加味小陷胸汤对氧化低密度脂蛋白致血管内皮细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨加味小陷胸汤拮抗氧化低密度脂蛋白(OX-LDL)对血管内皮细胞(ECV304)增殖和凋亡的影响。方法：采用10μg／ml的OX-LDL刺激培养的人脐静脉内皮细胞株ECV304,诱导细胞凋亡;观察不同浓度小陷胸汤对抗细胞凋亡的作用。结果：10μg／ml的OX-LDL在作用一定时间后可明显抑制内皮细胞增殖并诱导其凋亡,加味小陷胸汤含药血清对该细胞毒性有明显拮抗作用,并显示了效果与药物浓度有关。结论：加味小陷胸汤可通过提高内皮细胞生长活性并抑制其凋亡、保护血管内皮细胞。     

切应力对内皮细胞一氧化氮合酶及细胞凋亡的影响

目的探讨切应力作用对体外培养的牛胸主动脉内皮细胞一氧化氮合酶(eNOS)蛋白表达和细胞凋亡的影响。方法体外培养牛胸主动脉内皮细胞，采用平行平板流动腔装置模拟体内血流切应力(5dynes／cm^2和25dynes/cm^2)作用于内皮细胞12h，采用Western blot分析和DNA片段凝胶电泳，观察不同切应力对体外培养的血管内皮细胞eNOS蛋白表达和细胞凋亡的影响。结果静息状态下，体外培养的牛胸主动脉内皮细胞呈多角形“铺路石”状排列，形态大小均匀。不同切应力(5，25dyne／cm^2)作用12h后，血管内皮细胞形态学未见明显改变。但与静止状态细胞的基础水平相比，Western blot分析发现，牛胸主动脉血管内皮细胞eNOS蛋白表达在低切应力时降低；低切应力还可诱导血管内皮细胞发生凋亡，凝胶电泳检测出现明显的DNA梯形带；但在高切应力(25dynes／cm^2)作用下，内皮细胞eNOS表达水平与未处理组接近，而且DNA片段凝胶电泳也未见明显凋亡现象。结论低切应力可降低内皮细胞eNOS蛋白表达和诱导内皮细胞凋亡，提示低切应力可能是导致血管内皮细胞eNOS表达降低和细胞凋亡的重要因素。     

加味小柴胡汤含药血清对大鼠肝星状细胞增殖和结缔组织生长因子表达的影响

目的：探讨加味小柴胡汤含药血清对大鼠肝星状细胞（HSC）增殖和结缔组织生长因子(CTGF)表达的影响。方法：①含药血清的制备：将Wistar大鼠随机分为大剂量组、中剂量组、小剂量组、对照组，各10只。各组分别给予蒸馏水或相应剂量的加味小柴胡汤灌胃，1次/d，共5 d。于末次给药2 h后经腹主动脉采血，制备相应剂量的含药血清。②含药血清对rHSC-99细胞增殖和CTGF表达的影响：用0.1%胰蛋白酶消化生长接近汇合的rHSC-99细胞，接种于培养板中，分为大剂量组、中剂量组、小剂量组和对照组。培养24 h和48 h后，采用MTT法检测含药血清对rHSC-99细胞系增殖的影响、免疫细胞化学染色检测细胞因子CTGF的表达、RT-PCR检测CTGF mRNA的表达。结果：不同浓度的加味小柴胡汤含药血清对HSC的增殖有明显的抑制作用，并可显著抑制CTGF蛋白和CTGF mRNA的表达。结论：加味小柴胡汤通过抑制HSC的增殖、抑制CTGF的表达而发挥其抗肝纤维化的作用。     

当归补血汤对RAW264.7细胞的TNF-α、ICAM-1表达的作用

目的探讨当归补血汤抗动脉粥样硬化(As)损伤作用的机制。方法制备当归补血汤含药血清,台盼蓝染色法检测细胞活性,免疫印迹法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的蛋白活性变化。结果RAW264.7细胞培养3 d后,台盼蓝染色细胞活力95%。免疫印迹法检测结果显示,氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)刺激RAW264.7细胞后TNF-α蛋白活性明显增强,当归补血汤含药血清组与ox-LDL组比较有差异(P0.05);ox-LDL刺激RAW264.7细胞后ICAM-1蛋白活性明显增强,当归补血汤含药血清组与ox-LDL组比较有差异(P0.05)。结论当归补血汤含药血清一定程度上能减少TNF-α、ICAM-1的蛋白表达,减少TNF-α、ICAM-1的表达可能是当归补血汤抗As损伤作用的机制之一。     

小陷胸汤合丹参饮含药血清对Ang-Ⅱ损伤人脐静脉内皮细胞ICAM-1表达的影响

目的从影响淋巴细胞与血管内皮细胞粘附的角度探讨小陷胸汤联合丹参饮抗动脉硬化作用的机制。方法采用Ang-Ⅱ损伤体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)作为病理模型,研究小陷胸汤合丹参饮对淋巴细胞与血管内皮细胞粘附的影响及其分子机制。结果用Ang-Ⅱ损伤HUVEC后,细胞ICAM-1mRNA表达、ICAM-1蛋白含量以及淋巴细胞粘附率显著升高,而不同浓度的小陷胸汤合丹参饮含药血清则能降低ICAM-1mRNA表达、ICAM-1蛋白含量,减少HUVEC与淋巴细胞粘附,且基本呈浓度相关。结论通过降低细胞表面粘附分子的表达而减少淋巴细胞与内皮细胞的粘附,可能是小陷胸汤合丹参饮抗AS作用的机制之一。     

葛根素对牛主动脉内皮细胞增殖的影响

目的:观察葛根素(Pue)对牛主动脉内皮细胞(BAECs)增殖的影响.方法:取BAECs细胞,分为窄白对照组(C组):常规培养24 h;溶媒组(S组):加PBS后培养24 h;葛根素(Pue)低、中及高剂量组:分别加入终质量浓度为0.5 g/L(P1组)、1.0g/L(P2组)及1.5 g/L(P3组)的Pue,再培养24 h.另取细胞,同上分组,均于加药前2h加入L-单甲基精氨酸(L-NMMA),加药后再培养24 h.采用MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期,Western Blot检测细胞内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表达.结果:Pue可促进BAECs的增殖,升高S+G2/M期的细胞比例,促进BAECs eNOS蛋白的表达(F=277.27,570.65,1 051.99,P<0.001),而L-NMMA可抑制上述效应.结论:Pue可促进BAECs进入分裂期从而促进增殖,其机制可能与增加eNOS的表达从而上调NO水平有关.     

下瘀血汤抑制肝癌细胞生长的研究*

目的：研究下瘀血汤对肝癌HepG2细胞生长的影响,并初步探讨其作用机制。方法：选取对数期生长阶段的HepG2细胞,分别加入不含药血清、10%含药血清、20%含药血清,通过CCK-8法检测下瘀血汤含药血清对Hep-G2细胞的增殖影响;通过流式细胞仪（FCM）检测下瘀血汤含药血清对Hep-G2细胞的凋亡和周期的影响;通过PCR及Western-blot检测下瘀血汤含药血清对核仁纺锤体相关蛋白1（nucleolar spindle-associated pretein 1,NuSAP1）的抑制作用。结果：通过CCK-8实验,发现10%、20%含药血清在48小时（P<0.05）及72小时（P<0.01）均能够明显抑制HepG2细胞的增殖;细胞周期实验发现,10%及20%含药血清能够抑制HepG2细胞的增殖,使细胞阻滞于S期及G2期,差异具有统计学意义（P<0.05）,且具有浓度依赖的特点（P<0.05）;流式细胞技术检测凋亡结果显示不同浓度含药血清均能够促进HepG2细胞的凋亡,并且具有浓度依赖性,差异有统计学意义（P<0.05）。通过PCR及Western-blot实验发现,10%及20%含药血清均能够抑制NuSAP1 mRNA及蛋白水平的表达,并随着含药血清的浓度增加,这一作用更为明显,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论：下瘀血汤含药血清可能通过抑制Nusap1表达来抑制Hep-G2细胞的增殖及周期,促进其凋亡,下瘀血汤有望成为治疗肝细胞肝癌的有效中药。     

抗氧化剂对Ox—LDL诱导内皮细胞Bcl-2蛋白表达的影响

目的　探讨抗氧化剂Se和VitE对Ox -LDL诱导体外培养的牛主动脉内皮细胞Bcl -2蛋白的影响。　方法　Ox -LDL与VitE、Se处理牛主动脉内皮细胞后 ,通过流式细胞仪和DNA电泳检测细胞凋亡 ,采用Westernblot检测Bcl -2蛋白表达。　结果　Ox -LDL作用内皮细胞后 ,DNA电泳呈明显梯度条带 :加入Se和VitE后 ,内皮细胞平均凋亡率较Ox -LDL组明显降低 (P <0 .0 5 ) ,Westernblot检测Bcl -2蛋白表达明显增加 (P <0 .0 5 )。　结论　Se和VitE能减少Ox -LDL诱导体外培养的牛主动脉内皮细胞凋亡 ,其作用机制与上调Bcl -2蛋白表达有关     

六味地黄汤含药血清对HK-2细胞PHD2/HIF-1α信号途径的影响

目的以缺氧诱导的HK-2细胞为研究对象,探讨脯氨酸羟化酶2/缺氧诱导因子1α(PHD2/HIF-1α)信号途径对肾间质纤维化的影响,以及六味地黄汤含药血清干预作用。方法 40只SPF级雄性SD大鼠分为空白组和给药组,每组20只,空白组以10 m L/(kg·d)生理盐水,给药组以67.5 g/(kg·d)六味地黄汤灌胃连续1周,腹主动脉取血,离心后分离血清。体外培养HK-2细胞,将实验分为空白对照组(10%胎牛血清)、正常血清组(10%正常大鼠血清)、氯化钴(Co Cl2)处理组(150μmol/LCo Cl2+10%正常大鼠血清)和含药血清组(150μmol/LCo Cl2+10%六味地黄汤含药血清)。体外培养HK-2,分组处理24 h后,用Western Blot法和RT-PCR法分别检测六味地黄汤含药血清对缺氧诱导的HK-2细胞中PHD2、HIF-1α、结缔组织生长因子(CTGF)的蛋白水平和mRNA表达的影响。结果与正常血清组比较,Co Cl2处理组HK-2细胞中PHD2的蛋白水平和mRNA表达均降低(P0.05),而HIF-1α、CTGF的蛋白水平和mRNA表达均升高(P0.05);与Co Cl2处理组比较,含药血清组HK-2细胞中PHD2的蛋白水平和mRNA表达均升高(P0.05),而HIF-1α、CTGF的蛋白水平和mRNA表达均降低(P0.05)。结论 PHD2/HIF-1α信号途径参与肾间质纤维化,六味地黄汤可能通过上调PHD2的表达,促进HIF-1α的降解,后者下调CTGF的表达,从而抑制肾间质纤维化。     

加味小陷胸汤对实验性高脂血症大鼠脂质代谢的影响

目的:研究加味小陷胸汤对实验性高脂血症(HLP)大鼠血清总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL C)、载脂蛋白A1(Apo A1)、载脂蛋白B(Apo B)的影响.方法:采用高脂饮料喂食建立大鼠HLP模型,自造模第1天起,灌胃给予加味小陷胸汤低剂量4.77g/kg·d,中剂量9 54g/kg·d,高剂量19.08g/kg·d,连续给药6周,应用酶法及免疫比浊法进行指标测定.结果:加味小陷胸汤三个剂量均能显著降低高脂大鼠血清TC、TG、LDL C、 Apo B水平(P＜0 05,P＜0 01),显著升高HDL C、Apo A1水平(P＜0.01).结论:加味小陷胸汤能有效地调整血脂异常,对高脂血症有防治作用.     

苯扎贝特促进内皮细胞的增殖和迁移

目的:苯扎贝特对牛主动脉内皮细胞(BAECs)增殖和迁移的影响及信号转导机制。方法:BAECs给予不同浓度的苯扎贝特和(或)信号转导抑制剂,分别行细胞计数、MTT检测、刮痕修复、Boyden趋化小室检测。结果:苯扎贝特显著促进BAECs的增殖、趋化和迁移并呈剂量依赖效应,而一氧化氮合酶抑制剂、ERK抑制剂和PI3K抑制剂均可显著抑制上述效应。结论:苯扎贝特可显著促进BAECs增殖、趋化和迁移,该作用由MAPK、PI3K和由其上调的一氧化氮介导。     

内皮型一氧化氮合酶基因转染在兔颈静脉移植血管桥中的表达

目的:研究腺病毒载体介导的人内皮型一氧化氮合成酶基因在兔自体移植颈静脉中的表达,寻找预防移植血管再狭窄的方法.方法:建立兔颈外静脉颈总动脉旁路移植模型,18只兔随机等分为3组,A:对照组,B:空载腺病毒液感染组,C:eNOS基因转染组.在兔颈外静脉颈总动脉旁路移植术中,分别应用空载腺病毒液或AdCMVeNOS血管桥内注入法感染移植静脉1 h.术后4 wk,应用多聚寡核苷酸探针原位检测方法检测外源性基因mRNA的表达;免疫组织化学染色方法检测eNOS蛋白的定位;HE及弹力纤维染色后,应用计算机图像分析系统检测移植静脉内膜、中膜增生情况.结果:人内皮型一氧化氮合成酶基因在自体移植静脉中表达出相应的mRNA和蛋白质;术后4wk,与对照组相比,空载腺病毒液感染组移植静脉内膜和中膜厚度无明显变化;eNOS基因转染组移植静脉内膜和中膜厚度分别减少42.3%,13.5%,内膜厚度/中膜厚度比值(I/M)减少34.6%.结论:腺病毒载体介导的人内皮型一氧化氮合成酶基因成功转染兔自体移植颈静脉中并有效表达,eNOS基因具有防治移植静脉内膜增生作用.     

蕲艾提取液药物血清对大鼠肝星状细胞增殖的影响

目的研究蕲艾提取液药物血清对大鼠肝星状细胞(HSC)增殖及转化生长因子β1(TGFβ1)表达的影响。方法传代培养的HSC-T6与蕲艾提取液药物血清共同培养24h后,采用MTT法检测其对HSC增殖的影响,Elisa法检测TGFβ1蛋白表达情况。结果不同浓度蕲艾提取液药物血清(5%、10%、20%)与空白对照组及生理盐水血清组比较,能显著抑制HSC-T6增殖(P0.01)及TGFβ1蛋白的表达(P0.01)。结论蕲艾提取液药物血清可显著抑制HSC-T6增殖。     

穴位敷贴含药血清促进神经干细胞增殖作用研究

目的:探讨安宫牛黄贴含药血清对神经干细胞(neural stem cells,NSCs)增殖的影响以及对分泌型血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达的作用。方法:将未分化状态的C17.2细胞培养并传代,按含药血清10%给药,分为穴位敷贴高剂量组,穴位敷贴中剂量组,穴位敷贴低剂量组,药物组,以及空白组。MTT法检测NSCs增殖活性,ELISA法检测VEGF蛋白表达。结果:MTT数据显示,安宫牛黄贴穴位敷贴能有效促进NSCs的增殖,以穴位敷贴低剂量、中剂量组效果较为显著(P0.05)。ELISA结果显示,穴位敷贴低剂量、中剂量、高剂量均能不同程度升高神经干细胞表达分泌型VEGF蛋白,其中穴位敷贴中剂量组增高分泌型VEGF蛋白含量的效果最好(P0.05)。结论:VEGF分泌增多对体外培养的神经干细胞增殖有明显促进作用,穴位敷贴含药血清正是由于增加了神经干细胞表达分泌型VEGF蛋白,从而促进了神经干细胞的增殖。     

依普拉芬对大鼠成骨细胞一氧化氮生成及内皮型一氧化氮合酶mRNA表达的影响

目的研究依普拉芬对大鼠成骨细胞一氧化氮生成以及内皮型一氧化氮合酶（eNOS）mRNA表达的影响，探讨其治疗骨质疏松的细胞作用机制。方法体外分离培养新生SD大鼠颅盖骨成骨细胞，取第2代细胞，培养液中分别加入不同浓度的依普拉芬，72h后，测定各组细胞培养液中的NO浓度，RT—PCR方法检测各组细胞中eNOSmRNA的表达。结果与阴性对照组相比，各浓度组的依普拉芬均可增加成骨细胞培养液中的NO浓度并促进eNOSmRNA的表达（均P〈0．01）。其中10^-8～10^-5mol／L浓度之间作用最为显著。结论一定浓度的依普拉芬可以增加成骨细胞NO合成，但进eNOSmRNA的表达，从而发挥其促进成骨作用。     

红景天调节eNOS表达在保护大鼠心肌缺血损伤中的机理探讨

目的:探讨红景天对大鼠心肌缺血性损伤的保护作用以及可能的作用机制。方法:采用异丙肾上腺素(ISO)皮下注射制备SD大鼠的实验性心肌缺血性损伤模型,以红景天干预,曲美他嗪作为药物参照,50只SD大鼠随机分为5组:正常对照组(A)、ISO损伤组(B)、曲美他嗪组(C)、高剂量红景天组(D)及低剂量红景天组(E)。观察各组大鼠血清CK-MB以及心肌细胞凋亡指数的变化,采用Western blot技术,分析心肌eNOS蛋白水平表达变化。结果:与ISO损伤组比较,红景天能够明显减轻ISO所致的心肌细胞缺血性损伤,且保护作用与剂量呈正相关。我们还发现心肌损伤时eNOS蛋白表达明显下降,而红景天组表达则较ISO损伤组明显增高且高剂量组较低剂量组表达升高。实验中,曲美他嗪作为一种阳性对照药物可以明显减轻大鼠心肌缺血性损伤,其疗效与低剂量红景天相似。结论:红景天可能通过上调eNOS的表达,减轻了心肌细胞凋亡,从而减轻了心肌的缺血性损害。     

赤芍对大鼠内毒素性急性肺损伤时肺iNOS和eNOS表达的影响

目的 :观察赤芍对内毒素性急性肺损伤 (ALI)时肺iNOS和eNOS表达的影响 ,并探讨其保护作用机制。方法 :采用大鼠内毒素ALI模型。 4 0只Wistar大鼠随机分为生理盐水对照组 (NS)、内毒素组 (LPS)、赤芍治疗组、赤芍预防组和iNOS阻断剂氨基胍 (AG)组。应用免疫组织化学方法和图像分析系统检测肺组织中iNOS和eNOS的表达 ,检测血清NO及肺组织丙二醛 (MDA)含量 ,同时观察肺组织病理形态学改变。结果 :与NS组比较 ,LPS组iNOS表达显著增强而eNOS表达明显降低 (均P <0 .0 1) ;赤芍治疗组和赤芍预防组iNOS表达较LPS组明显降低而eNOS表达明显升高 (均P <0 .0 5 ) ;与LPS组比较 ,AG组仅iNOS表达明显降低。LPS组肺组织MDA和血清NO较NS组明显增加 (P <0 .0 1) ;与LPS组比较 ,赤芍治疗组和赤芍预防组MDA含量和血清NO显著降低 (P <0 .0 5或P <0 .0 1)。病理学检查显示赤芍治疗组和赤芍预防组肺组织损伤程度较LPS组明显减轻。结论 :肺组织iNOS表达增强和eNOS表达降低是内毒素性ALI的重要机制 ,赤芍对内毒素性ALI的防治作用可能与抑制肺组织iNOS异常高表达和增加eNOS表达有关。     

猪脱细胞主动脉瓣叶不同方法预处理后种植内皮细胞的比较研究

目的:猪脱细胞主动脉瓣叶经不同的方法预处理后,种植新生牛主动脉内皮细胞(BAECs),观察细胞的增殖状态。方法:猪脱细胞主动脉瓣叶分别经纤维连接蛋白(Fn,50 μg/ml)预铺、胎牛血清(FCS)浸泡、无血清DMEM浸泡预处理12 h,采用间隔24 h、3次种植的方法种植 BAECs,于种植后第4天、第7天进行细胞计数,并行MTT法和~3H-TdR掺入量检测比较细胞的增殖状态。同时于第7天取瓣叶进行组织学检测,观察瓣叶表面内皮细胞覆盖情况。结果:种植后第4天和第7天,采用Fn预铺、FCS浸泡预处理的脱细胞瓣叶,其细胞计数、MTT的光密度和~3H-TdR掺入值明显高于无血清DMEM预处理组(P<0.01)。瓣叶经H-E染色,可见Fn预铺、FCS浸泡预处理组内皮细胞的覆盖情况优于无血清DMEM浸泡组。结论:Fn或FCS预处理能明显增加内皮细胞在脱细胞瓣叶表面的黏附和增殖,有利于组织工程心脏瓣膜的体外构建。     

中药复方调控肝干细胞分化及机制的实验研究

目的研究中药复方牛黄、西洋参（简称牛黄参）含药血清对大鼠肝干细胞系WB-F344增殖、分化的影响,探讨益气解毒法体外诱导肝干细胞分化为肝细胞的内在机制。方法采用中药血清药理学方法,以不同浓度的牛黄参含药血清（5%、10%、20%）作用于WB-F344,以正常大鼠血清（5%、10%、20%）处理的WB-F344为空白对照组,以单纯培养体系处理的WB-F344为正常对照组;噻唑兰（MTT）比色法检测不同浓度含药血清对WB-F344增殖的影响;取增殖的最佳浓度,蛋白印迹法（western blot）检测含药血清对WB-F344细胞HGFR、EGF、EGFR、TGFβ1R、TGFβ2R表达的影响;逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测含药血清对WB-F344肝细胞表面标志物白蛋白（ALB）的mRNA表达的影响。结果牛黄参含药血清能促进WB-F344的增殖（P〈0.01）,且10%为增殖的最佳浓度梯度;能刺激WB-F344细胞HGFR、EGF、EGFR、TGF-β1R、TGF-β2R的表达量上调（P〈0.01）;能促进WB-F344肝细胞表面标志物ALB的mRNA表达（P〈0.01）。结论牛黄参含药血清可以通过细胞因子体系对肝干细胞WB-F344的增殖、分化进行调节,为利用中药复方制剂调控肝干细胞,促进肝再生和肝损伤修复提供实验与理论基础。