日本血吸虫再感染相关蛋白基因的克隆和原核表达

目的　从日本血吸虫 (S .japonicum )尾蚴文库扩增S .japonicum再感染相关蛋白 (RIRP)基因 ,进行克隆并原核表达出RIRP ,为进一步的功能研究奠定基础。　方法　根据已登陆的S .japonicum成虫期RIRP基因的序列设计两条特异引物 ,以S .japonicum尾蚴cDNA文库为模板扩增RIRP基因cDNA ,将该基因的cDNA克隆入原核表达载体 pGEX 4T 1和真核载体 pcD NA3 .1。转化的克隆通过氨苄青霉素的筛选、PCR扩增、双酶切和最后的测序鉴定。重组的 pGEX 4T 1/RIRP在大肠埃希菌BL2 1(DE3 )中进行表达。SDS PAGE鉴定其在大肠埃希菌中的表达情况和分子质量。用抗 2 6kuGST单抗作western杂交进一步鉴定融合蛋白的表达。　结果　从S .japonicum尾蚴文库中扩增出一条长为 462bp的cDNA片段 ,经测序证实其为RIRP基因的全长cDNA。它编码含 15 3个氨基酸的蛋白质—RIRP ,预测其分子质量单位为 17.5 45ku。RIRPcDNA已被成功克隆入 pGEX 4T 1和pcDNA3 .1载体 ,大肠埃希菌BL2 1(DE3 )编码一个约 17ku的蛋白质。　结论　RIRP基因首次从S .japonicum尾蚴文库中扩增出来 ,并成功构建了原核和真核表达载体 ,而且 ,它首次由大肠埃希菌表达 ,表达蛋白的分子质量单位约 17ku。     

阴道毛滴虫TPI基因克隆及原核表达

目的构建阴道毛滴虫TPI基因原核表达载体,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达。方法根据阴道毛滴虫TPI基因开放阅读框设计并合成特异性引物,以阴道毛滴虫总cDNA为模板PCR扩增目的片段,与pMD-18-T连接构建克隆载体pMD-TPI,经双酶切回收目的片段,与表达载体pGEX-T连接,构建原核表达载体pGEX-TPI,经IPTG诱导后通过SDS-PAGE及Western blot鉴定表达产物。结果成功构建了阴道毛滴虫TPI基因原核表达载体pGEX-TPI;SDS-PAGE电泳显示,在IPTG诱导下重组质粒转化菌高效表达分子质量单位为27.5ku的蛋白质;Western blot显示表达产物可被抗阴道毛滴虫的多克隆血清识别。结论成功构建了TPI基因原核表达载体,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中高效表达,为进一步研究阴道毛滴虫TPI基因功能奠定了基础。     

十二指肠钩虫锰超氧化物岐化酶基因的克隆与表达

目的克隆十二指肠钩虫锰超氧化物岐化酶（AdMn-SOD）基因,并在大肠埃希菌中表达。方法用3′RACE及RT-PCR技术扩增获得AdMn-SOD全长cDNA编码序列;设计引物,克隆AdMn-SOD成熟肽编码序列,连接到原核表达载体pET32a,构建重组表达质粒,转化大肠埃希菌BL21（DE3）并用IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达情况,诱导表达的重组蛋白用Ni亲和层析进行纯化。结果成功克隆获得AdMn-SOD全长cDNA序列,推导编码的氨基酸序列具有Mn-SOD的保守结构特征;构建了pET32a/AdMn-SOD原核表达重组质粒,AdMn-SOD在大肠埃希菌中得到高效表达,表达的融合蛋白的分子质量单位约为40ku。结论成功克隆并表达了十二指肠钩虫锰超氧化物岐化酶基因,为进一步了解十二指肠钩虫锰超氧化物岐化酶的特性与功能奠定了基础。     

华支睾吸虫3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆、表达和序列分析

目的 通过筛选华支睾吸虫成虫cDNA质粒文库，寻找、识别新基因，并将其编码区克隆到原核表达质粒pGEX-4T-1中，表达出融合蛋白，为进一步研究其功能奠定基础。方法用文库通用引物对华支睾吸虫cDNA质粒文库进行PCR扩增，对产物为500bp以上的质粒进行测序，测序结果在NCBI和ExPasy，网站上进行序列分析，识别华支睾吸虫新基因，并应用ORFfind、ClustalW、NCBI Conserved Domain Search等程序对其进行开放阅读框、进化树及结构域分析。根据pGEX-4T-1上的多克隆位点及所发现的新基因cDNA编码序列设计引物，进行PCR扩增，扩增产物回收纯化后克隆到原核表达载体pGEx-4T-1上。构建的重组表达质粒经PCR、双酶切及测序鉴定，并对鉴定过的重组体进行诱导表达，表达产物经SDS-PAGE电泳鉴定。结果 发现CsGAPDH基因，完整阅读框含1017个碱基对，编码339个氨基酸，理论分子质量单位为37．02409ku，理论pI为6．66。序列分析显示，CsGAPDH与曼氏血吸虫GAPDH的同源性为78％，具有GAPDH保守功能域。所构建的重组原核表达质粒经PCR、双酶切及测序鉴定与目标基因相符。SDS-PAGE电泳显示表达产物在63ku处有1条特异性条带。结论 发现华支睾吸虫GAPDH基因，成功构建重组原核表达质粒并表达出融合蛋白。     

华支睾吸虫mGST新基因的克隆、表达与纯化

目的扩增华支睾吸虫一个微粒体谷胱甘肽转移酶（mGST）新基因,明确是否存在内含子,并进行原核表达与纯化. 方法用PCR方法分别从华支睾吸虫成虫cDNA（质粒）文库和基因组DNA中扩增mGST基因并测序,将编码基因定向克隆到原核表达载体pET-30a（＋）,在大肠埃希菌BL21/DE3中表达,按照Ni-NTA agarose说明书纯化重组蛋白,用SDS-PAGE和TLC分析. 结果 mGST基因全长486 bp,没有内含子,构建的原核表达质粒pET-30a（＋）-mGST在大肠埃希菌中得到了有效表达,融合蛋白的分子质量单位约为24 ku.重组蛋白达细菌总蛋白质的11%,纯化后的重组蛋白纯度为83%. 结论 mGST基因没有内含子,在大肠埃希菌中能有效表达,得到了纯化的重组蛋白,为进一步研究其功能奠定了基础.     

华支睾吸虫mGST新基因的克隆、表达与纯化

目的扩增华支睾吸虫一个微粒体谷胱甘肽转移酶(mGST)新基因,明确是否存在内含子,并进行原核表达与纯化. 方法用PCR方法分别从华支睾吸虫成虫cDNA(质粒)文库和基因组DNA中扩增mGST基因并测序,将编码基因定向克隆到原核表达载体pET-30a(+),在大肠埃希菌BL21/DE3中表达,按照Ni-NTA agarose说明书纯化重组蛋白,用SDS-PAGE和TLC分析. 结果 mGST基因全长486 bp,没有内含子,构建的原核表达质粒pET-30a(+)-mGST在大肠埃希菌中得到了有效表达,融合蛋白的分子质量单位约为24 ku.重组蛋白达细菌总蛋白质的11%,纯化后的重组蛋白纯度为83%. 结论 mGST基因没有内含子,在大肠埃希菌中能有效表达,得到了纯化的重组蛋白,为进一步研究其功能奠定了基础.     

新孢子虫NcSAG4基因克隆及原核表达

目的构建新孢子虫NcSAG4基因原核表达载体,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达。方法根据新孢子虫NcSAG4基因序列设计特异性引物,以新孢子虫总核酸为模板PCR扩增目的片段,与pMD-18-T连接,构建克隆载体pMD-NcSAG4,经双酶切后回收目的片段,与表达载体pGEX-T连接,构建原核表达载体pGEX-NcSAG4,用IPTG诱导,通过SDS-PAGE及Western blot进行鉴定。结果成功构建了新孢子虫NcSAG4基因原核表达载体pGEX-Nc-SAG4;SDS-PAGE电泳显示,在IPTG诱导下阳性菌高效表达了分子质量单位为18.79ku的蛋白质;Western blot显示表达产物可被抗新孢子虫的多克隆血清识别。结论成功构建了NcSAG4基因原核表达载体,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中高效表达,为建立经济、实用的诊断新孢子虫病的ELISA方法奠定了基础。     

尿路致病性大肠埃希菌Ⅰ型菌毛fimH基因真核表达载体pcDNA3.0-fimH的构建及鉴定

目的构建尿路致病性大肠埃希菌Ⅰ型菌毛的fimH基因真核表达载体,为尿路致病性大肠埃希菌的核酸疫苗研制奠定基础。方法通过PCR扩增尿路致病性大肠埃希菌临床分离株的fimH全基因序列,克隆至pMD19-T载体,PCR、酶切及测序鉴定后,将fimH基因片段克隆至真核表达载体pcDNA3.0,构建pcDNA3.0-fimH重组质粒,并进行PCR和酶切鉴定。结果 PCR扩增尿路致病性大肠埃希菌fimH基因片段为910 bp;构建的pcDNA3.0-fimH重组质粒经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切,产生1个与fimH基因PCR产物大小一致的小片段和1个不同于pcDNA3.0-fimH重组质粒的大片段,表明fimH基因已成功插入pcDNA3.0质粒中。结论成功构建尿路致病性大肠埃希菌fimH基因真核表达载体pcDNA3.0-fimH。     

巨型艾美耳球虫ADF基因的克隆及原核表达

目的克隆巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)的ADF基因,并进行原核表达。方法采用RT-PCR方法扩增ADF基因,并将其与原核表达载体pET-28a连接,构建原核表达载体pET-28a-ADF,转化入大肠埃希菌Rossata(DE3)中,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。结果重组原核表达质粒经双酶切及测序鉴定结果正确。表达分子质量单位为17ku的融合蛋白。Western blot检测融合蛋白能被抗E.maxima多克隆抗体识别。结论构建的原核表达载体pET-28a-ADF能表达具有反应原性的蛋白,为其免疫原性研究奠定了基础。     

周期型马来丝虫HSP70基因原核表达载体的构建及表达产物的分析

目的在大肠埃希菌宿主系统中表达周期型马来丝虫热休克蛋白70(HSP70)基因,并对表达产物进行SDS-PAGE分析。方法以重组质粒pGEM-T-HSP70为模板,根据报道的HSP70基因序列设计合成一对引物,用PCR法扩增HSP70基因(包括完整开放读码框架片段及其上下游序列共长2 198 bp),PCR产物定向插入原核表达载体pGEX-4T-3中,构建的重组质粒pGEX-4T-3-HSP70经双酶切鉴定。将重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),用IPTG诱导GST．Tag融合蛋白的表达,经SDS-PAGE分析并经凝胶图像分析确定目的蛋白的表达水平。结果重组表达质粒pGEX-4T-3-HSP70全长约7 200 bp,经双酶切后应得到长度为4 968 bp的载体和2 198 bp的目的基因2个片段,1%琼脂糖凝胶电泳显示结果同预期完全相符。HSP70相对分子质量(Mr)为70×10~3,质粒pGEX-4T-3的融合部分(GST．Tag)表达产物的Mr约为26×10~3,将重组质粒转化BL-21 (DE3)菌,经IPTG诱导表达,菌体蛋白的SDS-PAGE图谱显示,诱导组出现特异性蛋白表达条带,其Mr约100×10~3,与预计大小相同。目的蛋白占菌体总蛋白的12%左右。结论成功地构建了重组原核表达载体pGEX-4T- 3-HSP70：周期型马来丝虫HSP70基因可在大肠埃希菌中稳定表达,为制备和纯化表达蛋白以及丝虫病疫苗的进一步研究打下基础。     

刚地弓形虫RACK1蛋白与PKC蛋白结合作用的研究

目的研究刚地弓形虫RACK1蛋白与PKC蛋白之间的结合特性。方法采用PCR方法扩增弓形虫RACK1基因,双酶切后与pGEX-4T-1连接,构建原核表达载体pGEX-4T-1-RACK1,转化入BL21大肠埃希菌中,用0.8mmol/L IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE检测并进行Ni-IDA亲和层析纯化,采用Western blot分析RACK1蛋白与PKC蛋白的结合作用。结果 PCR扩增出966bp的RACK1基因开放读码框,成功构建pGEX-4T-1-RACK1原核表达载体,转化BL21后用IPTG诱导4h~6h,SDS-PAGE检测到约36ku的表达产物,Western blot检测RACK1蛋白能与PKC蛋白结合。结论成功构建了pGEX-4T-1原核表达载体,表达产物RACK1蛋白能与PKC蛋白结合。     

间日疟原虫MSP1 C端基因亚克隆及在大肠埃希菌中的融合表达

目的 在大肠埃希菌中融合表达间日疟原虫MSP1 C端编码基因，以获得能作为检测抗原的重组蛋白GSTPvMSP1 C。方法 以限制性内切酶BamH Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切质粒pMD／PvMSP1C，获得间日疟原虫MSP1 C端编码基因片段．柱纯化后，插入表达质粒载体的多克隆位点，构建重组体pGEX-4T-2／PvMSP1C，并转化大肠埃希菌BL21(DE3)，阳性克隆以限制性酶切分析鉴定后，以IPTG进行诱导表达，表达产物以SDS-PAGE电泳与免疫印迹分析。结果 双酶切质粒pMD／PvMSP1C，获得1 119bp的PvMSP1 C编码基因片段，与预期片段大小相符；所构建的pGEX-4T-2／PvMSP1C重组体阳性克隆经双酶切鉴定与预期结果一致；SDS-PAGE电泳显示，GST-PvMSP1C融合表达蛋白的大小约63 ku，且能够分别被GST抗体与间日疟患者的血清所识别。结论 成功亚克隆并构建了间日疟原虫MSP1 C端编码基因pGEX-4T-2／PvMsP1C表达质粒，诱导表达了GST-PvMSP1C融合蛋白，表达蛋白具有一定免疫活性。     

日本血吸虫（中国大陆株）Sj16基因的原核表达

目的 进一步研究日本血吸虫（中国大陆株）Sj16的免疫调节功能,丰富有关血吸虫免疫逃避知识。方法 根据曼氏血吸虫Sm16基因已知序列设计合成一对引物,用PCR技术从日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA文库中扩增Sj16基因,将Sj16基因定向克隆入pGEX-4T-1,转化感受态BL21/DE3菌;用酶切、PCR扩增鉴定筛选得到的重组阳性克隆,IPTG诱导pGEX-4T-1-Sj16转化的BL21/DE3菌,用SDS-PAGE和Wester-blot分析表达产物。结果 从日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA文库中获取Sj16基因,重组质粒中含有Sj16基因,成功构建日本血吸虫（中国大陆株）Sj16基因原核表达重组质粒pGEX-4T-1-Sj16,pGEX-4T-1-Sj16转化的BL21/DE3菌经IPTG诱导可表达与GST融合的蛋白（约40kDa）,抗GST抗体能特异性识别该蛋白。结论 成功原核表达了Sj16蛋白,为深入研究Sj16的免疫调节功能,丰富有关血吸虫免疫逃避知识打下了基础。     

刚地弓形虫Peroxiredoxin基因的克隆及其融合蛋白的高效表达和纯化

目的克隆刚地弓形虫Prx基因,用IPTG诱导表达Prx融合蛋白并进行纯化。方法用PCR扩增目的基因片段并克隆至pGEX-6P-1载体,构建pGEX-6p-1/TgPrx原核表达载体;IPTG诱导表达Prx融合蛋白,表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析,GST亲和层析纯化融合蛋白。结果从弓形虫RH株DNA中扩增Prx基因,成功构建了弓形虫重组质粒pGEX-6p-1/TgPrx,并在大肠埃希菌(E.coli)中得到高效表达,表达的融合蛋白分子质量为51ku,该蛋白可被鼠抗弓形虫血清特异性识别。结论原核表达具有生物学活性的弓形虫重组Prx蛋白(rTgPrx),该蛋白有望用于弓形虫病免疫学检测。     

阴道毛滴虫14-3-3基因的克隆、表达及鉴定

目的克隆阴道毛滴虫14-3-3基因并进行原核表达。方法根据阴道毛滴虫14-3-3基因序列设计特异性引物,以阴道毛滴虫cDNA为模板通过PCR扩增获得目的片段,与pMD-18-T连接,构建克隆载体pMD-Tv-14-3-3,经双酶切后回收目的片段,进行测序鉴定,然后与表达载体pGEX-T连接,构建原核表达载体pGEX-T-Tv-14-3-3,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过SDS-PAGE及Western blot鉴定表达产物。结果成功构建了阴道毛滴虫14-3-3基因原核表达载体pGEX-T-Tv-14-3-3;SDS-PAGE电泳检测显示,在IPTG诱导下,阳性菌高效表达分子质量单位为27ku的蛋白质;Western blot显示表达产物可被抗阴道毛滴虫多克隆血清识别。结论成功构建了阴道毛滴虫14-3-3基因原核表达载体,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中高效表达。     

结核分枝杆菌重组质粒pGEX-ESAT-6构建及其在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达效率的研究

目的构建结核分枝杆菌（MTB）重组质粒pGEX-ESAT-6，分析ESAT-6抗原在大肠埃希菌BL21（DE3）中的表达效率。方法以结核分枝杆菌H37Rv标准株基因组DNA为模板，通过PCR扩增得到ESAT-6抗原编码基因；将该基因定向克隆于含有谷胱甘肽-S-转移酶（GST）基因的高效原核表达载体pGEX-1λT，经酶切鉴定后以IPTG诱导表达ESAT-6／GST融合蛋白；SDS—PAGE及Western blot对表达产物进行鉴定。结果PCR扩增出288bp的ESAT-6基因；双酶切证实ESAT6基因成功插入pGEX-1λT中，构建了pGEX—ESAT-6穿梭表达载体。SDS—PAGE分析重组质粒pGEX-ESAT-6表达产物的分子质量单位为35ku，表达效率为20％，Western blot检测该蛋白能被活动性结核病人血清特异识别。结论结核分枝杆菌重组质粒pGEX-ESAT-6在大肠埃希菌中获得了高效融合表达，表达的ESAT-6重组蛋白具有抗原特异性。     

弓形虫关键粘附蛋白在大肠埃希菌BL21（DE3）中的表达

目的通过cDNA文库筛选出弓形虫关键粘附蛋白基因一棒状体ROP2基因,在大肠埃希菌BL21（DE3）中表达,以获得重组蛋白。方法根据弓形虫棒状体ROP2基因开放阅读框设计引物,以弓形虫cDNA为模板进行PCR,纯化扩增产物经双酶切,进行TA克隆,再克隆到pET-30a中。重组质粒pET-30a—top2经PCR鉴定后,转化到大肠埃希菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导表达,用SDS—PAGE电泳鉴定表达产物。结果获得的1223bp的基因片段经PCR和酶切鉴定后与预期大小一致;SDS—PAGE电泳分析显示诱导菌在52ku处出现一条明显的蛋白带,与预期分子量相符。结论成功构建PET30a—ROP2,并在大肠埃希菌BL21（DE3）中高效表达,为进一步研究弓形虫粘附关键蛋白基因与肠上皮细胞的关系奠定基础。     

粉尘螨Ⅱ类抗原cDNA原核表达质粒的构建与表达

目的构建粉尘螨Ⅱ类抗原cDNA基因的重组表达质粒，并在大肠埃希菌中表达。方法采用亚克隆技术，用Sac Ⅰ和Not Ⅰ从重组质粒pMD-18T-Der f2上切下Der f2 cDNA片段，插入表达载体pET-32a( )质粒，转化大肠埃希菌BL21，在含氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性重组子，并经双酶切及PCR扩增鉴定。重组质粒pET-32a( )-Der f2转化大肠埃希菌，IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE电泳和薄层凝胶扫描定量分析。结果对重组质粒进行酶切和PCR鉴定，获得455bp大小的目的基因片段，与预期结果相符，证明已成功构建携带Der f2基因的重组原核表达质粒pET-32a( )-Der f2。核酸序列测定及同源性分析证实，所构建的原核表达质粒pET-32a( )-Der f2中所含的Der f2 cDNA片段与GenBank中的Der f2序列同源性达到100％。Der f2 cDNA在大肠埃希菌诱导表达后获得分子质量单位为34ku的蛋白，蛋白含量占菌体蛋白含量的16％。结论成功构建了粉尘螨Ⅱ类抗原cDNA基因的重组表达质粒pET-32a( )-Der f2，并在大肠埃希菌中获得高效表达，为获得重组纯化Der f2变应原并用于尘螨变应性疾病的诊治奠定基础。     

家蝇天蚕素Cec4的原核表达与纯化北大核心CSCD

目的构建家蝇天蚕素(Cecropin)Cec4原核表达质粒,表达及纯化Cec4蛋白。方法从家蝇cDNA文库中筛选家蝇天蚕素基因Cec4,设计并合成特异性引物,PCR扩增Cec4基因,连接克隆载体后转入DH5α感受态细胞,通过重组子鉴定及测序完成目的基因的克隆。用限制性内切酶BamHI和HindⅢ双酶切目的基因和质粒,构建GST表达载体pGEX 4T-1-Cec4,转化到大肠埃希菌BL-21中,利用IPTG诱导表达重组Cec4蛋白,经亲和层析纯化后进行SDS-PAGE电泳分析。结果 PCR扩增获得的Cec4基因全长为192 bp,连接到表达载体pGEX 4T-1获得重组质粒pGEX 4T-1-Cec4,转化大肠埃希菌BL-21后经30℃、0.6 mmol/L的IPTG诱导18 h,表达相对分子质量约为26×10~3上清表达的融合蛋白,亲和层析纯化后的蛋白浓度为0.117 mg/ml。结论成功构建重组质粒pGEX 4T-1-Cec4并表达和纯化获得Cec4蛋白,为其进一步研究奠定了实验基础。