奥美拉唑逆转人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP耐药性的研究

目的:探讨液泡ATPase[vacuolar (H+)-ATPase, V-ATPase]非特异性抑制剂奥美拉唑(omeprazole ,OME)逆转人肺腺癌耐药细胞株A549/DDP的耐药性及可能的作用机制.方法:以非细胞毒性浓度4 μg/mL的OME预处理A549/DDP细胞24 h,再用2 μg/mL顺铂(cisplatin, DDP)处理 A549/DDP细胞.MTT法检测细胞的增殖抑制率,激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope,LSCM)法间接检测细胞内pH值的变化,FCM法检测凋亡相关蛋白Bcl-2和PTEN的表达,RT-PCR法检测V-ATPase 、Bcl-2和PTEN mRNA的表达.结果:OME具有逆转A549/DDP细胞耐药性的作用,逆转倍数为1.45 (P<0.01);OME预处理后A549/DDP细胞内pH值明显降低,Bcl-2蛋白表达下降,PTEN蛋白表达增加(P<0.01).V-ATPase在亲本A549及A549/DDP细胞中相对表达量分别为0.88±0.00和0.99±0.00 (P<0.01);A549/DDP细胞中V-ATPase在有无OME预处理的情况下的相对表达量分别为1.09±0.00和1.05±0.02,差异无统计学意义.Bcl-2 mRNA相对表达量下降(P<0.01),PTEN mRNA相对表达量增加(P<0.01).结论:V-ATPase在A549/DDP细胞中高表达,OME能部分逆转A549/DDP耐药性,其作用机制可能与上调PTEN和下调Bcl-2 表达有关.     

人参单体Rh2诱导人肺腺癌A549/DDP细胞凋亡的体外研究

背景与目的肺癌已成为人类癌症主要死亡原因之一.从植物中开发抗肿瘤药物是国内外抗肿瘤新药开发的一个热点.本研究的目的是观察人参单体Rh2诱导人肺腺癌A549/DDP细胞系凋亡的作用,并探讨其可能的分子机制.方法体外培养的人肺腺癌A549/DDP细胞经不同浓度梯度的人参单体Rh2干预,分别应用MTT实验观察其对细胞增殖的影响,用流式细胞术检测细胞周期、凋亡指数及相关基因表达的改变,以及用双抗体夹心ELISA法测定细胞上清液sApo-1/Fas浓度变化.结果①人参单体Rh2可抑制A549/DDP细胞的生长,并呈剂量、时间依赖作用.②人参单体Rh2处理A549/DDP细胞24 h,实验组凋亡指数显著高于对照组(P＜0.001),G0/G1期细胞比例显著高于对照组(P＜0.01),S期细胞比例显著低于对照组(P＜0.01),G2/M期细胞比例与对照组比较无显著性差异(P＞0.05).③实验组p53、Fas阳性表达率显著高于对照组(P＜0.01,P＜0.001),Bcl-2阳性表达率显著低于对照组(P＜0.001).④实验组A549/DDP细胞培养上清液于不同时间sApo-1/Fas含量均显著低于对照组(P＜0.05).结论人参单体Rh2具有诱导人肺腺癌A549/DDP细胞凋亡的作用,其分子机制可能是上调p53和Fas及下调Bcl-2的表达、通过Fas/FasL系统途径诱导细胞凋亡.     

人肺腺癌A549/DDP耐药细胞减弱顺铂诱导的细胞凋亡

目的：探讨人肺腺癌Ａ５４９／ＤＤＰ耐药细胞的多药抗药机理。方法;应用形态学观察、琼脂糖凝胶电泳、原位ＤＮＡ断裂点的末端标记法观察细胞亡的状况,用免疫组化法检测ｂｃｌ－２基因的表达。结果：癌细胞在顺铂作用下产生了典型的凋亡形态学改革。３μｇ／ｍｌ,５μｇ／ｍｌ,７μｇ／ｍｌ顺铂作用４８小时,Ａ５４９细胞ＤＮＡ裂解片断呈现典型的阶梯状排列条喧,而在５μｇ／ｍｌ、７μｇ／ｍｌ顺铂作用４８小时,Ａ５４９／     

基因工程腺病毒H101逆转A549/DDP细胞对顺铂耐药性的实验研究

背景及目的:耐药性产生是化疗失败的主要原因之一,克服耐药性的方法之一是使用逆转剂。目前尚无一种理想的、可应用于临床的顺铂(DDP)耐药逆转剂。本研究探讨基因工程腺病毒H101对DDP耐药性的逆转作用及其机制。方法:体外利用人肺腺癌细胞株A549的DDP耐药模型A549/DDP,采用MTT法检测H101对A549/DDP细胞耐药性的逆转作用。用流式细胞仪(FCM)测定细胞多药耐药蛋白1(multidrugresistantprotein1,MRP1)、谷胱甘肽鄄S鄄转移酶(GST)及TOPO鄄Ⅱ蛋白表达量,荧光鄄考马斯亮蓝法检测细胞内GSH含量,原子吸收法测定细胞内铂浓度。结果:A549/DDP细胞对DDP的耐药指数为14.3。加入H101后,DDP对A549/DDP的半数抑制浓度(IC50)由352.4μmol/L降至61.6μmol/L,逆转倍数为5.7倍。FCM检测结果显示,A549/DDP细胞的GST和TOPO鄄Ⅱ蛋白水平均较A549细胞高,而两种细胞内均未检测到MRP1的表达,经H101处理后的A549/DDP细胞胞内GST蛋白和TOPO鄄Ⅱ蛋白水平均明显下降。A549/DDP胞内GSH含量比A549高2倍多;H101感染A549/DDP细胞后,胞内的GSH含量下降,随着H101剂量的增加,胞内GSH含量逐渐下降,达A549细胞内GSH水平。原子吸收法测定细胞内铂含量的结果显示,A549细胞内铂含量是A549/DDP细胞内铂含量的3倍,加入H101后,A549细胞内铂的含量无明显变化,但A549/DDP细胞内铂的含量明显增加。结论:H101能逆转A549/DDP对DDP的耐药性,H101逆转DDP耐药性的机制可能是减少A549/DDP细胞内GSH和TOPOⅡ蛋白的水平,增加了A549/DDP细胞内铂的蓄积。     

黄芪多糖降低A549/DDP肺腺癌细胞顺铂耐药机制研究

目的:研究黄芪多糖对A549/DDP肺腺癌细胞顺铂耐药的影响及可能机制。方法:将A549/DDP顺铂耐药肺腺癌细胞分为CON组（未行黄芪多糖及顺铂处理）、APS组（仅用黄芪多糖处理）、DDP组（仅用顺铂处理）及A+D组（黄芪多糖联合顺铂处理）,比较四组细胞增殖、细胞周期及凋亡率和耐药基因表达的差异。结果:A+D组细胞d1-d7吸光度、S期、G2/M期和PI均显著低于CON组、APS组和DDP组细胞（均P<0.05）,G0/G1期和凋亡率均显著高于CON组、APS组和DDP组细胞（均P<0.05）;APS组和A+D组细胞MDR1和MRP基因mRNA表达无明显差异（均P>0.05）,且均显著低于CON组和DDP组（均P<0.05）。结论:黄芪多糖可显著改善A549/DDP肺腺癌细胞对顺铂耐药性,可能与黄芪多糖显著降低MDR1和MRP有关。     

重组人血管内皮抑素对肺腺癌A549细胞生长及凋亡的影响

目的：探讨重组人血管内皮抑素（恩度）对肺腺癌A549细胞生长及凋亡的影响。方法：应用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测恩度对肺腺癌A549细胞的生长抑制作用,流式细胞仪检测肺腺癌A549细胞的凋亡率,比较各浓度药物对肺腺癌A549细胞的诱导凋亡作用。结果：恩度可以抑制肺腺癌A549细胞的生长,且呈时间剂量依赖性。恩度可以诱导肺腺癌A549细胞的凋亡,随浓度增加、作用时间的延长,凋亡率增加,与对照组相比,差异有统计学意义（P〈0．001）。结论：恩度对肺腺癌A549细胞的生长具有明显的抑制作用,主要通过诱导肺腺癌A549细胞的凋亡引起。     

苯丁酸调控对顺铂抑制人肺腺癌A549/DDP耐药细胞株增殖与侵袭协同作用研究

目的肺癌已成为威胁人类生存的重要杀手,且随着环境恶化,其发病率和死亡率有逐年升高趋势。本研究分析4-苯丁酸对顺铂作用下人肺腺癌耐药细胞株A549/DDP细胞增殖和侵袭影响,为临床治疗提供参考。方法体外培养人肺腺癌耐药细胞株A549/DDP至生长状态良好,分析顺铂及4-苯丁酸联合顺铂对A549/DDP细胞株增殖作用,酶联免疫吸附测定法分析细胞凋亡相关蛋白表达变化,Transwell实验分析细胞侵袭力变化,蛋白质印迹法和免疫细胞化学分析细胞中JAK/STAT信号通路蛋白表达变化。结果随着时间延长,各组对A549/DDP细胞株增殖抑制率呈上升趋势,且高剂量4-苯丁酸联合顺铂组对A549/DDP细胞株增殖抑制率较高,差异有统计学意义,F药物=110.342,P<0.001;F时间=34.527,P<0.001;F药物×时间=58.321,P<0.001。与对照组相比,低剂量4-苯丁酸联合顺铂组和高剂量4-苯丁酸联合顺铂组细胞凋亡蛋白Bcl-2水平降低,Bax、Caspase-3和Caspase-6水平升高,均P<0.001。对照组、顺铂组、低剂量4-苯丁酸联合顺铂组和高剂量4-苯丁酸联合顺铂组细胞侵袭力分别为423.3±35.6、389.3±24.7、375.6±35.2和285.6±23.9,F=44.458,P<0.001;蛋白质印迹法检测发现对照组、顺铂组、低剂量4-苯丁酸联合顺铂组和高剂量4-苯丁酸联合顺铂组JAK2水平分别为1.32±0.26、1.01±0.24、0.90±0.12和0.74±0.13,F=18.633,P<0.001;STAT2水平分别为0.78±0.13、0.70±0.15、0.62±0.09和0.54±0.09,F=18.996,P<0.001;STAT3水平分别为1.01±0.23、0.89±0.14、0.74±0.10和0.40±0.10,F=19.687,P<0.001。免疫细胞化学法检测发现对照组、顺铂组、低剂量4-苯丁酸联合顺铂组和高剂量4-苯丁酸联合顺铂组JAK2水平分别为0.85±0.14、0.78±0.11、0.62±0.17和0.52±0.09,F=21.854,P<0.001;STAT2水平分别为0.85±0.20、0.77±0.14、0.69±0.08和0.52±0.13,F=17.852,P<0.001;STAT3水平分别为0.63±0.14、0.57±0.11、0.50±0.09和0.42±0.08,F=29.754,P<0.001。结论4-苯丁酸调控对顺铂作用下人肺腺癌耐药细胞株A549/DDP细胞增殖、侵袭有明显抑制作用,且其作用可能与影响JAK/STAT信号通路蛋白表达有关。     

5-氮-2'-脱氧胞苷逆转人非小细胞肺癌A549/DDP细胞对顺铂的耐药性

目的 探讨5-氮-2'-脱氧胞苷(5-Aza-dc)逆转耐顺铂(DDP)的A549/DDP细胞对DDP的耐药性及其可能的机制.方法 以耐DDP的人非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系A549/DDP为研究对象,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测5-Aza-de对A549/DDP细胞的毒性作用和对A549/DDP细胞的耐药逆转指数(RI);采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法检测5-Aza-de干预前后的A549/DDP细胞hMLH1基因启动子甲基化状态和基因表达情况.结果 20 μmol/L 5-Aza-dc(无毒剂量组)和40 μmol/L5-Aza-dc(低毒剂量组)干预A549/DDP细胞48 h后,其R1分别为1.82和4.42.MSP结果显示,A549/DDP细胞中,hMLH1基因启动子区呈部分甲基化状态;经无毒和低毒剂量5-Aza-dc处理A549/DDP细胞48 h后,hMLH1基因启动子区发生DNA去甲基化.无毒剂量组和低毒剂量组的hMLH1 mRNA相对表达量分别为2.05±0.08和2.00±0.03,hMLHl蛋白相对表达鼍分别为1.74±0.14和1.65±0.11.结论 5-Aza-dc能部分逆转A549/DDP细胞的DDP耐药,其机制可能与去除hMLH1基因启动子甲基化、上调其基因表达有关.

Abstract：

Objective The aim of this study was to investigate the effect of 5-aza-2'-deoxycytidine (5-Aza-dc), a methylation inhibitor, on cisplatin-resistance in non-small cell lung cancer cell line A549/ DDP and to explore its possible mechanism. Methods MTT assay was used to test the cytotoxicity of 5-Aza-dc on A549/DDP cells, and the IC50, and cisplatin resistance index of A540/DDP cells at 48 hours after 5-Aza-dc (0 μmol/L, 20 μmol/L, 40 μmol/L) treatment at different concentrations. MSP, fluorescence quantitative RT-PCR (real-time RT-PCR) and Western blot were used to detect the hMLH1 methylation status,mRNA and protein expressions, espectively. Results The IC50 value of cisplatin in AS49/DDP cells was 30.15 ±0.76 μmol/L. The MTT assay results demonstrated that during the 5-Aza-dc treatment for 48 hours, the dose of 20 μmol/L was non-toxic and 40 μmol/L was low-toxic. 5-Aza-dc at those two doses reduced IC50 value of cisplatin to 16. 54 ±0. 35 μmol/L (RI = 1. 82) and 6. 82 ±0. 16 μmol/L ( RI = 4.42) , respectively. MSP, real-time RT-PCR and Western blot showed that 5-Aza-dc at non-toxic and low-toxic doses removed the partial hMLH1-hypermethylation, and up-regulated hMLH1 mRNA and protein expressions. Conclusions Low dose 5-Aza-dc can partially reverse the cisplatin-resistance in A549/DDP cells, which may be achived through removal of hMLH1 hypermethylation and increased expression of hMLH1 gene. 5-Aza-dc may have a role in increasing the efficacy of chemotherapy for patients whose tumors are lack of hMLHl expression because of hMLHl promoter hypermethylation.     

放疗联合周剂量重组人血管内皮抑素对A549肺腺癌裸鼠移植瘤生长抑制作用的研究

目的:研究放疗联合周剂量重组人血管内皮抑素(recombinant human endostatin, rh-Endostatin)对肺腺癌A549裸鼠移植瘤生长的抑制作用.方法: 40 只裸鼠A549细胞移植瘤模型随机分成4组:空白对照组、rh-Endostatin治疗组、放射治疗组和放疗联合rh-Endostatin治疗组,观察并绘制肿瘤生长曲线图,计算肿瘤体积抑制率;肿瘤组织行常规HE病理学检查,免疫组织化学法检测肿瘤组织中微血管内皮CD31的表达及肿瘤微血管密度(microvessel density, MVD)的变化;采用免疫组织化学及Western印迹法检测血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的表达;TUNEL法检测肿瘤细胞的凋亡. 结果:治疗第8天起,放疗联合rh-Endostatin治疗组的肿瘤体积与对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.05).15 d后,rh-Endostatin治疗组、放射治疗组和放疗联合rh-Endostatin治疗组小鼠的肿瘤体积的抑制率依次为68.35%、90.78%和106.56%; rh-Endostatin治疗组小鼠的MVD较放射治疗组下降明显(P＜0.05);但rh-Endostatin治疗组与对照组、放疗联合rh-Endostati治疗组及放射治疗组相比,VEGF的改变差异均无统计学意义;放疗联合rh-Endostatin治疗组细胞凋亡明显.结论:放疗联合周剂量rh-Endostatin能抑制肿瘤的生长,较早诱导肿瘤退缩,可能与减少放射治疗后肿瘤血管再生及增加肿瘤细胞和内皮细胞的凋亡相关;各治疗组小鼠均未出现急性不良反应,因此该方法具有短疗程的优势,可用于临床推广.     

去甲斑蝥酸钠对耐顺铂人肺腺癌细胞系A549/DDP的逆转作用

[目的]探讨去甲斑蝥酸钠(SNCTD)对耐顺铂人肺腺癌细胞系A549/DDP的逆转作用及其对耐药细胞周期的影响。[方法]⑴采用CCK法筛选出SNCTD对A549/DDP的无毒浓度(即对细胞抑制率<10%的药物浓度),并检测出顺铂及与无毒浓度SNCTD联合对耐药细胞株的IC50。⑵光学显微镜下观察无毒浓度SNCTD组、单纯DDP处理组及联合用药组用药48h细胞形态的变化。⑶采用流式细胞仪观察用药48h后正常细胞组、无毒浓度SNCTD组、DDP组及DDP+SNCTD组对A549/DDP细胞周期的影响。[结果]⑴SNCTD对A549/DDP的无毒浓度为5μg/ml,与DDP联合用药降低A549/DDP的耐药逆转倍数为1.97。⑵无毒浓度SNCTD处理耐药细胞组光学显微镜下细胞形态未见明显改变,而联合用药组比单纯DDP作用后细胞形态明显变差。⑶无毒浓度SNCTD处理耐药细胞后细胞周期未见明显改变,单纯DDP处理后细胞阻滞在S期,联合用药后S期减少,G0/G1期细胞增多。[结论]SNCTD对A549/DDP具有耐药逆转作用,与DDP联用对耐药细胞有协同杀伤作用。     

吴茱萸碱逆转人肺癌细胞株Ａ５４９／ＤＤＰ耐药机理的实验研究

目的　观察吴茱萸碱逆转人肺腺癌耐药株Ａ５４９／ＤＤＰ细胞耐药性的效果并探讨其与阻断ＮＦ κＢ信号传导通路的相关性。方法　采用ＭＴＴ法检测单用吴茱萸碱、顺铂（ＤＤＰ）以及两药联用在不同时间对Ａ５４９／ＤＤＰ细胞的增殖影响,计算ＩＣ５０及耐药逆转倍数。流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况。ＲＴ ＰＣＲ检测各组ＭＤＲ１、ＮＦ κＢ、Ｂｃｌ-２、ＭＭＰ-２和ＶＥＧＦ的ｍＲＮＡ表达。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测各组细胞的ｐＩκＢ-α、pＩＫＫα蛋白表达水平。结果　吴茱萸碱０.１２５ｍｇ／Ｌ、０.２５ｍｇ／Ｌ针对Ａ５４９／ＤＤＰ细胞对ＤＤＰ的耐药逆转倍数分别为３.６６８和１1.４８。ＲＴ ＰＣＲ显示在吴茱萸碱作用下检测基因的ｍＲＮＡ表达随着吴茱萸碱浓度的增加和时间的延长其表达逐渐下降。当吴茱萸碱与ＤＤＰ联用时,可明显提高Ａ５４９／ＤＤＰ细胞对化疗药的敏感性,凋亡细胞显著增加（Ｐ＜０.０５）。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法结果提示Ａ５４９／ＤＤＰ细胞中ｐＩκＢ-α的表达水平随着吴茱萸碱作用时间的延长逐渐下降,ｐＩＫＫα表达则无显著变化。结论　吴茱萸碱可以通过抑制ＩκＢ-α的磷酸化阻断ＮＦ-κＢ信号通路,促进细胞凋亡,抑制细胞增殖,增加耐药细胞对ＤＤＰ的敏感性。     

肺腺癌细胞系耐药及凋亡相关基因的表达和逆转

目的 探讨顺铂耐药肺腺癌细胞系Ａ５４９＾ＤＤＰ的耐药,凋亡相关基因的表达及其与亲代细胞Ａ５４９的差异,观察差异表达基因的反义寡核苷酸的逆转作用。方法 将人工合成的反义,正义硫代脱氧寡核苷酸（Ｓ－ｏｌｉｇｏｄｌｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ,Ｓ－ＯＤＮ）经脂质体包后转染Ａ５４９＾ＤＤＰ细胞,应用ＲＴ－ＰＣＲ检测耐药及凋亡相关基因ｍＲＮＡ水平,免疫细胞化学及流式细胞－抗体检测相应蛋白及增殖抗原Ｋｉ－６７     

survivin反义寡核苷酸提高人肺腺癌A549耐药细胞系对顺铂敏感性的研究

目的探讨存活素反义寡核苷酸(ASODN)体外转染对耐顺铂人肺腺癌细胞A549/ CDDP凋亡及其对顺铂(CDDP)敏感性的影响。方法常规体外培养A549/CDDP细胞,以脂质体包裹的survivin ASODN转染细胞,采用RT-PCR法和免疫细胞化学法检测survivin mRNA及蛋白表达。通过形态学观察、DNA琼脂糖凝胶电泳、caspase-3酶活性及细胞凋亡率(AI)的测定,评价细胞凋亡程度。采用MTT法测定细胞存活率和生长抑制率,计算半效抑制浓度(IC_(50))及耐药倍数(RI)。结果转染组survivin mRNA及蛋白表达下调明显,分别达41．56%和0．864±0．045,与其他各组比较,差异均有统计学意义(P＜0．05)。细胞形态学显示有细胞凋亡改变,表现为细胞核固缩、核边集和核碎裂等;DNA凝胶电泳可见DNA梯形条带;ASODN转染组细胞凋亡率和caspase-3相对活性分别增高至34．03%和1．1298±0．2502,而ASODN+CDDP组增高更为明显,分别达65．85%和1．6805±0．2758,与其他各组比较,差异均有统计学意义(P＜0．05)。ASODN转染组和ASODN+CDDP组生长抑制率分别增高至59．3%和83．7%(P＜0．05);而ASODN转染组细胞对CDDP的IC_(50)由对照组的(225．03±10．59)μmol/L减低至(158．84±4．26)μmol/L,RI由11．9减至8．4。结论survivin ASODN通过下调survivin的表达,自身诱导了细胞凋亡,并逆转细胞对CDDP诱导的细胞凋亡的耐受,降低凋亡阈值,从而增强了人肺腺癌细胞对CDDP的敏感性。     

Reversal effect of recombinant human Endostatin on cisplatin resistance in A549/DDP human lung adenocarcinoma cells in vitro

Objective:Recombinant human Endostatin (rh-Endostatin, YH-16) can reverse cisplatin resistance in A549/DDP cells. However, the possible ef ect of rh-Endostatin in reversing DDP-resistance in A549/DDP cells and the mechanism are needed to be investigated. Methods:Lung adenocarcinoma cellline A549 and its DDP-resistant cellline A549/DDP were treated with DDP and/or recombinant human Endostatin. Dif erence in drug resistance was analyzed between dif erent regi-mens and between dif erent celllines after a 72 h-treatment in vitro. And below the non-cytotoxic concentration of rh-End-ostatin, the possibility of rh-Endostatin in reversing DDP-resistance in A549/DDP was evaluated. The resistance protein which was detected in the study included P glycoprotein (P-gp) and topoisomerase II (Topo-II). Results:Rh-Endostatin below 400μg/mL showed no cytotoxicity in either A549 or A549/DDP after 72 h-treatment with it. The inhibited concentration of 50%(IC50) observed for DDP was (0.79 ± 0.05)μg/mL in A549 and (13.2 ± 1.1) in A549/DDP respectively. IC50 was reduced to 2.57 ± 0.05μg/mL in A549/DDP treated by rh-Endostatin below the non-cytotoxic concentrations in combination with DDP, with a reversal fold (RF) of 5.14 and a relative reversal rate of 85.6%. Apoptotic rates were 2.01%, 13.47%and 29.26%re-spectively for cells treated with rh-Endostain, DDP, and the combination. The rate of the A549/DDP control group was 0.99%. The expression level of P-gp or Topo-II was higher in A549/DDP cells than in A549 cells. Rh-Endostatin may partial y reverse DDP-resistance in A549/DDP cells in vitro, with a probable mechanism related to lowering expression of P-gp and Topo-II. Conclusion:Rh-Endostatin of non-cytotoxic dose partial y reversed cisplatin resistance in cisplatin-resistant human lung adenocarcinoma cellline A549/DDP. Rh-Endostatin reversed the resistance of A549/DDP cells to DDP, which may be related to decreased protein expression of P-gp and Topo-II in A549/DDP cells.     

线粒体靶向MPG基因重组体对人非小细胞肺癌多药耐药细胞A549/DDP增殖的抑制作用

背景与目的：多药耐药是影响肺癌化疗效果的重要因素。本研究拟构建线粒体靶向人N-甲基化嘌呤DNA糖基化酶（MPG）基因真核表达载体,观察其在稳定转染的人非小细胞肺癌多药耐药细胞线粒体内的表达情况,并研究其对多药耐药细胞增殖的抑制作用。方法：应用重叠延伸剪接技术重组锰超氧化物歧化酶（MnSOD）线粒体靶向序列-MPG融合基因（mito—MPG）;构建pCMV—Script／mito MPG重组真核表达载体：脂质体将其转染至人非小细胞肺癌多药耐药细胞A549／DDP;G418筛选稳定表达的转染细胞：RT—PCR检测mito—MPG基因mRNA的表达水平;分离线粒体蛋白后应用Western blot检测MPG在线粒体内的表达水平：台盼蓝拒染法检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞周期分布。结果：构建的融合基因经过DNA测序分析;构建的重组载体经限制性酶切分析及DNA测序分析证实为pCMV-Script／mito-MPG重组真核表达载体：转染pCMV-Script／mito—MPG载体组（MPG组）检测到mito—MPG mRNA的表达。转染pCMV—Script载体组（P组）及未转染组（C组）细胞内则未检测到;MPG组细胞线粒体内检测到MPG,P组及C组则未检测到;MPG组细胞增殖能力明显下降,P组及C组细胞增殖能力无明显差异．倍增时间分别为72．6h（C组）、73．5h（P组）、98．9h（MPG组）;分裂增殖指数分别为51.3％（C组）、54_3％（P组）、26．1％（MPG组）,MPG组出现亚二倍体峰。结论：成功构建了线粒体靶向人MPG基因表达载体。MPG在MnSOD线粒体靶向序列的引导下．顺利地进入了A549／DDP细胞线粒体内,并导致其增殖能力下降．部分细胞死亡。