静脉移植骨髓间充质干细胞联合重组人生长激素对充血性心肌病大鼠心肌和血管组织的修复

背景:骨髓间充质干细胞静脉移植后,能否归巢至心脏受损部位和分化为心肌样细胞尚无统一定论.目的:探讨重组人生长激素联合骨髓间充质干细胞静脉移植对充血性心肌病大鼠心肌和血管新生的影响.方法:密度梯度离心和贴壁筛选法获得大鼠骨髓间充质干细胞.模型组、细胞移植组、生长激素组、联合组大鼠均在阿霉素诱导下建立心脏衰竭模型.造模后,细胞移植组经静脉注入BrdU标记的骨髓间充质干细胞8×10~(13) L~(-1);生长激素组皮下注射重组人生长激素2 U/(kg·d),连续14 d;联合组行骨髓间充质干细胞移植与重组人生长激素注射.4周后取材,BrdU+MHC及BrdU+Actin免疫组化染色确定骨髓间充质干细胞的归巢情况,评价移植细胞向心肌样细胞和血管内皮细胞的分化,苏木精-伊红染色检测血管密度.结果与结论:与细胞移植组比较,联合组BrdU免疫组化阳性率显著升高(P < 0.001);BrdU+MHC双染和BrdU+Actin双染后心肌样细胞、血管内皮细胞均显著增多(P < 0.001).与模型组比较,生长激素组、细胞移植组、联合组的总血管密度、微血管密度、毛细血管密度均显著升高(P < 0.001),后3组间比较无明显差异(P > 0.05).结果证实骨髓间充质干细胞静脉移植后可归巢到心脏,对充血性心肌病大鼠心肌和血管有明显修复作用,能在损伤处区存活、生长,并向心肌样细胞、血管内皮细胞方向分化,增加损伤处血管密度;生长激素可以改善微环境,加强骨髓间充质干细胞向心肌样细胞、血管内皮细胞的转化率.     

自体骨髓间充质干细胞心肌移植后的分化及存活

背景:骨髓间充质干细胞移植入急性心肌梗死组织后是否能迁移、分化及存活,目前尚不清楚.目的:观察兔骨髓间充质干细胞移植入急性心肌梗死组织后,在体内的迁移、分化及其存活.方法:分离培养兔骨髓间充质干细胞,体外DAPI标记细胞.结扎兔左前降支制作急性心肌梗死模型,造模成功后30只新西兰大耳兔抽签法分为骨髓间充质干细胞组和对照组,每组15只.骨髓间充质干细胞组于冠状动脉结扎后1 h在梗死周边区用微量注射器分4点注射自体骨髓间充质干细胞.对照组于相同部位注射等量生理盐水.每点注射体积30 μL.分别于移植后10 min,3 d,4周时各组各处死5只动物.取心脏行冰冻切片,荧光显微镜观察DAPI标记骨髓间充质干细胞的分布情况;免疫荧光法检测标记细胞是否表达心肌特异性肌钙蛋白Ⅰ和α-肌动蛋白.结果与结论:DAPI标记的骨髓间充质干细胞在兔急性心肌梗死模型心脏微环境中,蓝色细胞核分布广泛,呈椭圆形,似心肌细胞核,其排列方向与宿主心肌纤维方向一致,间接免疫荧光法检测胞浆心肌特异性蛋白肌钙蛋白Ⅰ、α-肌动蛋白均为阳性.说明缺血心肌内移植入骨髓间充质干细胞,可在局部微环境的刺激下向心肌细胞定向分化.     

同种异体骨髓间充质干细胞穴位移植:急性心肌梗死后血管新生及相关细胞因子的变化

背景:骨髓间充质干细胞移植途径主要包括外周静脉注射移植、冠状动脉移植以及心肌内注射移植,但存在迁移缺少靶向性,价格高昂等局限性.目的:观察同种异体骨髓间充质干细胞穴位移植兔急性心肌梗死后梗死区血管新生及相关细胞因子的变化.方法:提取兔骨髓进行骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化、扩增、鉴定,并标记.将55只兔随机分为正常组与手术组.手术组急性心肌梗死后1周,再随机分为3组:穴位注射干细胞组、模型对照组、穴位注射生理盐水组.5周后,取心肌组织进行免疫组织化学BrdU染色、心肌特异性肌钙蛋白T免疫组织化学染色检测;免疫组织化学法检测梗死心肌组织血小板内皮细胞黏附因子1水平;免疫组织化学法,夹心酶联免疫法、RT-PCR法、Western-Blot法检测血管内皮细胞生长因子及免疫组织化学法榆测碱性成纤维细胞生长因子.结果与结论:穴位注射的骨髓间充质干细胞可迁移至梗死区,并可以在梗死区分化为心肌样细胞.与模型对照组及穴位注射生理盐水组比较,穴位注射骨髓间充质干细胞可使梗死区及周围组织血小板内皮细胞黏附因子1表达上调,诱导梗死区及周围组织血管新生,其机制是刺激心肌组织中碱性成纤维细胞生长因子表达上调.穴位注射骨髓间充质干细胞组梗死心肌组织中和血清中血管内皮细胞生长因子表达均无上调趋势,因此推测,血管新生由碱性成纤维细胞生长因子及未知因素诱导.     

不同方法移植骨髓间充质干细胞在体内重要器官的分布及分化

背景:大量实验显示心肌损伤后,趋化或直接心肌内注射的骨髓干细胞可以在体内分化为心肌细胞、血管内皮细胞或血管平滑肌细胞.目的:观察不同方法移植的骨髓间充质干细胞体内重要器官的分布、生长和分化情况.方法:选用3月龄日本大耳白兔39只,均制作急性心肌梗死动物模型并随机分为4组,3个组为实验组分别以心肌内直接注射、经冠脉注射、经静脉注射3种不同移植经BrdU标记的自体骨髓间充质干细胞.对照组分为3个亚组,分别经冠脉、静脉和心肌内直接注射等量的生理盐水.4周后处死动物,取心、肺、肝、肾制作组织切片并观察BrdU阳性细胞和BrdU及α-横文肌肌动蛋白双阳性细胞.结果与结论:①骨髓间充质干细胞移植各实验组在梗死区及其周边均可见到BrdU阳性细胞和BrdU及α-横文肌肌动蛋白双阳性细胞.BrdU阳性细胞间及与宿主心肌细胞间有细胞突起相连,并可见明显的横纹和肌小节.②各实验组新生毛细血管密度较对照组都有增加(P < 0.05),其效果顺序由好到差依次为冠脉注射组、心肌注射组和静脉注射组.③经冠脉和静脉移植组非目的器官肺、肝、肾的标本切片内均发现BrdU阳性细胞表达,且静脉移植组肺内BrdU阳性细胞数多于肝、肾,但均未见有分化趋势和恶性细胞表达.结果提示骨髓间充质干细胞经3种方法移植均能使心肌梗死区及其周边区心肌细胞和毛细血管再生,除心肌注射组外非目的器官都有BrdU阳性细胞表达,但仍以目的器官表达为主.     

腺病毒介导的肝细胞生长因子/血管内皮生长因子双基因转染骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死

背景：骨髓间充质干细胞可以分化为心肌细胞,促进血管再生,但在移植早期其自身分泌的细胞因子不足以维持良好的分化和再生。目的：验证腺病毒介导的肝细胞生长因子和血管内皮生长因子双基因转染新西兰兔骨髓间充质干细胞移植对新西兰兔梗死心肌组织的修复重建和血管再生的影响。方法：腺病毒介导肝细胞生长因子/血管内皮生长因子双基因转染BrdU标记的新西兰兔骨髓间充质干细胞。取新西兰兔50只建立急性心肌梗死模型,4周后随机分为5组,分别于梗死心肌内注射：①骨髓间充质干细胞/Ad.血管内皮生长因子＋肝细胞生长因子。②骨髓间充质干细胞/Ad.肝细胞生长因子。③骨髓间充质干细胞/Ad.血管内皮生长因子。④骨髓间充质干细胞。⑤对照组注射等量无血清IMDM培养液。移植4周后观察移植细胞的分化和新生血管的形成,并通过超声多普勒检测心功能变化。结果与结论：除对照组外,其余4组兔心功能都较移植前有明显改善（P〈0.05）,其中移植双基因转染骨髓间充质干细胞/Ad.血管内皮生长因子＋肝细胞生长因子组兔的心功能改善程度要明显高于其他3组。部分BrdU染色阳性的细胞可以分化成为内皮细胞,参与构成了梗死区域的新生毛细血管。与对照组比较,其余4组都有明显的血管新生（P〈0.05）,而以骨髓间充质干细胞/Ad.血管内皮生长因子＋肝细胞生长因子组最显著。提示肝细胞生长因子/血管内皮生长因子双基因转染新西兰兔骨髓间充质干细胞移植于梗死心肌可以促进心肌再生和新生血管的形成,明显改善心功能。     

生长因子可促进自体骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死

背景：生长因子是干细胞强有力的动员剂,可以增加注射细胞的黏附力和增殖力,诱导干细胞向梗死区迁移、增殖分化,参与心肌修复。 目的：观察肝细胞生长因子和胰岛素样生长因子的联合应用在骨髓间充质干细胞自体移植治疗心肌梗死中的作用。 方法：分离培养兔骨髓间充质干细胞,原代培养后采用红光荧光染料 CM-Dil 标记。结扎冠脉前降支制作兔急性心肌梗死模型,然后随机均分为对照组、骨髓间充质干细胞组、肝细胞生长因子＋胰岛素样生长因子组和肝细胞生长因子＋胰岛素样生长因子＋骨髓间充质干细胞组。于心肌梗死区心肌内分4点共注射不同干预试剂。Masson三色法染色检测存活心肌;免疫荧光检测骨髓间充质干细胞分化;心脏超声评价心功能。 结果与结论：建模后4周,肝细胞生长因子＋胰岛素样生长因子＋骨髓间充质干细胞组 CM-Dil/cTNT＋细胞数量明显多于骨髓间充质干细胞组,其存活心肌最多,左室射血分数改善最明显,左室舒张末径最小。肝细胞生长因子和胰岛素样生长因子联合应用促进自体移植的骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化,增加存活心肌数量,改善心功能,抑制心室重构,可能成为心肌梗死后细胞治疗的有效方法。     

腺病毒介导血管内皮生长因子基因转染大鼠骨髓间充质干细胞移植梗死心肌的血管再生

背景：骨髓间充质干细胞的存活率与良好的血液供应关系密切，在移植早期其自身所分泌产生的促血管生长因子不足以刺激血管新生而容易导致移植的细胞死亡。目的：观察骨髓间充质干细胞移植联合血管内皮生长因子基因转染对大鼠梗死心肌组织修复重建、血管再生的影响。设计、时间及地点：随机分组设计的细胞基因工程实验，于2006-01／2007-12在中山大学第二附属医院医学研究中心完成。材料：选取具有相同遗传背景的雄性SD大鼠40只建立急性心肌梗死模型，6~8周龄．体质量250～300g。方法：体外分离、培养、纯化SD大鼠骨髓间充质干细胞，以BrdU标记骨髓间充质干细胞。腺病毒介导血管内皮生长因子基因转染骨髓间充质干细胞。将造模后大鼠随机分为4组．每组10只：基因转染骨髓间充质干细胞组，梗死心肌内注射体外转染腺病毒介导血管内皮生长因子的骨髓间充质干细胞；骨髓间充质干细胞组，梗死心肌内注射骨髓间充质干细胞；基因转染组，注射腺病毒介导的血管内皮生长因子；对照组，注射无血清IMDN培养液。主要观察指标：移植4周后观察移植细胞分化和新生血管的形成，并通过超声多普勒检测心功能变化。结果：细胞移植4周后，基因转染骨髓间充质干细胞组、骨髓间充质干细胞组移植区移植细胞表现为心肌肌钙蛋白T染色阳性，细胞呈肌样细胞形态，并且两组心功能都较移植前有明显改善，基因转染骨髓间充质干细胞组改善程度优于骨髓间充质干细胞组。部分BrdU染色阳性的细胞可以分化成为内皮细胞，参与构成了梗死区域新生毛细血管，相对于单纯细胞移植与细胞因子移植，细胞移植结合血管内皮生长因子基因转染促进毛细血管新生更明显。结论：骨髓间充质干细胞移植联合血管内皮生长因子基因转染可以通过促进心肌再生和新生血管的形成来重建缺血心肌，明显改善心功能。     

血管内皮生长因子基因修饰骨髓间充质干细胞移植心肌梗死大鼠:高压氧干预促进治疗性血管生成

背景:骨髓间充质干细胞移植入缺血心肌后梗死区周边心肌的缺血、缺氧、炎性反应、细胞凋亡等病理变化严重影响到移植骨髓间充质干细胞的存活,而高压氧能显著改善其缺氧状态。目的:对心肌梗死模型大鼠缺血心肌局部移植血管内皮生长因子修饰的骨髓间充质干细胞,在移植后对大鼠进行高压氧干预,探讨其对骨髓间充质干细胞移植后所获得的治疗性血管生成效应的影响。方法:将真核表达载体pcDNA3.1(-)/人血管内皮生长因子165转染大鼠骨髓间充质干细胞,再移植至心肌梗死模型大鼠的缺血区组织,移植前细胞行CM-DiI标记。移植后2周每日对大鼠行高压氧治疗干预。移植1个月后行心脏B超测量其左室射血分数,组织化学苏木精-伊红染色和Ⅷ因子染色并评价新生血管密度。结果与结论:CM-DiI能有效标记骨髓间充质干细胞,标记率近100%。细胞移植1个月后高压氧干预的大鼠射血分数、再生血管密度较均明显增高(P<0.05)。证实,高压氧干预能显著促进移植血管内皮生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞的心肌梗死大鼠所获得的治疗性血管生成作用,对心脏功能有明显改善作用。     

骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠心肌梗死及随后的心肺复苏

背景:至目前为止发表的心肺复苏论文所使用的基本为健康动物,而临床实际情况是在心肺复苏发生之前患者大多有严重的心脏疾病,并导致了心室颤动的发生.目的:实验力图接近临床实际,观察骨髓间充质干细胞移植后心肌梗死大鼠心功能的变化,及对其心肺复苏结果的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-04/08在美国南加州大学和中山大学附属第二医院联合完成.材料:成年SD雄性大鼠18只,随机分为模型对照组、细胞移植组,9只/组.另取1月龄SD大鼠1只用于制备骨髓间充质干细胞.方法:两组大鼠均结扎左前降支冠状动脉建立心肌缺血模型,4周后再次开胸,细胞移植组梗死心肌局部注射PKH26荧光标记的骨髓间充质干细胞悬液0.1 mL(5×106个细胞),模型对照组同法注射等量PBS.4周时诱导心室颤动及进行心肺复苏.主要观察指标:移植后2,4周用超声心动图测量心功能;测量心肺复苏前及心肺复苏后4 h内的血液动力学参数的变化;在心肺复苏72 h后取心肌组织进行病理切片检查.结果:与模型对照组比较,移植后2,4周细胞移植组射血分数均明显升高(P<0.01).在心肺复苏前及心肺复苏后4 h内,与模型对照组比较,细胞移植组心脏指数、左心室收缩压力上升到40 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)时的上升速率、左心室舒张速率、左心室舒张末压均有明显改善(P<0.01,P<0.05).与模型对照组比较,细胞移植组大鼠心肺复苏后可生存至72 h,生存时间明显延长(P<0.05).病理切片结果显示心肌内存在大量PKH26标记的骨髓间充质干细胞.结论:大鼠心肌梗死后,骨髓间充质干细胞移植治疗能明显改善其心功能、心肺复苏前后的血流动力学参数以及生存时间.     

骨髓间充质干细胞在心肌梗死犬心肌内分化及对心肌细胞凋亡的影响

背景：体内移植骨髓间充质干细胞对实验动物的心肌梗死和心力衰竭有较好的改善作用，但具体机制尚不清楚。目的：观察骨髓间充质干细胞在心肌梗死犬梗死区的分化以及对心肌细胞凋亡的影响。设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2005—03／2007—12在美国Texas Heart Institute干细胞研究室进行骨髓间充质干细胞移植，在第三军医大学完成免疫组织化学染色。材料：成年杂种犬，平均体质量25～35k。方法：采用密度梯度离心法提取犬骨髓间充质干细胞，移植前以BrdU标记骨髓间充质干细胞。采用外科手术于近端冠状动脉左前降支植入布洛芬缩肌装置并结扎相连分支的方法制作犬心肌梗死模型。造模后分为实验组与对照组，实验组于损伤缺血部位注射同种异体骨髓间充质干细胞。对照组注射等量生理盐水。主要观察指标：对移植BrdU标记的骨髓间充质干细胞的心肌梗死犬心肌梗死区组织细胞进行免疫组织化学染色，同时采用DeadEnd^TM Colorimetric TUNEL System对心梗标本进行凋亡细胞的染色观察。结果：注射骨髓间充质干细胞的心脏组织切片BrdU免疫组织化学染色可见大量细胞核呈现深褐色或黑色的阳性反应，在心脏组织的不同区域表现出不同的形态特征，其中大多数植入心肌细胞间的骨髓间充质干细胞，形态上与心肌细胞无异，而其他区域的骨髓间充质干细胞则与间质细胞较相似，无特定的形状。骨髓间充质干细胞移植组心肌梗死区凋亡的心肌细胞数少于未移植组。结论：骨髓间充质干细胞心肌内移植后可在心肌梗死区分化成心肌细胞，并减轻犬心肌梗死后的细胞凋亡。