大黄素对K562/ADM细胞阿霉素耐药的抑制作用

探讨大黄素抑制人慢性粒细胞白血病细胞耐阿霉素变异株K562/ADM的药效学及作用机制。以维拉帕米为阳性药,阿霉素为工具药,采用MTT法测定大黄素与阿霉素合用对细胞增殖的抑制作用;使用流式细胞仪考察了大黄素对于阿霉素诱导K562/ADM细胞周期阻滞和凋亡的促进作用;并采用Western blot法检测了大黄素对P-gp、Bcr-Abl和STAT5蛋白表达的影响;进一步通过P-gp单克隆藻红蛋白键合UIC2抗体结合实验探讨了大黄素是否是P-gp的底物。实验结果显示,大黄素与阿霉素合用可显著抑制K562/ADM的增殖,并呈量效关系;可促进阿霉素诱导的K562/ADM细胞G₂/M期周期阻滞和细胞凋亡;不同剂量的大黄素可有效抑制P-gp、Bcr-Abl、STAT5蛋白表达及磷酸化;UIC2抗体结合实验结果则表明大黄素可能不是P-gp的底物。因此,大黄素能够在体外有效抑制K562/ADM阿霉素耐药,其机制可能不是通过底物竞争性抑制作用,而是与大黄素直接降低P-gp、Bcr-Abl及STAT5蛋白表达和磷酸化有关。     

南瓜蛋白与STI571体外联合抗K562细胞的作用

目的 探讨南瓜蛋白与ST1571对K562细胞增殖的抑制作用及其机制. 方法 用MTT检测南瓜蛋白与ST1571单用或联合作用对K562细胞增殖的抑制作用;流式细胞仪检测药物对细胞的凋亡率;Western blot检测药物对p210Bcr-Abl 蛋白的影响. 结果 南瓜蛋白与STI571联合作用协同抑制K562细胞增殖(q>1.15);协同诱导K562细胞凋亡;协同抑制p210Bcr-Abl蛋白表达. 结论 南瓜蛋白与STI571联合作用体外协同抗K562细胞的增殖.     

组蛋白去乙酰化抑制剂SBHA对急性髓细胞白血病细胞的杀伤作用

目的:观察组蛋白去乙酰化抑制剂suberic bishydroxamate( SBHA)对人急性髓系白血病(AML)细胞株的杀伤作用.方法:将不同浓度的SBHA分别作用于对数生长期的AML细胞24 h,MTT比色法检测药物对细胞的生长抑制作用;应用流式细胞术(FACS)检测细胞凋亡率,Westernblot法检测药物处理后Caspase途径和凋亡相关蛋白的改变.结果:SBHA能显著抑制AML细胞株U937ˉ、KG-1及Kasumi-1细胞的生长.AnnexinV-PI双标记法及FACS分析结果证实,SBHA能显著诱导白血病细胞的凋亡,激活Caspase-3、Caspase-9、Caspase-8,下调抗凋亡蛋白Bcl-2及Bcl-xl的表达,下调Survivin、XIAP及cIAP的表达.结论:组蛋白去乙酰化抑制剂SBHA能显著抑制人AML细胞株的增殖、促进其凋亡,对凋亡相关蛋白的调控是其作用机制之一.     

Aurora激酶抑制剂ENMD-2076对人急性髓系白血病细胞的杀伤作用

目的:观察Aurora激酶抑制剂ENMD-2076对人急性髓系白血病(AML)细胞株的杀伤作用.方法:将不同浓度的ENMD-2076分别作用于对数生长期的AML细胞24 h、48 h,采用MTT比色法检测药物对细胞的生长抑制作用;应用Hoechst荧光染色法检测细胞凋亡率,Western blot法检测药物处理后Caspase途径和凋亡相关蛋白的改变.结果:ENMD-2076能显著抑制AML细胞株THP-1和Kasumi-1的生长(P ＜0.001),24 h时对THP-1和Kasumi-1的半数抑制浓度分别是9.32μmol/L和7.23 μmol/L.Hoechst荧光染色证实ENMD-2076能使THP-1细胞发生染色质浓缩等凋亡改变.Western blot检测证实,ENMD-2076能激活Caspase-3、Caspase-9、Caspase-8和PARP,上调促凋亡蛋白Bak、Bax、Bad和Bim,下调抗凋亡蛋白Mcl-1的表达.结论:Aurora激酶抑制剂ENMD-2076能显著抑制人AML细胞株THP-1和Kasumi-1的增殖并促进其凋亡,对凋亡相关蛋白的调控是其作用机制之一.     

隐丹参酮联合顺铂作用于非小细胞肺癌PC9细胞的体外研究

目的 研究隐丹参酮(cryptotanshinone,CPT)与顺铂(cisplatin,DDP)联合作用于非小细胞肺癌PC9细胞具有协同抗肿瘤作用及其可能的分子机制,为隐丹参酮联合顺铂应用于临床提供理论依据。方法 肺癌PC9细胞分为对照组、隐丹参酮组、顺铂组及联合用药组,MTT法检测和免疫印迹技术检测细胞增殖凋亡,免疫印迹技术、RT-PCR检测抗凋亡分子的表达、STAT3及上游调控激酶JAK2/SRC蛋白表达水平及磷酸化水平。结果 隐丹参酮联合顺铂明显抑制肺癌PC9细胞的增殖作用(P＜0.05),联合用药组作用于肺癌PC9细胞24h后,caspase 3和caspase 9及PARP剪切段蛋白表达明显增高,高于对照组及单药组,联合用药后Mcl-1、Bcl-2、XIAP、survivin抗凋亡蛋白表达下调, STAT3磷酸化Tyr₇₀₅和ser₇₂₇水平下降,其上游JAK2磷酸化水平下调,SRC蛋白及磷酸化水平变化不明显。结论 隐丹参酮与顺铂具有协同抗肺癌PC9细胞的作用,其作用机制为通过抑制STAT3磷酸化Tyr₇₀₅和ser₇₂₇表达水平进而下调Mcl-1、Bcl-2、XIAP、Survivin蛋白的表达及上调caspase 3和caspase 9及PARP剪切段蛋白表达。     

As2O3联用华蟾素对K562细胞Bcr-Abl磷酸化的影响

目的 研究As2O3联用华蟾素对K562细胞Bcr-Abl蛋白酪氨酸磷酸化的影响,探讨其抗白血病的分子机制,为As2O3和华蟾素联合应用治疗CML提供理论依据。方法 采用细胞增殖实验检测细胞生长;采用Annexin-V/PI双染实验、DNA PI染色及DNA电泳等方法测定细胞凋亡;运用Western blot检测K562细胞Bcr-Abl蛋白酪氨酸磷酸化水平。结果 在As2O3和华蟾素作用下K562细胞生长受抑伴随活力下降,1.0μmol/L As2O3、0.125μg/mL华蟾素、0.25μg/mL华蟾素、1.0μmol/L As2O3+0.125μg/mL华蟾素、1.0μmol/L As2O3+0.25μg/mL华蟾素作用K562细胞24h和48h后,增殖抑制率分别为(24±1.3)％、(21±1.5)％、(38±3.1)％、(57±2.7)％、(66±3.3)％及(49±2.9)％、(48±2.7)％、(61±2.1)％、(77±3.8)％、(82±4.2)％,细胞凋亡率分别为(4.8±0.5)％、(5.6±0.7)％、(9.8±0.6)％、(11.9±1.2)％和(15.2±1.5)％及(11.0±0.9)％、(12.9±1.1)％、(18.4±1.5)％、(21.0±2.0)％、(28.0±1.9)％,凋亡细胞百分率呈时间剂量依赖关系;DNA电泳出现“梯”状条带;Bcr-Abl蛋白酪氨酸磷酸化水平出现时间剂量依赖性下调。结论 As2O3和华蟾素能诱导K562细胞凋亡和抑制其增殖,两药联用具有协同作用,机制与下调K562细胞Bcr-Abl蛋白酪氨酸磷酸化有关。     

SN-38对K562细胞的增殖抑制、凋亡诱导及其与塞来昔布联合化疗的协同作用

目的观察SN-38对慢性粒细胞白血病(CML)急变细胞株K562增殖抑制及凋亡诱导作用,并探讨其作用机制及与塞来昔布联合化疗的协同作用。方法采用CCK-8法检测细胞增殖抑制率;流式细胞仪以AnnexinⅤ/PI双标记法检测细胞凋亡,PI单染法检测细胞周期;特异性荧光底物检测Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活性;Western blot法检测凋亡相关蛋白表达变化。以CalcuSyn药效学软件计算联合指数(CI),评价SN-38与塞来昔布对K562细胞的联合效应。结果 SN-38对K562细胞具有时间和浓度依赖性的增殖抑制作用,SN-38可以诱导K562细胞凋亡,伴随G2/M期细胞比例持续下降,Caspase-3、Caspase-8及Caspase-9活性以时间依赖方式升高,并显著下调K562细胞的Survivin蛋白表达。SN-38与塞来昔布联合化疗后,K562细胞增殖抑制率较两单药组明显增强;两药在低浓度时具有剂量依赖的协同效应(Fa<0.87)。结论 SN-38体外抑制K562细胞增殖并诱导其凋亡,其机制可能通过下调Survivin表达,并激活Caspase有关。SN-38与塞来昔布联合应用对K562细胞具有剂量依赖的协同细胞毒效应。     

硫利达嗪增强伊马替尼对慢性粒细胞白血病细胞 K562的抑制作用及机制

目的：观察硫利达嗪（THZ）、伊马替尼（IM）单药及联合对人慢性粒细胞白血病（CML）细胞 K562的诱导作用,并探讨其机制。方法采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定THZ、IM单药及联合对细胞的抑制作用,计算两药协同指数（CI）。检测 THZ、IM单药及联合对细胞凋亡的影响。West-ern blot 法检测凋亡蛋白 Cleaved-Bid、Procaspase 3,凋亡调节蛋白 Bcl-2、Bax、pPI3K、pAKT 表达的变化。结果 THZ 16μmol／L 作用24 h 后 K562细胞增殖明显抑制,低剂量细胞毒性作用不明显。IM低剂量即有较强的细胞毒性作用,两药联合后经计算有较好的协同作用。根据 CI 值选定药物浓度作用 K562细胞24 h,流式细胞术结果显示,THZ 单药组无明显细胞凋亡,IM单药组、IM联合 THZ 组均存在不同程度的细胞凋亡,与对照组比较差异有统计学意义（P ＜0．01）。Western blot 法结果显示各实验组细胞胞内 Cleaved-Bid 表达量增加,Procaspase 3表达量下降。抗凋亡蛋白 Bcl-2、pPI3K、pAKT 下调、促凋亡蛋白 Bax 表达明显上调,各实验组与对照组比较,差异有统计学意义（P ＜0．01）。结论低剂量 THZ 联合 IM对 CML 细胞 K562具有显著的增殖抑制作用,其作用较 IM单用作用强,THZ 有明确增敏 IM的作用。与 IM、THZ 单药组比较,IM联合 THZ 组 Cleaved Bid 表达量上调、Procaspase 3表达量下降,其杀伤机制可能与线粒体通路及抑制 PI3K-AKT 通路均有关。     

人参多糖对人白血病细胞株K562细胞信号转导的调控

目的：研究人参多糖（GPS）对人红白血病细胞株（K562）信号转导的调控.方法：采用细胞体外培养技术,免疫细胞化学、Western Blot检测GPS诱导后K562细胞蛋白酪氨酸激酶JAK2、核因子NF-κBp65和信号传导及转录激活因子5（STAT5）的表达,免疫沉淀法检测GPS对K562细胞JAK2磷酸化的影响,RT-PCR技术检测GPS诱导后K562细胞c-myc,p53表达的变化.结果：免疫细胞化学和WesternBlot检测GPS诱导后K562细胞,JAK2蛋白表达明显增强,随着剂量的加大、时间的延长更加明显[（12.33±2.05）vs（88.18±13.57）];NF-κBp65[（79.48±9.56）vs（6.98±1.45）]和STAT5[（71.56±16.28）vs（10.23±2.16）]蛋白表达明显减弱;GPS（40mg/L）作用K562细胞6d后,加入GM-CSF继续刺激5～10min,JAK2酪氨酸磷酸化增强,而刺激20min后JAK2酪氨酸磷酸化明显减弱.GPS（40mg/L）诱导K562细胞3,6d后,c-myc mRNA明显减弱[（196±12）vs（136±11）],而p53mRNA无明显变化[（202±16）vs（181±16）].结论：GPS激活了酪氨酸蛋白激酶JAK2,促进其磷酸化,同时抑制STAT5,NF-κB信号转导途径,下调原癌基因c-myc表达,促进K562细胞凋亡与分化.     

藤黄酸下调Bcr-Abl蛋白对慢粒细胞株K562增殖和凋亡的影响

目的 研究藤黄酸对人慢性粒细胞性白血病细胞株K562抑制增殖及诱导凋亡的作用,并探讨其可能作用机制。 方法 用藤黄酸处理K562细胞,采用MTS法和台盼兰计数法测定细胞活力及增殖;碘化丙啶(PI)单染荧光显微镜观察细胞形态改变;采用AnnexinV-FTIC/PI流式细胞术检测细胞凋亡;利用Western blotting检测凋亡相关蛋白及细胞增殖信号通路的变化情况。 结果 藤黄酸对K562细胞的增殖抑制作用呈时间和浓度依赖性(P<0.05)。藤黄酸处理后的细胞,经PI染色,荧光显微镜下观察可见死亡细胞形态发生改变,细胞核红染。流式细胞术检测显示加药处理组细胞以凋亡方式为主,凋亡率比对照组明显升高(P<0.05)。Western blotting检测发现凋亡相关蛋白激活,Bcr-Abl及下游的信号通路受到不同程度的抑制(P<0.05)。结论 藤黄酸对K562细胞具有凋亡诱导和增殖抑制作用,作用机制与caspase系统激活和Bcr-Abl增殖相关通路受抑有关。     

高三尖杉酯碱对人急性髓系白血病干细胞的杀伤作用

目的:观察高三尖杉酯碱(HHT)对人急性髓系白血病(AML)干细胞的杀伤作用,探讨其分子学机制。方法:用流式细胞仪(FACS)分析AML细胞株白细胞干细胞(LSC)的表型特征,用MTT法检测HHT对具有LSC特征的KG-1细胞的生长抑制作用,用FACS观察HHT对CD34+CD38-CD96+的KG-1细胞数量的影响,Western blot法检测药物处理后Caspase途径和凋亡相关蛋白的改变。结果:KG-1和Kasumi-1细胞CD34+CD38-CD96+分别为69%和26.7%,U937细胞不表达CD96。HHT能显著抑制KG-1细胞的生长,并呈剂量依赖性(r2=0.9971,P<0.05)。48 h的半数抑制浓度为16.9 ng/ml。HHT作用KG-1细胞后,CD34+CD38-CD96+细胞的比例从63.6%下降到17.1%。HHT能显著激活Caspase-3、Caspase-9和PARP,抑制磷酸化Akt和Bcl-2的表达。结论:HHT能显著抑制人AML细胞KG-1的增殖,减少CD34+CD38-CD96+白血病干细胞数量;对Akt活性和Bcl-2的调控可能是其重要的作用机制。     

STAT5-ROS信号通路介导K562细胞伊马替尼耐药的机制研究

目的 探讨信号转导与转录因子5-氧化物(STAT5-ROS)细胞信号转导通路在慢性髓细胞白血病细胞(K562)伊马替尼(IM)耐药中的作用机制.方法 以浓度递增的方法诱导K562对IM产生耐药, CCK-8法检测其耐药性.RT-PCR方法定量测定K562/G细胞中STAT5A和STAT5B mRNA表达.流式细胞术测定ROS和细胞凋亡水平.Western blot法检测细胞中总STAT5和p-STAT5蛋白表达.结果 实验成功诱导K562/G耐药细胞,CCK-8法测定耐药倍数为80倍.细胞生长曲线显示20 μmol/L IM作用于K562/G细胞48 h,活细胞数量减半.0.1 μmol/L IM作用于K562细胞24 h,活细胞数量几乎为零.流式细胞检测K562/G细胞内ROS水平明显高于K562细胞(P=0.000 1),相同浓度IM作用于两株细胞相同时间,K562/G细胞凋亡比例低于K562(P<0.05).RT-PCR结果显示K562/G细胞中STAT5A和STAT5B水平均高于K562(P=0.000 1、0.017 0).Western blot结果表明K562/G细胞中STAT5蛋白水平显著升高(P=0.009 0).结论 STAT5在慢性髓细胞白血病中高表达,STAT5-ROS通路的活化与K562细胞IM耐药密切相关.     

Herbimycin A enhances apoptotic effect of chemotherapeutic drugs on K562 cells

OBJECTIVES: To explore the anti-apoptotic mechanism and the effective apoptosis-inducing method in chronic myelogenous leukemia (CML) cells. METHODS: K562 cell line was used to observe the effect of combination of herbimycin A (HMA), a tyrosine kinase inhibitor, and chemotherapeutic agents on the induction of apoptosis. RESULTS: HMA or chemotherapeutic agents could inhibit the proliferation but not significantly induce apoptosis of K562 cells. However, HMA significantly enhanced apoptosis when combined with chemotherapeutic agents. Addition of sulfhydryl compound to the cultures to conjugate HMA completely abrogated this enhancing effect on K562 cells. CONCLUSIONS: HMA increases the sensitivity of CML cells to chemotherapeutic agents by inactivating tyrosine kinase activity. It is promising that combination of HMA with conventional chemotherapeutic drugs may be a new strategy in the treatment of CML.     

小檗胺对慢性粒细胞白血病细胞抑制作用的机制研究

目的:探讨小檗胺诱导慢性粒细胞白血病细胞株K562细胞凋亡的机制.方法:体外培养K562细胞株细胞,经8 μg/ml小檗胺处理不同时间后用Western blot检测细胞内总NF-κB、核内NF-κB和IκBα、pIκBα、IKKα、A20蛋白表达.结果:随着小檗胺处理时间的延长,细胞内总NF-κB无变化,但核内的NF-κB表达下降,半定量比值从处理前的59.2%,随着作用时间的延长,逐步下降为31.4%,19.7%,4.1%,0%.同时出现pIκBα、IKKα表达下调,A20表达增高.结论:小檗胺通过NF-κB途径诱导慢性粒细胞白血病细胞株K562细胞凋亡的机制,可能涉及抑制NF-κB的核转位和转激活,推测其作用与小檗胺降低K562细胞bcr-abl基因的表达有关.     

硼替佐米对伊马替尼耐药细胞株K562的凋亡作用及机制

目的 探讨硼替佐米对伊马替尼耐药细胞株K562(K562R)的诱导凋亡作用及机制.方法 采用浓度梯增法建立耐伊马替尼K562细胞系.应用CCK-8法检测不同浓度硼替佐米分别作用K562和K562R细胞24 h、48 h后,对细胞的增殖抑制的效果.使用流式细胞术方法分别检测硼替佐米单独或联合伊马替尼作用于K562R细胞48 h后的细胞凋亡.应用Western blotting检测不同浓度硼替佐米作用K562R细胞48 h后,Mcl-1、Bcl-2、Bcr/Abl蛋白表达的异同.结果 成功将对伊马替尼敏感的K562细胞诱导为K562R,耐药倍数为31.8;硼替佐米对K562及K562R细胞的增殖抑制呈浓度、时间依赖(P均<0.05);随着硼替佐米浓度增加,对K562R细胞的诱导凋亡作用增强,且硼替佐米与伊马替尼联合具有协同作用(P<0.05);硼替佐米可抑制K562R细胞Mcl-1,Bcr/Abl蛋白的表达,Bcl-2无变化.结论 硼替佐米具有对K562R细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用,其机制可能与下调K562R细胞Bcr/Abl和MCL-1的表达以及促进MCL-1发生切割有关.