胞表达肝素结合表皮生长因子样生长因子的作用机制探讨

目的 探讨白细胞介素22（IL-22）诱导HaCaT细胞表达肝素结合表皮生长因子样生长因子（HB-EGF）的相关作用机制。 方法 用不同浓度的IL-22（12.5、25、50、100 μg/L）干预处理HaCaT细胞,对照组选择等量磷酸盐缓冲液（PBS）处理。24 h后,提取HaCaT细胞总蛋白进行蛋白免疫印迹,检测丝裂原活化蛋白激酶-细胞外信号调节激酶1/2（MAPK-ERK1/2）通路中磷酸化ERK1/2（P-ERK1/2）的表达和转录激活因子途径（JAK/STAT）中磷酸化JAK2（P-JAK2）和磷酸化STAT3（P-STAT3）的表达。将HaCaT细胞分4组,分别用PBS、IL-22、MAPK-ERK1/2抑制剂PD98059、JAK2/STAT3通路抑制剂AG490与IL-22共同干预HaCaT细胞,24 h后,提取细胞总蛋白和总mRNA,分别用蛋白免疫印迹法和实时定量逆转录（RT）-PCR法检测不同处理组HB-EGF蛋白和mRNA水平的改变。采用SPSS16.0软件进行单因素方差分析检验组间差异,Bonferroni检验进行多重比较。结果 不同浓度的IL-22干预处理后,HaCaT细胞中P-ERK1/2、P-JAK2和P-STAT3蛋白表达均高于对照组（P < 0.05）。HB-EGF蛋白水平（HB-EGF/内参照的灰度比值）在PD98059组和AG490组分别为0.183 ± 0.020和0.199 ± 0.011,与IL-22组（0.924 ± 0.032）相比,差异具有统计学意义（F值分别为37.700、36.400,均P < 0.05）。HB-EGF mRNA水平在PD98059组和AG490组分别为1.034 ± 0.072和0.989 ± 0.038,与IL-22组（1.844 ± 0.135）相比,差异具有统计学意义（F值分别为11.271、13.429,均P < 0.05）。 结论 IL-22可以引起HaCaT细胞中MAPK-ERK1/2和JAK2/STAT3这两条信号通路激活。IL-22诱导HaCaT细胞产生HB-EGF蛋白的作用机制可能与MAPK-ERK1/2和JAK2/STAT3这两条信号通路有关。     

棕榈酸对HaCaT细胞增殖及产生炎症因子的影响

目的 探讨棕榈酸对HaCaT细胞增殖及产生炎症因子的影响.方法 将不同浓度棕榈酸(0、25、50、75、100、125、150、175、200 μmol/L)刺激HaCaT细胞3～ 24h,用细胞计数试剂盒CCK8检测HaCaT细胞增殖情况.选取一定浓度棕榈酸(0、75、100、125、150 μmol/L)刺激HaCaT细胞24 h后,分别用免疫组化荧光染色法在共聚焦显微镜下观察核因子(NF)-κB p65细胞核转位情况.酶联免疫吸附试验检测细胞培养上清液中白介素6(IL-6)分泌量,实时PCR法检测过氧化物酶增殖体激活受体α(PPARα)mRNA及IL-6mRNA的表达,免疫印迹法检测PPARα、总蛋白NF-κB p65及核蛋白NF-κB p65表达量.用GraphPad Prism 5.0软件进行单因素方差分析.结果 与空白对照组相比,50～175 μmol/L棕榈酸均可刺激HaCaT细胞增殖(均P＜ 0.05).75、100、125、150 μmol/L棕榈酸可剂量依赖性增强HaCaT细胞NF-κB p65向细胞核内转位,各浓度组核蛋白的相对表达量分别为0.4536±0.0173、0.5184±0.0206、0.5333±0.0231、0.6160±0.0297,与空白对照组相比,差异有统计学意义(均P＜0.01).PPARα mRNA及其蛋白产物、IL-6 mRNA及分泌量呈剂量依赖性增加,各浓度组IL-6分泌量分别为(31.5677±0.2268)、(32.3773±0.4156)、(32.9837±0.0029)、(33.6890±0.0936) ng/L,与空白对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.05或0.01).结论 棕榈酸可促进HaCaT细胞增殖,并在一定浓度内剂量依赖性增强NF-κB核转移、IL-6及PPARα表达量,在激活和促进相关炎症因子表达中起到一定作用.