端粒酶hTERT mRNA在乳腺癌中的表达及与c-myc相关性分析

目的 探讨人乳腺癌中原癌基因c-myc与hTERT mRNA表达的关系.方法 收集癌旁正常乳腺组织、导管原位癌、浸润性导管癌各12、18和25例,用原位杂交法检测hTERT mRNA表达,并用免疫组织化学法检测乳腺导管癌c-myc表达.结果 ①hTERT mRNA在癌旁正常乳腺组织中未见表达,在导管原位癌、浸润癌中的阳性率分别为83.33%和88.00%,后两组hTERT mRNA表达明显高于正常组;②hTERT mRNA表达与浸润性导管癌肿块大小及淋巴结转移与否无相关性（P＞0.05）;③43例乳腺导管癌中hTERT mRNA与c-myc表达呈正相关（γ=0.388 4,P＜0.05）.结论 端粒酶hTERT的表达可能在乳腺导管癌的组织发生中起关键作用,c-myc的过度表达可能与乳腺导管癌hTERT基因转录激活有关.     

Bim蛋白在乳腺癌中的表达及其临床意义

目的研究Bim蛋白在乳腺正常组织、乳腺普通导管增生组织、乳腺导管轻中度不典型增生组织、重度不典型增生及导管原位癌组织、乳腺浸润性导管癌组织中的表达及意义。方法应用免疫组织化学S-P法检测101例乳腺石蜡包埋组织中Bim蛋白的表达。结果在乳腺普通导管增生、轻中度不典型增生、重度不典型增生及导管原位癌和浸润性导管癌中,Bim蛋白表达阳性率呈递减趋势。Bim蛋白在乳腺普通导管增生与重度不典型增生及原位癌组间、重度不典型增生及原位癌和浸润性导管癌组间阳性表达率差异均具有统计学意义(P均<0.05)。乳腺浸润性导管癌中Bim蛋白的表达与患者的临床分期、腋窝淋巴结转移无明显关系,但与组织学分级有关(P<0.05)。结论Bim蛋白表达水平的改变可能与乳腺癌的发生发展有关。     

乳腺癌和乳腺不典型增生中细胞凋亡及相关基因蛋白产物的表达

目的探讨Fas及Bcl-2对乳腺浸润性导管癌中细胞凋亡的作用。方法用免疫组化ABC法检测62例乳腺浸润性导管癌及56例乳腺不典型增生中Fas及Bcl-2的表达,TUNAL法检测细胞凋亡的发生。结果乳腺浸润性导管癌与乳腺不典型增生组织相比,细胞凋亡率显著降低,并且Fas表达减弱,而Bcl-2表达增强,均有统计学差异（P〈0．05）,相关分析显示细胞凋亡率与Fas表达呈正相关（r=.．62,P〈O．05）,与Bcl-2表达呈负相关（r=-0．56。P〈0．05）。结论乳腺癌和乳腺不典型增生组织均可发生细胞凋亡,Fas及Bcl-2基因参与乳腺癌的发生和发展。     

Notch1基因单核苷酸多态性与乳腺癌和增生性病变的相关性研究

目的：探讨Notch1基因单核苷酸多态性位点rs3124591与乳腺浸润性导管癌及乳腺导管内增生性病变的相关性。方法：采用MALDI-TOF MS方法对乳腺浸润性导管癌（IDC,n=100）、乳腺导管原位癌（DCIS,n=50）、乳腺普通型导管增生症（UDH,n=100）、以及乳腺癌旁非癌组织（BH,n=100）进行Notch1基因多态性的检测。结果：Notch1基因rs3124591位点基因型和等位基因频率在乳腺4组不同病变中均无显著性差异（P〉0.05）,并且与乳腺癌患者患病年龄、TNM分期、分化程度、转移程度等病理学特征无显著性差异（P〉0.05）,基因型频率在ER、PR（＋）患者分布频率分别为23.4%、2.1%、4.3%,在ER、PR（-）患者分布频率分别为41.5%、23.4%、5.3%,分布频率在ER、PR（＋）〈ER、PR（-）,两者之间差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：在乳腺4组不同病变中存在Notch1基因多态性,但与乳腺浸润性导管癌发生发展无关联,这表明原癌基因Notch1的低甲基化可能是导致其蛋白表达改变的原因,这在乳腺癌的发生和发展中可能具有重要意义。     

PARP-1在非典型增生乳腺组织中的表达及意义

目的 探讨聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1(PARP-1)在女性乳腺癌与各种乳腺增生性病变组织中的表达及临床意义.方法 乳腺手术后经病理学诊断证实的乳腺非典型增生78例(其中轻度非典型增生28例、中度非典型增生30例、重度非典型增生20例),另选乳腺普通型增生19例、乳腺原位癌10例、乳腺浸润性导管癌21例做为对照.用免疫组化S-P法检测PARP-1的表达.结果 在乳腺普通型增生、轻、中、重度非典型增生、原位癌和乳腺浸润性导管癌组织中,PARP-1表达的阳性率分别为26.3%、28.5%、66.7%、75.0%、80.0%和95.0%.乳腺普通型增生和轻度非典型增生与乳腺原位癌及浸润性导管癌组织中PARP-1的阳性表达率有统计学差异.中、重度非典型增生组织中PARP-1的阳性表达率与乳腺原位癌及浸润性导管癌组织差异无统计学意义.随着非典型增生程度的加重,PARP-1的阳性表达率升高,且表达强度也逐级增高.结论 对乳腺增生性疾病行PARP-1检测有利于早期发现乳腺癌.可以根据PARP-1的检测结果判断病变向乳腺癌发展的风险性.PARP-1抑制剂可能会对乳腺增生性疾病的治疗起一定的作用.     

乳腺导管不典型增生及早期乳腺导管癌的临床病理研究

目的:解析乳腺导管不典型增生及早期乳腺导管癌造影表现与病理基础,以期能够为临床诊疗工作的开展提供凭据,最终优化乳腺癌患者生存质量.方法:选择:2010年4月~2016年12月期间我院收诊的,临床表征为乳腺导管不典型增生,同时已经进行过手术治疗、病理诊断为早期乳腺导管癌患者30例,应用回顾性分析方法观察患者乳腺导管影像学表现,继而与病理结果比较分析.结果:30例患者中,导管原位癌9例;浸润性导管癌8例;导管原位癌合并早期浸润7例;复合型癌2例,其中导管原位癌合并浸润性小叶癌2例,浸润性导管癌合并浸润性小叶癌1例;导管内乳头状瘤病癌变1例,其中乳腺X线平片没有发现异常4例,毛刺或分叶状肿块7例,肿块伴钙化6例,多形性钙化灶8例.早期乳腺导管造影主要表现如下:乳腺规格增大、乳房出现硬结、淋巴结增大,乳腺疼痛,尤其是在月经来潮前加重,经后疼痛逐渐减轻或消失,疼痛位置多数位于乳腺外上端,也可呈双乳腺弥漫性胀痛.在本次研究中乳腺导管造影诊断乳腺癌的符合率为86.7%.结论:乳腺导管造影可以被视为乳腺导管不典型增生及早期乳腺导管癌诊断的一种安全性、可靠性手段,定性与定位价值已经得到医学界的肯定,特别是对临床触诊阴性的早期乳腺癌能作出较精确的诊断结果,大幅度提高了早期乳腺癌的检出率,在临床上具有推广与应用价值.     

磁共振表观扩散系数等在乳腺导管原位癌中的应用

目的研究磁共振弥散序列表观扩散系数等在乳腺导管原位癌中的应用。方法比较26例乳腺导管原位癌与30例浸润性导管癌的ADC值等磁共振影像特点诊断特点,探讨ADC值等在乳腺导管原位癌诊断鉴别中的意义。结果导管原位癌的ADC值高于浸润性导管癌,低于正常腺体组织,导管原位癌与浸润性导管癌在达峰时间、第1分钟早期强化率方面差异无统计学意义(P0.05)。结论 ADC值有助于导管原位癌与浸润性导管癌的鉴别。     

miR-21在乳腺癌患者血清中的表达及意义

目的检测乳腺浸润性导管癌患者血清miR-21的表达水平并探讨其临床意义。方法选取自2012年3月-2013年7月于笔者医院就诊乳腺疾病女性患者共49例作为研究对象,其中乳腺良性肿瘤组23例,乳腺浸润性导管癌组26例（I期9例、Ⅱ期11例、Ⅲ期6例）,应用实时荧光定量（qRT）-PCR检测血清中miR-21的表达水平,并分析血清miR-21的表达与乳腺浸润性导管癌临床病理因素之间的关系。结果乳腺浸润性导管癌组检测的血清miR-21浓度明显高于乳腺良性肿瘤组,血清miR-21的表达增高与TNM分期、淋巴结转移呈正相关。结论血清miR-21在乳腺癌患者血清呈高表达,并与其病理学分级、淋巴结转移密切相关。     

中心体α、γ-微管蛋白在乳腺癌前病变及乳腺癌中的表达及其意义初探

目的 探讨中心体α-微管蛋白和γ-微管蛋白在人乳腺癌前病变和乳腺癌中的表达及其在乳腺癌发生发展过程中的作用。方法 采用免疫组织化学S-P法检测乳腺导管上皮不典型增生、乳腺导管内癌和浸润性导管癌各40例中中心体α-微管蛋白和γ-微管蛋白表达水平，30例正常乳腺组织作为对照组，并用Western印迹进行验证。所得数据经统计学分析并结合随访情况进行评价。结果 不同样本组α-微管蛋白、γ-微管蛋白表达水平不同（P=0．000），随正常上皮组织到出现不典型增生至进展为原位癌和浸润性癌的发展变化，α-微管蛋白、γ-微管蛋白表达量呈增高趋势，以浸润性癌为最高（40例中分别有14例、11例表达为＋＋＋），各组问差异均有统计学意义（P=0．001）。比较同例和同组α、γ-微管蛋白的表达程度差异无统计学意义（P〉0．05）。癌前病变、导管内癌、浸润性导管癌组α、γ-微管蛋白的表达水平与预后具有相关性。结论 中心体异常为乳腺癌细胞恶性表型的明显特征之一，并可能为乳腺癌形成过程中的早期事件。α、γ-微管蛋白的表达情况可为乳腺癌发生机制探讨、高危病例筛选及估测预后提供一种新的途径。     

Claudin-1在乳腺良性上皮增生及乳腺癌组织中的表达及意义

目的探讨Claudin-1在乳腺癌发生发展中的作用及其诊断价值。方法用免疫组化sP法检测22例普通型导管增生（UDH）、19例非典型性导管增生（ADH）、15例乳腺导管原位癌（DCIS）、12例无淋巴结转移的浸润性导管癌（IDC）、16例有淋巴结转移的IDC组织中Claudin-1的表达情况。结果Claudin-1主要表达于乳腺上皮细胞,表达模式为细胞膜／浆型;与UDH组和ADH组比较,Claudin-1在DCIS和无淋巴结转移及有淋巴结转移的IDC组中的表达显著降低或消失（P〈0．01）。结论在普通型导管增生-非典型性导管增生-乳腺癌的发生发展过程中,Claudin-1的表达逐渐减弱并消失;Claudin-1可用于乳腺良性上皮增生与乳腺癌的鉴别,但不能用于区别UDH和ADH;Claudin-1可作为乳腺癌诊断的一种标记物。     

人胎胃成纤维细胞hTERT和端粒酶的表达

目的：检测人胎胃成纤维细胞人端粒酶逆转录酶（hT ERT ）和端粒酶表达。方法分离培养人胎胃成纤维细胞,细胞角蛋白（CK）‐18免疫染色排除上皮细胞;免疫细胞化学方法检测hTERT表达;端粒重复序列扩增法（TRAP）检测端粒酶活性,成人胃成纤维细胞作阳性对照。结果分离的人胎胃成纤维细胞CK‐18免疫染色阴性;原位监测其胞质和胞核中均可见细颗粒状免疫荧光;端粒酶延伸片断长度约为170 bp ,稍长于成人胃成纤维细胞。结论人胎胃成纤维细胞表达hT ERT和端粒酶。     

负载hTERT复制缺陷型腺病毒的包装及鉴定

目的:构建负载人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的复制缺陷型腺病毒.方法:将克隆有正义hTERTcDNA的腺病毒穿梭质粒pDC315-hTERT与腺病毒包装质粒pBHGlox-DeltaE1,3Cre共转染人胚肾293细胞(HEK293),包装负载hTERT基因的复制缺陷型腺病毒表达载体(Ad-hTERT).对Ad-hTERT扩增、纯化并浓缩后,进一步行感染性鉴定、电镜鉴定及双引物PCR鉴定.结果:纯化浓缩后的Ad-hTERT滴度可达5×1012pfu/L.电镜下可见在HEK293细胞中形成的病毒颗粒,PCR双引物鉴定Ad-hTERT可扩增出Ad及hTERT特异片段,而对照则不能扩出hTERT片段.结论:成功构建了负载hTERT基因的复制缺陷型腺病毒.     

负载hTERT基因片段的慢病毒的包装及表达

目的构建编码人端粒酶逆转录酶（hTERT）的慢病毒载体，并测定其滴度，观察hTERT 基因在体外的表达情况。方法采用RT-PCR获得hTERT基因片段，插入转移载体L166，用CaCl2法L166-hTERT、L205、L311共转染293T细胞包装慢病毒，测定病毒滴度，免疫细胞化学法检测慢病毒感染的293T细胞中hTERT的表达。结果测序结果显示成功构建了重组质粒L166-hTERT，测定未经浓缩的病毒滴度为5.25×106IU/mL，免疫细胞化学法检测到慢病毒感染的293T细胞中hTERT呈阳性表达。结论成功构建了负载hTERT基因片段的慢病毒，hTERT能在感染的293T细胞中高效表达，表达持续2个月以上。     

人端粒酶催化亚单位基因正反义腺病毒表达载体的构建及鉴定

目的: 构建hTERT正义和反义腺病毒表达载体. 方法: 用EcoRⅠ从pGRN145质粒上切下约3.5 kb的人端粒酶全长cDNA片段,然后连入pDC315质粒的EcoRⅠ酶切位点上,经BamHⅠ酶切鉴定出正义和反义表达载体,并对正反义重组质粒进一步测序鉴定其方向. 结果: 经BamHⅠ酶切后,正义质粒形成1.0 6.4 kb两条带. 反义重组质粒为1.0 2.5 3.9 kb三条带,与理论计算值完全一致,测序结果进一步确认了方向的正确性. 结论: 成功构建了hTERT的正、反义腺病毒表达载体.     

正、反义hTERT基因真核表达载体的构建与鉴定

目的构建正、反义hTERT基因真核表达载体,为进一步研究端粒酶的活性调节与恶性肿瘤基因治疗作准备。方法根据已发表在Genebank的hTERT cDNA序列,设计并合成了1对两端带特定限制性酶切位点引物,提取子宫颈癌HeLa细胞株总RNA,进行RT-PCR,并将扩增产物TA首先克隆至pGEMR-T载体,然后双酶切pGEM-T载体回收目的片段再克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(±)中,并对重组体进行酶切鉴定和测序分析。结果PCR扩增片段与预期结果相符,双酶切证实构建的正、反义hTERT基因真核表达载体克隆成功,插入片段测序结果与Genebank的hTERT cDNA的部分序列完全一致。结论成功地构建了正、反义hTERT基因真核表达载体,为下一步研究端粒酶的活性调节与恶性肿瘤基因治疗打下了实验基础。     

人端粒酶逆转录酶在膀胱肿瘤中的表达及其与预后的关系

目的检测人端粒酶逆转录酶(hTERT)在膀胱肿瘤中的定量表达,探讨hTERT与膀胱肿瘤预后复发的关系。方法采用免疫组织化学法和高清晰彩色医学图文分析系统,对45例膀胱移行细胞癌(BTCC)组织标本中的hTERT的表达情况进行定量检测,并用13例正常膀胱组织标本作为对照。结果BTCC组织标本中均可见有hTERT的表达,正常膀胱组织中无表达。hTERT的表达强度与患者的性别、年龄、肿瘤的大小、部位以及肿瘤的单多发等情况无关(P>0.05),而与肿瘤复发有关(P<0.05)。结论hTERT在膀胱肿瘤中表达上调,其活性与预后相关,可以作为检测肿瘤复发的指标。     

人乳腺癌中端粒酶结构表达的研究

目的研究人端粒酶逆转录酶(hTERT)、人端粒酶RNA亚基(hTR)和预后指标包括肿瘤的大小、分级、结节状态和患者年龄间的联系。方法RT-PCR检测92例人乳腺恶性肿瘤和10例良性肿瘤的hTERT和hTR的表达。结果hTR和hTERT的表达分别为62例(67.4%)和76例(82.6%),与<40岁的人群比较,>40岁的人群hTR表达更显著,良性肿瘤中没有1例表达hTR,6例表达hTERT。hTR和hTERT的表达与肿瘤的分级、分期、淋巴结转移和病理分型呈显著相关,与肿瘤大小没有相关性,在76例hTERT阳性的患者中,均有不同程度的hTR表达阴性,在hTR阳性的患者中没有hTERT阴性。结论hTERT和hTR的表达同乳腺癌具有相关性;hTR比hTERT更能反映乳腺癌的发生情况。     

胸腔积液脱落细胞端粒酶逆转录酶mRNA检测及其意义

目的:通过检测良、恶性胸腔积液脱落细胞端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的表达情况,探讨其在良、恶性胸腔积液中的诊断价值。方法:采用逆转录-多聚酶链反应法检测39例恶性胸腔积液、16例良性胸腔积液中hTERT基因的表达情况。结果:恶性胸腔积液中hTERT基因的表达率明显高于良性胸腔积液(P<0.05)。检测hTERT基因表达对恶性胸腔积液的敏感性、特异性和诊断符合率分别为87.18%,81.25%和85.45%。结论:hTERT基因参与了恶性胸腔积液的发生、发展过程。采用RT-PCR法检测胸腔积液中hTERT基因表达有助于临床上良、恶性胸腔积液的鉴别诊断。     

携带hTERT-P2A-EGFP基因真核表达质粒的构建和鉴定

目的：构建真核表达质粒hTERT-P2A-EGFP,探讨其在HEK293FT细胞中的表达和转染效率。方法：利用pBABE-puro-hTERT和pRRLSIN-cPPT-MSCV-EGFP质粒构建重组质粒。以该质粒为模板采用PCR法获取hTERT、P2A和EGFP基因,采用重叠PCR法获得目的片段hTERT-P2A-EGFP,经酶切后目的片段与真核表达载体pRRLSIN-cPPT-MSCV-EGFP连接,得到并鉴定含有hTERT-P2A-EGFP基因的重组质粒。经脂质体介导重组质粒转染到HEK293FT细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白（GFP）在细胞中的表达。结果：PCR检测目的基因hTERT、P2A和EGFP的片段长度分别为3400、110和720 bp。酶切后目的基因片段hTERT-P2A-EGFP约4300 bp。测序分析,目的基因1547位点发生了突变。利用定点突变技术成功诱变,再次测序后目的基因序列与 GenBank 公布的基因序列完全一致。重组质粒转染HEK293FT细胞后在荧光显微镜下可以观察到GFP。流式细胞术检测,重组质粒转染HEK293FT细胞的效率为44.8%。结论：成功构建携带目的基因hTERT-P2A-EGFP的重组质粒,且可用于细胞转染。