糖尿病大鼠肾小球系膜细胞表型转化及菟箭合剂的作用

目的：研究糖尿病大鼠是否存在肾小球系膜细胞表型转化及中药菟箭合剂的作用。方法：SD大鼠分为正常对照组(NC组,n=8)、单肾切除对照组(QC组,n=8)、单肾切除链脲佐菌素(STZ)糖尿病组(DM组,n=8)、缬沙坦治疗组(VT组,n=8)和中药菟箭合剂治疗组(ZY组,n=9),缬沙坦治疗组和菟箭合剂治疗组分别在单肾切除STZ糖尿病模型成模后灌喂缬沙坦[20mg／(kg·d)]和菟箭合剂[20g／(kg·d)]12周,用免疫组化的方法观察大鼠肾小球内α-平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin,α-SMA)和转移生长因子-β1(TGF-β1)的表达情况,用计算机病理图像分析软件检测肾小球α-SMA和TGF-β染色阳性面积／肾小球毛细血管袢面积比。结果：NC组和QC组大鼠仅个别肾小球内有少量α-SMA阳性显色,DM组大鼠肾小球内可见显著的α-SMA阳性显色,肾小球内α-SMA阳性面积／肾小球毛细血管袢面积比和TGF-β1阳性面积／肾小球毛细血管袢面积比显著增加(P<0．01),24h尿蛋白排泄量较NC组和QC组大鼠显著增多(P<0．01);VT组和ZY组大鼠24h尿蛋白排泄量较DM组显著减少,肾小球内α-SMA阳性面积／肾小球毛细血管袢面积比和TGF-β阳性面积／肾小球毛细血管袢面积比较DM组显著降低(P<0．01);ZY组24h尿蛋白排泄量较VT组低(P<0．01)。结论：单肾切除STZ糖尿病大鼠肾小球内可见大量的α-SMA的表达,提示糖尿病肾病时存在肾小球系膜细胞表型转化,中药菟箭合剂和缬沙坦治疗后可显著减少糖尿病大鼠24h尿蛋白排泄量,抑制肾小球系膜细胞表型转化和肾小球内TGF-β的表达,菟箭合剂较缬沙坦降低糖尿病大鼠24h尿蛋白排泄量的作用更为显著。     

消渴平含药血清对高糖诱导大鼠肾小球系膜细胞凋亡的影响

目的:观察消渴平(Xiaokeping,XKP)含药血清对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞凋亡的影响,探讨其治疗DKD的作用机理.方法:使用不同浓度的消渴平含药血清及厄贝沙坦含药血清与高糖共同培养大鼠肾小球系膜细胞,应用TUNEL法检测细胞凋亡,荧光定量PCR检测大鼠肾小球系膜细胞中B淋巴细胞瘤基因相关X蛋白(Bax mR...     

菟箭合剂对糖尿病大鼠肾组织蛋白激酶C活性作用的研究

目的 :观察菟箭合剂对实验性糖尿病肾病大鼠肾组织蛋白激酶C(PKC)活性、肾功能及肾脏结构的影响。方法 :单肾切除加链脲佐菌素 (STZ)腹腔注射制作糖尿病肾病动物模型。中药菟箭合剂 (20g·kg^-1·d^-1)和阳性对照药缬沙坦 (2 0mg·kg^-1·d^-1)干预治疗 12周 ,用氚标记的二丁酸佛波醇酯 ([³H]PDBu)结合法测定大鼠肾组织PKC活性 ,检测 24 h尿蛋白排出量 (Upro) ,肾脏常规染色光镜观察病理变化。结果 :12周时单肾糖尿病大鼠肾组织出现肾小球硬化病理改变 ,Upro明显升高 ,细胞膜PKC活性 (mPKC)明显升高 ,细胞浆PKC活性 (cPKC)明显降低 ,mPKC和cPKC比值 (M/C)明显升高。菟箭合剂和缬沙坦干预治疗显著降低Upro ,降低mPKC和M/C ,升高cPKC(P<0.01) ,改善肾组织病理改变。结论 :菟箭合剂对单肾切除STZ糖尿病大鼠具有肾保护作用 ,推测部分地通过抑制肾组织PKC激活途径来达到的。     

降糖益肾方对高胰岛素诱导的人肾小球系膜细胞增殖及IRS-1、PI-3K蛋白表达的影响

目的观察降糖益肾方对高胰岛素诱导的人肾小球系膜细胞（human glomerular mesangial cells, HMCs）增殖及其胰岛素受体底物-1（insulin receptor substrate 1, IRS-1）、磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase, PI-3K）蛋白表达的影响。方法将HMCs分为正常空白对照组（空白组）、高胰岛素模型组、抑制剂组、中药组。首先预实验确定胰岛素、抑制剂和降糖益肾方用药浓度。各组分别加入不同培养液,空白组予RPMI1640培养液,其余3组均予含100 nmol/L胰岛素的培养液,培养24 h,同时抑制剂组、中药组分别予80 μmol/ L LY294002、125 mg/L降糖益肾方干预,继续培养48 h。采用MTT法及流式细胞技术检测HMC增殖,采用免疫组化和Western blot技术检测IRS-1、PI-3K蛋白表达。结果在高胰岛素诱导下,中药组和抑制剂组HMC增殖均显著降低,IRS-1、PI-3K蛋白表达水平下调（P〈0.01）;与抑制剂组比较,中药组IRS-1、PI-3K蛋白表达水平下调稍弱（P〈0.05）。结论降糖益肾方具有降低高胰岛素诱导的HMC增殖的作用,其机制可能与干预胰岛素信号通路有关。     

藻黄合剂含药血清对高糖环境下人肾小球系膜细胞MCP-1表达的影响

目的:观察藻黄合剂(ZHM)对高糖环境下人肾小球系膜细胞(HMC)单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)表达的影响,探讨其在糖尿病肾脏疾病(DKD)防治中的意义。方法:体外培养HMC并鉴定,血清药理学方法制备ZHM低、中、高剂量组,空白对照组及海昆肾喜阳性对照组大鼠含药血清,10%各组含药血清培养基分别孵育高糖作用下HMC 48h,另设低糖组作为空白对照。ELISA法和RT-PCR技术分别检测各组系膜细胞MCP-1蛋白及mRNA表达情况。结果:MCP-1蛋白及mRNA表达量在高糖组较低糖组明显升高(P<0.01);ZHM中、高剂量组MCP-1蛋白及mRNA表达量均低于高糖组,且具有剂量依赖性;ZHM中、高剂量组与海昆肾喜组比MCP-1蛋白及mRNA表达差异无统计学意义。结论:高糖可诱导HMC中MCP-1表达,而ZHM可通过抑制高糖条件下HMC中MCP-1蛋白及mRNA表达,发挥对DKD的防治作用。     

六味地黄丸含药血清减弱高糖环境下肾系膜细胞的增殖和炎性因子表达

目的:观察六味地黄丸含药血清对高糖环境下培养的大鼠系膜细胞增殖和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)表达的影响。方法:制备不同剂量大鼠六味地黄丸含药血清,并培养高糖诱导的大鼠系膜细胞。分别给予以下分组处理:空白(NG)组,高糖(HG)组,HG+对照血清组(10%对照血清),HG+低剂量组(2.5%六味地黄丸血清+7.5%对照血清),HG+中剂量组(5%六味地黄丸血清+5%对照血清),HG+高剂量组(10%六味地黄丸血清)。六味地黄丸含药血清处理24,48 h后,采用四甲基偶氮唑盐法和5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)掺入法观察系膜细胞活性和增殖的变化,使用ELISA检测细胞培养上清液中MCP-1和ICAM-1分泌量,RT-PCR法检测系膜细胞MCP-1和ICAM-1 mRNA表达。结果:与空白组比较,高糖组在培养的24,48 h内系膜细胞的增殖活性、上清液中MCP-1和ICAM-1的含量,MCP-1和ICAM-1 mRNA的表达显著上调(P0.01)。与高糖组比较,5%和10%六味地黄丸含药血清均能逆转上述变化(P0.05),且抑制作用呈一定的时间、剂量依赖关系。结论:高糖可致系膜细胞增殖活性和MCP-1和ICAM-1的表达上调,六味地黄丸可降低增殖活性,减少MCP-1和ICAM-1分泌,下调MCP-1和ICAM-1 mRNA表达,从而有利于延缓糖尿病肾病肾小球硬化的进展。     

益肾蠲湿合剂对肾小球系膜细胞增殖及细胞外信号调节激酶激活的影响

目的 观察益肾蠲湿合剂对肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell, GMC)增殖及细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinases, ERK)磷酸化的抑制作用.方法 将含低、中、高剂量益肾蠲湿合剂的药物血清作用于10%血清-DMEM培养液培养的GMC, 分别用MTT和Western Blot方法 检测细胞增殖和磷酸化ERK1/2的表达.结果 益肾蠲湿合剂对GMC增殖有明显的抑制作用,并随着剂量的增加作用也逐渐增强.细胞总ERK在各组间无明显差别.但不同浓度的益肾蠲湿合剂均显著地抑制血清所诱导的ERK1/2的磷酸化.结论 益肾蠲湿合剂可通过抑制ERK1/2的磷酸化抑制GMC的增殖.     

清热中药对高糖培养下肾小球系膜细胞增殖的影响

为研究清热中药治疗糖尿病肾病的作用机理,验证中医理论对糖尿病发病机制的认识,并为临床用药提供依据。采用MTF比色法,观察具有清热作用的中药知母、生地、胡黄连和地骨皮水提物对体外高糖条件下培养的牛肾小球系膜细胞增殖的影响。结果显示,知母、生地和胡黄连对系膜细胞增殖有抑制作用,而地骨皮无明显作用。提示清热中药可能通过抑制系膜细胞的增殖从而对糖尿病肾病的发生产生一定的影响。     

中药对高糖作用下牛肾小球系膜细胞增殖的影响

目的研究分别具有益气、养阴、清热、活血功效的中药对高糖作用下牛肾小球系膜细胞(GMC)增殖的影响.方法采用 MTT 比色法,观察黄芪、白芍、山楂、知母、当归对体外高糖培养的牛肾小球系膜细胞增殖的影响.结果黄芪、白芍、山楂、知母对系膜细胞增殖有抑制作用,而当归无抑制作用.结论养阴益气、清热活血中药是治疗糖尿病肾病的有效药物.     

秦皮甲素对高糖诱导大鼠肾小球系膜细胞增殖及纤维连接蛋白表达的影响

目的探讨秦皮甲素对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞(HBZY-1)增殖及纤维连接蛋白(FN)表达的影响。方法采用CCK-8法检测不同浓度秦皮甲素(10、30、90μmol·L-1)对正常培养条件(含糖5.6 mmol·L-1)和高糖培养条件(含糖25 mmol·L-1)下的HBZY-1细胞增殖的影响;以PI3K抑制剂Wortmannin(1μmol·L-1)干预为对照,采用Western Blot法检测秦皮甲素对高糖培养条件下HBZY-1细胞FN蛋白表达及PI3K/Akt蛋白磷酸化水平变化的影响。结果在正常培养条件下,与正常组比较,秦皮甲素给药组(10、30、90μmol·L-1)的HBZY-1细胞增殖均无明显变化(P>0.05)。在高糖培养条件下,与正常组比较,高糖组的细胞活力明显增加(P<0.05),HBZY-1细胞FN蛋白表达和PI3K/Akt磷酸化水平明显升高(P<0.05);与高糖组比较,90μmol·L-1秦皮甲素给药组的HBZY-1细胞活力明显降低(P<0.05),FN蛋白表达和PI3K/Akt磷酸化水平亦显著下调(P<0.05)。结论秦皮甲素能够抑制高糖诱导的HBZY-1细胞增殖,下调FN蛋白表达,可能与其抑制PI3K/Akt信号通路激活密切相关。     

滋肾通络方含药血清对高糖诱导的大鼠系膜细胞增殖的影响

目的：从细胞水平观察滋肾通络方含药血清对体外培养的大鼠肾小球系膜细胞(Glomerular Mesangial Cells,GMCs)增殖的影响,探讨其在糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)防治中的可能机制。方法：体外培养培养大鼠肾小球系膜细胞株,利用噻唑蓝(3-［4,5-dimethylthylthiazol-2-yl］-2,5 diphenyltetrazolium broide,MTT)比色法动态观察各组含药血清作用下各组GMC不同时间点的增殖情况。结果：与正常组相比,高糖+LPS能明显刺激体外培养的GMC增殖,而与模型组相比,滋肾通络方含药血清能明显抑制GMC增殖。结论：高糖+LPS可促进GMC增殖,滋肾通络方含药血清能明显抑制高糖+LPS条件下GMC增殖,从而发挥预防和治疗肾小球硬化,进而延缓DN的进展。     

肾康注射液对系膜细胞肥大及p21~(CIP1/WAF1)、p27~(KIP1)表达的影响

目的观察肾康注射液对高糖培养大鼠肾小球系膜细胞肥大及p21~(CIP1/WAF1)(p21)、p27~(KIP1)(p27) mRNA及蛋白质表达的影响。方法将体外培养的大鼠肾小球系膜细胞分为6组,分别为正常组、甘露醇组、高糖组、高糖加肾康注射液高、中、低剂量组,用[~3H]胸腺嘧啶核苷([~3H]TdR)及[~3H]亮氨酸([~3H] Leu)掺入法反应细胞DNA及蛋白质的合成情况,RT-PCR、Western blot检测p21mRNA及p21、p27蛋白质表达情况。结果高糖培养肾小球系膜细胞蛋白质合成增加,DNA合成减少,p21mRNA及蛋白质、p27蛋白质表达增加；肾康注射液组与高糖组比较,蛋白质合成减少,DNA合成增加,p21mRNA及蛋白质、p27蛋白质表达降低。结论肾康注射液可能部分通过降低p21、p27过表达来阻止高糖诱导肾小球系膜细胞的肥大反应。     

肾康丸对高糖培养的大鼠系膜细胞TGF-β1及FN的影响

目的:观察肾康丸对高糖培养大鼠系膜细胞(MC)分泌转化生长因子(TGF-β1,及纤连蛋白(FN)分泌mRNA表达的影响,探讨其防治DN的分子机制。方法:体外培养大鼠MC,将细胞分为6组:低糖组、高糖组、正常血清组、开搏通组、肾康丸高、低剂量组。培养72 h后,采用双抗夹心酶联免疫吸附(ELISA)法检测高糖对MC分泌TGF-β1和FN的影响;采用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)法检测高糖对TGF-β1和FN mRNA的表达的影响;同时研究药物血清对上述指标的影响。结果:高糖可以促进MC分泌TGF-β1和FN,并提高MC中TGF-β1和FN mR-NA的表达,肾康丸可以明显抑制上述作用。结论:肾康丸可以通过TGF-β1途径抑制MC基质分泌。     

两色金鸡菊黄酮提取物对高糖高脂诱导的大鼠肾小球系膜细胞纤维化的影响及相关机制研究

目的:探讨两色金鸡菊黄酮取物对高糖高脂诱导大鼠肾小球系膜纤维化的影响及其作用机制。方法:通过高糖高脂诱导大鼠肾小球系膜细胞建立体外糖尿病肾病细胞模型,使用不同浓度的两色金鸡菊黄酮提取物进行干预,采用CCK-8细胞增殖实验结合细胞形态学观察确定黄酮提取物的使用浓度后将细胞共分为5组,分别为正常对照组、模型组及两色金鸡菊黄酮提取物25、50、100μg/mL组,采用Western blot法检测纤维化因子纤维连接蛋白(FN)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达,并通过检测转化生长因子-β_1(TGF-β_1)、信号分子Smad2、磷酸化Smad2(p-Smad2)、Smad4、NADPH氧化酶4(Nox4)蛋白研究两色金鸡菊黄酮提取物的抗纤维化机制。结果:两色金鸡菊黄酮提取物能显著抑制高糖高脂诱导大鼠肾小球系膜细胞中纤维化因子的表达。结论:两色金鸡菊黄酮提取物能抑制高糖高脂诱导的大鼠肾小球系膜的纤维化,其作用机制可能与调节TGF-β_1/Smads/Nox4信号通路有关。     

特女贞苷对高糖刺激的肾小球系膜细胞凋亡的保护作用

目的: 研究特女贞苷对高糖刺激的小鼠肾小球系膜细胞凋亡的保护作用。方法: 体外培养小鼠肾小球系膜细胞,采用MTT法观察特女贞苷对细胞活力的影响(n=6),选择安全浓度。高糖刺激肾小球系膜细胞模拟糖尿病肾病模型,以100,50,25 μmol·L^-1特女贞苷对肾小球系膜细胞作用48 h,采用流式细胞术检测细胞凋亡率(n=10),以Western blot法进一步考察特女贞苷对肾小球系膜细胞中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved-caspase 3),B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达的影响(n=3)。结果: 高糖刺激肾小球系膜细胞凋亡率明显增加,蛋白水平caspase 3表达上调,Bcl-2/Bax明显下降(P<0.05)。100,50,25 μmol·L^-1特女贞苷均能显著抑制高糖刺激的肾小球系膜细胞凋亡和下调cleaved-caspase 3蛋白表达,明显上调Bcl-2/Bax(P<0.01,P<0.05),作用呈浓度依赖。结论: 特女贞苷对高糖刺激的肾小球系膜细胞凋亡具有明显的保护作用,这可能与其上调Bcl-2/Bax和抑制caspase 3激活有关。     

两色金鸡菊提取物对大鼠肾小球系膜细胞增殖及纤维化因子表达的影响

目的:本研究通过高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞建立糖尿病肾病的体外模型,观察两色金鸡菊乙酸乙酯提取物(ethyl acetate extract of Coreopsis tinctoria,AC)对模型中细胞增殖及纤维化因子表达的影响。方法:采用AC对高糖诱导大鼠肾小球系膜细胞进行干预,将细胞分为正常组,模组组,AC不同质量浓度(25,50,100,150 mg·L~(-1))组。采用噻唑蓝(MTT)比色法,细胞增殖与活性检测(CCK8)法检测AC不同质量浓度对高糖诱导大鼠肾小球系膜细胞增殖的抑制作用;采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR),蛋白免疫印迹法(Western blot)进一步观察AC不同质量浓度对肾脏纤维化蛋白转化生长因子-β_1(TGF-β_1),胶原蛋白Ⅳ(CollagenⅣ),纤维连接蛋白(FN)表达的影响。结果:AC 50,100,150 mg·L~(-1)组均能抑制高糖诱导大鼠肾小球系膜细胞的增殖(P0.01);AC 25,100,150 mg·L~(-1)质量浓度组显著降低细胞中TGF-β_1的mRNA与蛋白表达水平(P0.01);AC 100,150 mg·L~(-1)质量浓度组显著抑制细胞中CollagenⅣmRNA与蛋白的表达水平(P0.01);AC 50,100,150 mg·L~(-1)质量浓度组显著抑制细胞中FN mRNA与蛋白的表达水平(P0.01)。结论:两色金鸡菊乙酸乙酯提取物可能通过抑制大鼠肾小球系膜细胞增殖及纤维化因子表达发挥其对糖尿病肾病肾脏保护作用。