蛋白激酶C-δ在热诱导舌鳞癌Tca8113细胞凋亡中的作用研究

目的 探讨热诱导舌鳞癌Tca8113细胞凋亡过程中蛋白激酶C-δ(PKC-δ)的作用.方法 应用PKC-δ活化抑制剂Rottlerin和等体积的Rottlerin溶剂二甲基亚砜(DMSO)分别预处理Tca8113细胞30min后,43℃水浴法热诱导Tca8113细胞0、40、80、120 min,流式细胞仪检测细胞凋亡率、线粒体膜电位强度变化,酶标仪比色法检测Caspase-3活性,Western杂交分析PKC-δ的活化.结果 Rottlerin抑制热诱导的PKC-δ裂解活化;抑制热诱导Tca8113细胞凋亡、降低线粒体膜电位及Caspase-3活性.相同40、80、120 min加热时间,经Rottlerin与未经Rottlerin预处理的Tca8113细胞相比,两者凋亡率、线粒体膜电位及Caspase-3活性在统计学上有显著性差异(P<0.01)..结论 活化的PKC-8可促进热诱导Tca8113细胞凋亡,PKC-δ裂解活化是热诱导Tca8113细胞凋亡的机制之一.     

蛋白激酶C-δ在热诱导舌鳞癌Tca8113细胞凋亡中的作用研究

目的探讨热诱导舌鳞癌Tca8113细胞凋亡过程中蛋白激酶C-δ（PKC-δ）的作用。方法应用PKC-δ活化抑制剂Rottlerin和等体积的Rottlerin溶剂二甲基亚砜（DMSO）分别预处理Tca8113细胞30 min后,43 ℃水浴法热诱导Tca8113细胞0、40、80、120 min,流式细胞仪检测细胞凋亡率、线粒体膜电位强度变化,酶标仪比色法检测Caspase-3活性,Western杂交分析PKC-δ的活化。结果Rottlerin抑制热诱导的PKC-δ裂解活化;抑制热诱导Tca8113细胞凋亡、降低线粒体膜电位及Caspase-3活性。相同40、80、120 min加热时间,经Rottlerin与未经Rottlerin预处理的Tca8113细胞相比,两者凋亡率、线粒体膜电位及Caspase-3活性在统计学上有显著性差异（P<0.01）。结论活化的PKC-δ可促进热诱导Tca8113细胞凋亡,PKC-δ裂解活化是热诱导Tca8113细胞凋亡的机制之一。     

腺病毒介导nm23-H1基因在Tca8113细胞中表达的实验研究

目的:利用人nm23-H1基因重组腺病毒转染Tca8113细胞,检测nm23-H1基因在Tca8113细胞中的表达。方法:制备人nm23-H1基因重组腺病毒并转染人舌癌Tca8113细胞系,采用Western blotting、免疫荧光法、免疫组化法和流式细胞术检测nm23-H1基因的表达。结果:Western blotting、免疫荧光法、免疫组化法和流式细胞术均检测到nm23-H1在Tca8113细胞中的表达,表达产物主要存在于细胞质中。结论:重组腺病毒载体Ad-nm23-H1成功介导了Tca8113细胞内nm23-H1基因的表达,为肿瘤的基因治疗提供了依据。     

nm23-h1基因对口腔鳞癌细胞增殖及PKC-α表达的影响

目的探讨nm23-h1基因对口腔鳞癌细胞增殖的影响及可能机制。方法检测6个口腔鳞癌细胞系中nm23．h1的表达水平;挑选nm23-h1表达量最少、绿色荧光报告基因质粒转染效率最高的细胞系,瞬时转染pCMV—nm23．hl质粒,MTT法检测转染的细胞增殖活性;应用实时定量PCR检测nm23-h1功能相关基因PKC-α的表达。结果在Tca8113、Tb、Tca8113M、TSCC、OSC-4、Tca8113／CDDP6个口腔鳞癌细胞系中,高转移细胞系Th、Tca8113M的nm23-h1表达量最低。Th细胞转染pCMV—nm23-h1后,细胞增殖速度减慢,为对照组的79．69％（P〈0．01）;过表达nm23-h1的Th细胞PKC-α的mRNA表达量增加,为对照组的1．52倍（P〈0．01）。结论nm23-h1基因过表达能抑制口腔鳞癌细胞的增殖,该作用可能与PKC-α相关的信号通路有关。     

VEGF靶向RNA干扰质粒构建及其对人舌鳞癌Tca8113细胞的影响

目的：用RNA干扰技术阻断人舌鳞癌系Tca8113细胞中VEGF基因的表达,观察细胞增殖及凋亡特征。方法：检测人舌鳞癌系Tca8113细胞中血管内皮生长因子VEGF表达水平;采用真核转录质粒pRNA-U6.1/Neo构建针对VEGF基因的重组转染质粒。将4种不同序列的VEGF-shRNAV1、VEGF-shRNAV2、VEGF-shRNAV3、VEGF-shRNAV4质粒以及含与VEGF无关序列的VEGF-shRNAVc和空白质粒VEGF-shRNAU6分别转染Tca8113细胞,48h后检测其VEGF表达水平,筛选稳定转染RNAi-VEGF的细胞;CCK8检测其增殖能力;流式细胞仪检测其细胞周期;Anexin-V-PI检测其凋亡特征。结果：RT-PCR和Western blot检测：Tca8113细胞阳性表达VEGF;用Lipofectamine 2000成功将不同VEGF片段的质粒转染入Tca8113细胞;RT-PCR发现,VEGF-shR-NAV2组细胞VEGF表达被显著抑制,用400ng/mLG418压力筛选获得VEGF稳定被抑制的细胞系;CCK8检测各组Tca8113细胞增殖见VEGF-shRNAV2组增殖能力小于VEGF-shRNAVc组和VEGF-shRNAU6组;转染VEGF-shRNAV2的Tca8113细胞G0-G1期细胞较VEGF-shRNAVc组和VEGF-shRNAU6组高,且细胞凋亡多。结论：用RNA靶向干扰能明显降低人舌鳞癌Tca8113细胞内VEGF的表达并抑制肿瘤细胞增殖及促进凋亡。     

高温对人舌鳞癌细胞中nm23-H1基因表达影响的实验研究

目的 研究高温治疗癌症与转移抑制基因nm23-H1之间的关系,探讨高温抑制肿瘤细胞侵袭及转移的机理.方法 对人舌鳞癌Tca8113细胞行体外43℃加温,采用电镜、免疫组织化学及流式细胞术等方法,分析加热后舌癌细胞超微结构的变化及nm23-H1表达量的改变.结果 加温使Tca8113细胞中细胞器增多,形态趋向良性分化.在加热43℃时随加热时间延长,细胞中nm23-H1表达量增加,在加热30 min时达到最高,此变化不随加热后培养时间的增加而改变.结论 高温能使肿瘤细胞中nm23-H1表达量增加,并使细胞形态出现一定分化,从而抑制肿瘤细胞的侵袭、转移能力.43℃加热30 min可能是临床治疗舌鳞癌的理想位点.     

Fas基因转染对舌鳞癌细胞系Tca8113凋亡的影响

目的探讨外源性Fas基因介导舌鳞癌细胞凋亡的可行性及其可能的分子机制。方法脂质体法将重组人Fas真核表达载体转染人舌鳞癌细胞系Tca8113，抗Fas单克隆抗体诱导其凋亡，Western blotting检测转染前后Tca8113细胞Fas蛋白表达水平，TUNEL法检测转染前后细胞凋亡水平。结果转染后Tca8113细胞Fas蛋白表达上调；抗Fas单克隆抗体可诱导Tca8113细胞凋亡，凋亡指数升高。结论上调Fas基因表达及应用抗Fas单克隆抗体可诱导肿瘤细胞凋亡，有可能作为肿瘤基因治疗的新途径。     

TGF-β1/iNOS在Tca8113细胞系中的表达

目的:探讨转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitricoxide synthase,iNOS)在舌鳞癌细胞株Tca8113中的表达,为进一步研究TGF-β1和iNOS在舌鳞癌浸润转移中的作用提供实验依据。方法:应用SP免疫组化方法和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法,对舌鳞癌细胞株Tca8113中TGF-β1和iNOS的蛋白、mRNA表达情况进行检测。结果:SP免疫组化检测到TGF-β1/iNOS蛋白在舌鳞癌Tca8113细胞胞浆中呈强阳性表达,RT-PCR检测到舌鳞癌Tca8113细胞株中TGF-β1/iNOS的mRNA条带明显。结论:TGF-β1/iNOS的蛋白和mRNA在舌鳞癌Tca8113细胞株中同时呈高水平表达。     

放射诱导启动子介导CDglyTK基因治疗Tca8113细胞的实验研究

目的 观察人工放射诱导启动子介导CDglyTK双自杀融合基因治疗Tca8113细胞的疗效,为舌鳞癌治疗探索新的途径。方法 构建人工放射诱导启动子调控双融合自杀基因的真核表达质粒pcDNA3.1（+）/E-CDglyTK,用脂质体为载体转染Tca8113细胞后予以3 Gy诱导放疗,描绘细胞生长曲线,RT-PCR检测CDglyTK的表达,流式细胞仪检测细胞的凋亡和增殖。结果 诱导放疗可显著增强双自杀基因CDglyTK对Tca8113细胞的毒性作用;RT-PCR半定量分析诱导放疗增强了CDglyTK基因的mRNA表达;流式细胞检测发现治疗组细胞的凋亡指数明显高于对照组,而增殖指数则低于对照组,诱导放疗显著提升了这种差距。结论 人工合成放射诱导启动子可作为基因治疗中的分子开关调节CDglyTK基因在Tca8113细胞中靶向表达。低剂量放射性照射可显著提高放射诱导启动子调控的CDglyTK基因治疗Tca8113细胞的疗效。     

nm23-H1转染Tca8113细胞后稳定表达细胞株的建立

目的:建立稳定高表达nm23-H1的细胞株。方法:将nm23-H1真核表达质粒转化大肠杆菌,制备感受态细菌。提取质粒,酶切琼脂糖电泳对质粒进行鉴定。脂质体介导将质粒转染人舌鳞癌细胞株Tca8113,G418持续筛选5周,对获得的细胞株进行免疫组化、Western-blott和流式细胞仪鉴定。结果:酶切琼脂糖电泳证实插入nm23-H1片段长度为986bp,质粒片段长度为6550bp,nm23-H1的cDNA被插入在pCMV-Bam-Neo中的BamH1区域。免疫组化、Western-blott和流式细胞仪鉴定表明nm23-H1高表达。结论:成功建立稳定高表达nm23-H1的细胞株。     

口腔鳞状细胞癌Tca8113细胞中透明质酸酶的表达及意义

目的 探讨口腔鳞状细胞癌(OSCC)Tca8113细胞中透明质酸(HAase)表达及意义.方法 以正常人牙龈上皮细胞作对照,采用RT.PCR、免疫荧光技术检测人OSCC Tea8113细胞株中HAase的mRNA水平及其蛋白表达.结果 HAase主要在Tca8113细胞和正常上皮细胞胞浆内表达;HAase mRNA的半定量检测表明,Tea8113细胞内HAase的表达强度比相对应的正常牙龈上皮细胞内HAase的表达强度显著增高,差异有统计学意义.结论 细胞胞浆中HAase的表达水平可能与细胞的恶变有关.     

聚乙二醇-聚谷氨酸纳米微球介导双自杀基因对Tca8113细胞的杀伤作用

目的:观察聚乙二醇-聚谷氨酸(PEG-PBLG)纳米微球介导双融合自杀基因CDglyTK对舌鳞癌Tca8113细胞的杀伤作用,为口腔鳞癌的治疗探索新的途径和方法。方法:以PEG-PBLG纳米微球为载体介导携双自杀基因CDglyTK的真核表达质粒pcDNA3.1( )-CDglyTK转染Tca8113细胞,通过RT-PCR检测CDglyTK的mRNA表达,MTT法描绘细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞凋亡并评价其疗效。统计分析采用SPSS10.0统计软件包完成,两样本均数的比较采用t检验。结果:PEG-PBLG纳米微球可介导质粒pcDNA3.1( )-CDglyTK转染Tca8113细胞,RT-PCR可检测到转染细胞中CDglyTK的mRNA表达。转染后,细胞在滴加5-FC和GCV后生长受到明显抑制,5-FC和GCV联合使用对Tca8113细胞的生长抑制作用明显优于单用5-FC或GCV。5-FC和GCV联合使用组,凋亡指数显著高于对照组(P<0.01),同时也高于单独使用5-FC或GCV组(P<0.05)。结论:PEG-PBLG纳米载体介导双自杀基因CDglyTK,可有效杀伤舌鳞癌Tca8113细胞,为舌鳞癌的基因治疗提供了新的途径。     

舌鳞癌细胞系Tca8113 Fas表达水平与凋亡的关系

目的研究舌鳞癌Tca8113细胞Fas表达水平与细胞凋亡的关系,了解细胞凋亡的相关机制。方法采用脂质体法将含Fas基因片段的真核表达重组质粒pBK-Fas导入舌鳞癌Tca8113细胞,检测转染前后FasmRNA表达水平、Fas蛋白阳性表达率和阳性表达强度。以及细胞凋亡指数,分析细胞凋亡的相关因素。结果Fas转染不提高舌鳞癌Tca8113细胞Fas蛋白阳性表达率(P>0.05),但能提高FasmRNA表达水平、Fas蛋白表达强度,以及细胞凋亡指数。各项指标分别由转染前的0.201±0.015,31.02±4.63,0.88%±0.16%上升到0.399±0.073,54.32±6.38和10.21%±1.46%,统计分析均有显著性差异(P<0.01)。结论Fas介导Tca8113凋亡与Fas蛋白阳性率可能无关,而与Fas蛋白阳性强度有关。Fas蛋白激活细胞凋亡可能存在阈值。只有Fas表达达到一定强度,细胞凋亡才被激活。     

Tca8113-4-1BBL细胞联合CD28单抗在口腔鳞癌免疫治疗中的作用

目的:探讨转4-1BBL肿瘤细胞联合抗CD28单抗体外诱导抗肿瘤活性的能力.方法:通过脂质体法将重组载体pEGFP/neo-h4-1BBL转染人舌鳞癌细胞Tca8113,经G418(400μg/mL)筛选及有限稀释后,获得稳定高表达克隆,分别用RT-PCR和Western印迹检测转染细胞中h4-1BBLmRNA和蛋白的表达.将转染与未转染4-1BBL基因的Tea8113细胞用丝裂霉素C(MMC)处理后,制成肿瘤细胞瘤苗.联合抗CD28单克隆抗体与经体外抗CD3mAb诱导的人外周血T淋巴细胞共同培养,测定T细胞增殖、CTL杀伤活性及产生细胞因子(IL-2和IFN-γ)的能力.实验数据以SPSS12.0软件包进行方差分析.结果:h4-1BBL基因真核表达载体在Tca8113细胞中获得稳定表达.转染h4-1BBL基因的Tca8113细胞联合抗CD28单抗能显著刺激T细胞活化、增殖(P(0.01),促进IL-2、IFN-γ分泌(P<0.01),并能有效地诱导CTL的特异性杀伤活性(P<0.01).结论:转4-1BBL肿瘤细胞联合抗CD28抗体能显著增强肿瘤细胞的免疫原性,诱导T细胞产生有效的抗肿瘤免疫应答.     

人内皮抑素基因转染对舌鳞癌Tca8113细胞生长的影响

目的 探讨人内皮抑素(hES)基因导入舌鳞癌Tca8113细胞后的表达情况及其抑制肿瘤生长效应。方法 以脂质体为载体将hES基因导入Tca8113细胞,通过动物实验观察转基因Tca8113细胞移植瘤生长情况,免疫组织化学检测肿瘤组织中hES及血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达,Weidner法行肿瘤微血管密度(MVD)计数,流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡率。结果 移植瘤生长第27天,实验组肿瘤组织中hES的表达率高于对照组(P<0.01);VEGF的表达率低于对照组(P<0.01)。实验组MVD计数低于对照组(P<0.01),而肿瘤细胞凋亡率则明显高于对照组(P<0.01)。hES基因转染对肿瘤生长的抑制率78.9％。结论 hES基因转染舌鳞癌细胞可体内诱导hES蛋白高效表达并具有抑制移植瘤生长的效应。     

脱落酸对Tca8113细胞诱导分化影响的体外实验

目的探讨植物激素中脱落酸（ABA）对人舌鳞癌Tca8113细胞的诱导分化作用。方法采用脱落酸处理Tca8113细胞,观察Tca8113细胞生长和形态变化,SABC免疫组化检测细胞表面分化标志物Involucrin、RARβ及原位杂交检测Caspase- 3 mRNA的表达变化,并比较细胞表面分化标志物的表达水平与Caspase- 3 mRNA表达两者间相关性。结果Tca8113细胞经ABA作用后,细胞生长抑制明显（P<0.05）,Tca8113细胞表现出向正常细胞转化的趋势。脱落酸作用24 h时细胞Involucrin、RARβ蛋白以及Caspase- 3 mRNA表达均增高,不同浓度实验组中其表达存在显著性差异（P<0.05）。1×10-2mmol/L ABA作用12 h和24 h时,Involucrin、RARβ和Caspase- 3 mRNA表达之间呈正相关（P<0.05）。结论脱落酸可通过提高Involucrin、RARβ表达水平,激活Caspase- 3 mRNA的表达,从而促进肿瘤细胞分化及凋亡。     

姜黄素对人舌鳞癌Tca8113细胞形态学的影响

目的 探讨姜黄素对体外培养人舌鳞癌Tca8113细胞凋亡的形态学影响.方法 以30、40、50 μmol/L的姜黄素溶液处理体外培养的人舌鳞癌Tca8113细胞,倒置显微镜下观察细胞生长状态,吖啶橙荧光染色和透射电镜观察细胞形态学变化.结果 倒置显微镜下可观察到细胞皱缩成圆形,核染色质浓集呈球形;激光共聚焦显微镜(吖啶橙染色)可见凋亡细胞的多种形态学改变;透射电镜见核染色质浓缩并沿核膜排列,可见凋亡小体.结论 姜黄素作用于人舌鳞癌Tca8113细胞后可出现细胞凋亡的形态学改变.     

黏着斑激酶基因沉默促进舌癌细胞失巢凋亡的实验研究

目的观察黏着斑激酶(focal adhension kinase,FAK)基因沉默对口腔舌癌细胞株Tca8113失巢凋亡抗性的影响,探讨FAK基因与口腔鳞癌转移特性的关系。方法以舌癌细胞株Tca8113为研究对象,首先应用免疫细胞化学和免疫蛋白印记的方法检测FAK基因的表达,然后利用RNA干扰的方法抑制FAK基因的表达。最后利用悬浮培养、流式细胞仪的方法观察FAK对口腔舌癌细胞株Tca8113体外培养过程抗失巢凋亡的影响。结果舌癌细胞株Tca8113体外培养过程中具有较强的抗失巢凋亡特性。特异性siRNA可以抑制FAK基因的表达。FAK基因干扰后,Tca8113细胞的失巢凋亡显著提高(P<0.01)。结论FAK基因沉默可以逆转舌癌细胞株Tca8113体外培养过程中的抗失巢凋亡特性。     

脂质体介导hES基因转染人舌鳞癌Tca8113细胞及其蛋白表达

目的　建立转人内皮抑素(hES)基因舌鳞癌Tca8113细胞,检测体外培养的转基因细胞基因蛋白表达。方法　为了建立携带hES基因的舌鳞癌Tca8113细胞克隆,选用阳离子脂质体Lipofectamin为载体,将含hES基因的质粒---pBLAST-hES转染Tca8113细胞,以Blasticidin S抗生素筛选阳性克隆。免疫组织化学S-P方法检测体外培养的转基因Tca8113细胞克隆中ES的表达。结果　经Blasticidin S抗生素筛选,转染hES基因的Tca8113细胞由于具有 bsr抗性基因,可以在含有50μg/ml Blasticidin S的培养基中生长和传代,从而得到携带hES基因的Tca8113细胞克隆。该细胞在体外培养传代96 h后,经免疫组织化学检测,hES表达的强阳性(+++)率为100%。结论　以脂质体介导hES基因转染Tca8113细胞效率高,转基因细胞具有高效表达活性目的基因产物的能力。     

p75NTR对舌鳞癌Tca8113细胞凋亡的影响

目的:探讨p75NTR基因对舌鳞癌Tca8113细胞凋亡的影响。方法:流式细胞技术分选Tca8113细胞系中p75NTR阳性细胞及阴性细胞,对阳性细胞用脂质体瞬时转染荧光标记的p75NTR siRAN,实时定量RT-PCR检测p75NTR基因,western blot检测p75NTR蛋白表达;流式细胞仪Annexin V/PI双染色标记法进行凋亡检侧;MTT检测细胞增殖的影响。结果:p75NTR表达阳性的Tca8113细胞经p75NTR siRNA转染后p75TNR的表达被抑制;细胞凋亡率明显增加(P<0.05),细胞增殖率明显降低。结论:p75NTR在Tca8113细胞凋亡中具有调控作用。